本發(fā)明屬于生物基因工程，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌來源降解鄰苯二甲酸酯的羧酸酯酶carb152及基因，以及其在高溫條件下催化水解鄰苯二甲酸酯的應用。

背景技術：

1、鄰苯二甲酸酯(phthalate?esters，paes)是常見的塑料添加劑，可以增強塑料制品的柔韌性和可塑性。paes添加到塑料中，以非共價鍵的方式與塑料的骨架相互作用，因而易于隨著塑料的使用和丟棄逸散到環(huán)境里。統(tǒng)計表明paes年產量達到六百萬噸，其中過半數(shù)隨著塑料制品的丟棄擴散到環(huán)境中，部分地表水源中paes濃度高達500mg/l。植物生長過程對paes有富集作用，且能夠積累在體內。研究前期對全國范圍的糧食作物包括小麥、大米、玉米和高粱的檢測，發(fā)現(xiàn)普遍含有paes。食品常規(guī)加工過程并不能消除paes，如以植物基作為原料發(fā)酵生產的白酒、食醋和茶中普遍檢出paes，導致paes的食源性人體攝入難以避免。paes具有類似雌激素的作用，干擾免疫反應，引起神經(jīng)心理疾病,造成生殖毒性和脂質代謝異常，并誘發(fā)兒童肥胖病。歐盟食品安全局評估人體耐受不同種類paes攝入的限量均低于50μg/(kg·d)。然而由于paes污染的普遍性和經(jīng)由食物鏈富集的應然性，paes潛在的人體危害極為巨大。因此，paes污染的有效處理，不僅有助于保護生態(tài)環(huán)境和人體健康，還能推動可持續(xù)發(fā)展，符合社會和經(jīng)濟的長遠利益。

2、paes非常穩(wěn)定，自然降解周期數(shù)十到數(shù)千年不等。鑒于對人體健康的嚴重危害，paes的有效處理獲得研究的關注，已有處理方法包括物理吸附、化學降解、物理吸附耦合化學催化降解，以及光介導的催化降解等。上述方法雖有效但存在成本高、易產生二次污染等問題。微生物酶法水解paes以條件溫和、效率高、副產物少和環(huán)境友好等特點成為處理paes的綠色方法。然而，在實際應用中，工業(yè)廢水(如印染加工廢水)或生物處理系統(tǒng)(如堆肥)溫度常達60-80℃。因此，挖掘能在高溫條件下水解paes的酶是切合實際處理條件，實現(xiàn)工業(yè)綠色轉型的關鍵技術方向。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌來源降解鄰苯二甲酸酯的羧酸酯酶carb152及其基因，以及該酶在催化降解鄰苯二甲酸酯中的應用。

2、本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶carb152，具有催化水解鄰苯二甲酸酯的性能，所述羧酸酯酶carb152的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、本發(fā)明還提供了一種含有上述枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶carb152編碼基因的大腸桿菌表達載體，所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶carb152，是通過宏基因組數(shù)據(jù)庫img/m，以目前文獻報道的水解效率最高的iii型鄰苯二甲酸酯降解酶paeiiiase序列為探針，基于序列相似度比對挖掘獲得，經(jīng)催化動力學參數(shù)預測網(wǎng)站預測動力學參數(shù)kcat和km，繼而通過全基因序列合成獲得酶的編碼序列，構建大腸桿菌異源表達工程菌，誘導表達所獲得的酶用于催化降解鄰苯二甲酸酯。

5、攜帶羧酸酯酶carb152大腸桿菌工程菌株的構建方法：北京博益華大生物基因科技有限公司全基因合成平臺合成序列，使用ndei/xhoi酶切位點將基因整合到pet-28a(+)表達載體上。經(jīng)測序驗證后，將此質粒通過化學轉化法轉化到大腸桿菌bl21(de3)中，通過iptg誘導表達，獲得攜帶羧酸酯酶carb152的大腸桿菌細胞。破碎細胞獲得粗酶液，純化后的酶催化水解底物鄰苯二甲酸酯，經(jīng)氣相色譜檢測底物的降解。

6、本發(fā)明所述羧酸酯酶carb152，可通過大腸桿菌工程菌誘導表達獲得，用于催化水解鄰苯二甲酸酯。

7、實驗證實：經(jīng)大腸桿菌工程菌誘導表達純化后的羧酸酯酶carb152，在高溫條件(60-70℃)條件下10min內可水解鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl?phthalate，dibp)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl?phthalate，dbp)和鄰苯二甲酸雙(2-乙基己)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate，dehp)(其中每種底物濃度均為200mg/l)，水解量分別為：25.46±2.42mg/l、28.04±5.28mg/l、20.26±7.31mg/l。

8、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用生物基因工程技術，克隆并誘導表達獲得羧酸酯酶carb152及其編碼基因，并構建含有羧酸酯酶carb152編碼基因的大腸桿菌表達質粒，將該質粒轉入大腸桿菌中，經(jīng)過誘導表達獲得該酶，并經(jīng)催化體系驗證具有催化水解鄰苯二甲酸酯的能力。本發(fā)明率先報道羧酸酯酶carb152可用于高溫條件(60-70℃)水解鄰苯二甲酸酯。

技術特征：

1.一種枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶carb152及其基因，其特征在于：所述羧酸酯酶carb152的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述羧酸酯酶carb152編碼基因的dna序列如seq?id?no.2所示；所述羧酸酯酶carb152為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。

2.一種含有權利要求1所述基因的大腸桿菌表達載體，其特征在于：所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種由權利要求1所述的羧酸酯酶carb152應用在60-70℃催化水解鄰苯二甲酸酯。

技術總結
本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌來源高溫條件降解鄰苯二甲酸酯的羧酸酯酶CarB152、編碼基因及其應用。所述羧酸酯酶CarB152的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。具體公開枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶CarB152編碼基因及攜帶所述基因的大腸桿菌表達載體的構建，同時還公開了所述枯草芽孢桿菌來源羧酸酯酶CarB152水解鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸雙(2?乙基己)酯的應用。本發(fā)明率先提供了一種可在高溫條件(60?70℃)催化降解鄰苯二甲酸酯的羧酸酯酶CarB152及其編碼基因。

技術研發(fā)人員：徐友強,賴鯨慧,張欣悅,代夢琦,趙蕾,宗恩祥,牛思遠
受保護的技術使用者：北京工商大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/15