本發(fā)明屬于工業(yè)生物，尤其是一種改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)菌株的方法、ybba基因與應用。該方法包括利用能夠促進dnj生物合成的ybba基因，以及與該基因相關的生物材料、菌株、具體的實施步驟和應用方式。

背景技術：

1、1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，簡稱dnj，分子式為c6h13no4，分子量為163.2）作為天然來源的哌啶類亞氨基糖生物堿，因其獨特的羥基結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出多重藥理效應。該化合物最初由inoue團隊在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)，其前體經(jīng)氫化生成，在酸性條件下可與鹽酸形成高水溶性鹽。dnj憑借與葡萄糖相似的空間構(gòu)象，通過競爭性結(jié)合α-葡萄糖苷酶活性位點，顯著抑制糖類水解，這一特性使其在糖尿病管理及病毒性疾病防治中具有重要價值。

2、盡管淡紫色鏈霉菌、紫紅曲霉等微生物具備dnj合成能力，但現(xiàn)有報道中微生物作為生產(chǎn)者，普遍面臨發(fā)酵周期長、產(chǎn)物濃度低等產(chǎn)業(yè)化瓶頸。解淀粉芽孢桿菌作為重要生產(chǎn)菌株，其dnj合成路徑中gabt1、yktc1和gutb1基因已被明確功能，但現(xiàn)有改造策略仍局限于這三個已知的基因，導致產(chǎn)量提升空間受限。因此，深入進行基因鑒定研究，發(fā)掘更多潛在的改造位點，對于拓寬dnj高產(chǎn)工程化改造的路徑至關重要。在已知的基因構(gòu)成的基因簇周圍，存在其他基因如ybba基因，其在dnj生物合成中的作用尚未明確，但可能同樣參與這一生物合成過程。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)菌株的方法、ybba基因與應用。

2、本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

3、一種具有提高1-脫氧野尻霉素生物合成效率功能的ybba基因，所述ybba基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、一種由如上所述的ybba基因編碼的具有提高1-脫氧野尻霉素生物合成效率功能的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、一種包含如上所述的ybba基因的用于提高1-脫氧野尻霉素的生物合成效率的表達盒，所述表達盒包含啟動子、所述ybba基因和終止子。

6、一種包含如上所述的ybba基因的用于提高1-脫氧野尻霉素的生物合成效率的載體，所述載體選自質(zhì)粒、病毒載體或人工染色體。

7、一種利用如上所述的ybba基因改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)菌株的方法的方法，所述方法包括將所述ybba基因、包含所述ybba基因的表達盒或包含所述ybba基因的載體導入解淀粉芽孢桿菌中。

8、進一步地，所述解淀粉芽孢桿菌為bacillus?amyloliquefaciens?lh-2，其名稱為：lh-2，分類名稱為：bacillus?amyloliquefaciens，保藏編號為：cgmcc?no.29550，保藏日期：2024年1月9日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

9、一種包含如上所述的ybba基因的改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)的解淀粉芽孢桿菌的重組菌株。

10、如上所述的重組菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

11、首先通過電轉(zhuǎn)化將含有ybba基因的過表達質(zhì)粒plh2388導入解淀粉芽孢桿菌lh-2感受態(tài)細胞中，利用含5?μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基篩選獲得初步轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子經(jīng)42?℃高溫傳代，每12小時轉(zhuǎn)接一次，共3次，誘導質(zhì)粒與基因組發(fā)生單交換，并通過pcr驗證確認整合；隨后進一步高溫傳代推動雙交換重組，涂布含25?μg/ml5-氟尿嘧啶的lb培養(yǎng)基篩選雙交換菌株，利用pcr檢測確認ybba基因過表達結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定整合；最終通過氯霉素敏感性測試篩選敏感型菌株，排除殘留質(zhì)粒，并經(jīng)測序驗證基因編輯準確性，獲得遺傳穩(wěn)定的ybba過表達重組菌株。

12、如上所述的重組菌株在1-脫氧野尻霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的應用。

13、利用如上所述的重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法，包括如下步驟：

14、從超低溫冰箱中取出保藏的重組菌株，在lb固體培養(yǎng)基上進行劃線接種，于37?°c下培養(yǎng)基12?h，長出單菌株；將菌的單菌落轉(zhuǎn)接到5?ml新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，于37?℃、200?r/min下培養(yǎng)12?h，進行種子培養(yǎng)；按接種量4?%?將培養(yǎng)好的菌的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37?°c、100?r/min?培養(yǎng)72?h，進行1-脫氧野尻霉素的發(fā)酵；

15、其中，所用發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：(nh4)2so4：4g/l，乳糖：25?g/l，k2hpo4：14?g/l，kh2po4：6?g/l，mgso4·7h2o：0.2?g/l，cacl2：0.15?g/l，mnso4·h2o：1.9?mg/l，fecl3·6h2o：37.8?mg/l，zncl2：7?mg/l，溶劑為水，ph7.0，121?℃滅菌20?min。

16、本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果為：

17、1、關鍵基因的突破性發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明首次鑒定并揭示了參與1-脫氧野尻霉素（1-dnj）生物合成的核心基因——ybba基因（核苷酸序列如seq?id?no.1所示），其編碼的蛋白質(zhì)具有特異性功能（氨基酸序列如seq?id?no.2所示）。本發(fā)明填補了dnj合成代謝路徑的關鍵空白，為解析微生物合成dnj的分子機制提供了全新視角，同時為后續(xù)基因工程改造奠定了分子基礎。

18、2、基因功能的系統(tǒng)性驗證：本發(fā)明通過基因敲除與過表達技術，明確ybba基因?qū)nj合成的決定性作用。ybba基因敲除菌株完全喪失dnj生產(chǎn)能力；回補ybba基因的工程菌株dnj產(chǎn)量較野生型提升50%，顯著優(yōu)于現(xiàn)有改造策略。該實驗數(shù)據(jù)首次從功能層面證實ybba基因是dnj生物合成的必需元件，為工業(yè)化高產(chǎn)菌株構(gòu)建提供了可靠靶點。

19、3、技術瓶頸的針對性突破：針對當前dnj生產(chǎn)中存在的產(chǎn)量低、遺傳改造靶點匱乏等核心問題，本發(fā)明提出創(chuàng)新解決方案。開發(fā)基于ybba基因的表達盒（含啟動子/終止子）及配套載體系統(tǒng)（質(zhì)粒載體）。建立解淀粉芽孢桿菌lh-2（cgmcc?no.29550）的基因工程改造方法，實現(xiàn)dnj合成能力的定向強化。

20、4、工業(yè)化應用的戰(zhàn)略價值：本發(fā)明可拓展至其他芽孢桿菌屬菌株，具備廣泛適用性。

21、5、本發(fā)明運用精準的基因敲除與回補技術，對解淀粉芽孢桿菌中的ybba基因進行了全面的功能解析。旨在闡明ybba基因在dnj生物合成中的確切作用，為開發(fā)新穎、高效的dnj生產(chǎn)策略提供科學依據(jù)和理論支撐。本發(fā)明的研究成果有望突破dnj產(chǎn)量提升的瓶頸，為工業(yè)生物技術領域的相關研究開辟新的路徑和方法。

技術特征：

1.一種具有提高1-脫氧野尻霉素生物合成效率功能的ybba基因，其特征在于：所述ybba基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種由如權(quán)利要求1所述的ybba基因編碼的具有提高1-脫氧野尻霉素生物合成效率功能的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種包含如權(quán)利要求1所述的ybba基因的用于提高1-脫氧野尻霉素的生物合成效率的表達盒，其特征在于：所述表達盒包含啟動子、所述ybba基因和終止子。

4.一種包含如權(quán)利要求1所述的ybba基因的用于提高1-脫氧野尻霉素的生物合成效率的載體，其特征在于：所述載體選自質(zhì)粒、病毒載體或人工染色體。

5.一種利用如權(quán)利要求1所述的ybba基因改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)菌株的方法的方法，其特征在于：所述方法包括將所述ybba基因、包含所述ybba基因的表達盒或包含所述ybba基因的載體導入解淀粉芽孢桿菌中。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢桿菌為bacillusamyloliquefaciens?lh-2，其名稱為：lh-2，分類名稱為：bacillus?amyloliquefaciens，保藏編號為：cgmcc?no.29550。

7.一種包含如權(quán)利要求1所述的ybba基因的改良1-脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)的解淀粉芽孢桿菌的重組菌株。

8.如權(quán)利要求7所述的重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

9.如權(quán)利要求7所述的重組菌株在1-脫氧野尻霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的應用。

10.利用如權(quán)利要求7所述的重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)1-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于：包括如下步驟：

技術總結(jié)
本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術領域，公開了一種改良1?脫氧野尻霉素生物生產(chǎn)菌株的方法、ybbA基因與應用，所述方法包括將所述ybbA基因、包含所述ybbA基因的表達盒或包含所述ybbA基因的載體導入解淀粉芽孢桿菌中。本發(fā)明運用精準的基因敲除與回補技術，對解淀粉芽孢桿菌中的ybbA基因進行了全面的功能解析。旨在闡明ybbA基因在DNJ生物合成中的確切作用，為開發(fā)新穎、高效的DNJ生產(chǎn)策略提供科學依據(jù)和理論支撐。本發(fā)明的研究成果有望突破DNJ產(chǎn)量提升的瓶頸，為工業(yè)生物技術領域的相關研究開辟新的路徑和方法。

技術研發(fā)人員：劉浩,張媛,劉蛟
受保護的技術使用者：天津科技大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/15