一種定點突變改造的基因工程酪氨酸酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性及最適作用溫度提高的酪氨酸酶突變體，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 酪氨酸酶（Tyrosinase, EC 1. 14. 18. 1)是一種含有雙銅離子的金屬酶。酪氨酸酶 是多功能酶，在氧氣的參與下可以催化單酚生成二元酚（一元酚酶活性）；催化二元酚生成 相應(yīng)的醌（二元酚酶活性）。而醌在經(jīng)過一系列酶催化及非酶催化的氧化還原反應(yīng)后最終 生成黑色素。酪氨酸酶廣泛的存在于動植物及微生物中。一般認為人類的毛發(fā)、眼睛、皮膚 上的顏色都是由酪氨酸酶決定的，因而大多數(shù)化妝品行業(yè)通過研宄酪氨酸酶酶抑制劑來開 發(fā)美白產(chǎn)品。人體內(nèi)如果酪氨酸酶代謝異常將會導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，例如白癜風和白 化病等。同時禽類的羽毛，及昆蟲甲殼的顏色也酪氨酸酶相關(guān)，它的產(chǎn)物黑色素可以與蛋白 交聯(lián)結(jié)合成堅硬的支架，起到保護作用。在植物體內(nèi)，酪氨酸酶可以催化生成一些對人體有 益的物質(zhì)，例如茶多酚。此外，水果表面受損時的褐變也與酪氨酸酶相關(guān)，食品行業(yè)研宄開 發(fā)酪氨酸酶抑制劑來保鮮水果。此外，酪氨酸酶在工業(yè)上也有重要的應(yīng)用。首先，酪氨酸 酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚類物質(zhì)，左旋多巴是效果良好的抗顛麻痹藥， 已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于臨床。此外，酪氨酸酶還可以用于制備生物傳感器，用來檢測環(huán)境中酚 類化合物的濃度。由于工業(yè)污染，導(dǎo)致大量的酚類化合物被排放到自然環(huán)境中（主要是水 源），導(dǎo)致嚴重的污染，而大部分酚類化合物對人體有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的廣 譜性，大部分的酚類化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶還可以被用來清除污染 環(huán)境中的酚類化合物。當然，酪氨酸酶還以用來制備黑色素。
[0003] 黑色素廣泛存在于動植物和微生物中，與生物自我保護機制有關(guān)。有研宄表明， 天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合陽離子（例如有毒的重金屬）、新型 的藥物載體、作為治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如著色性干皮病、帕金森 氏癥、老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等，有報道指出，可溶性的黑色素在體外具有抗HIV的 活性，為治療艾滋病開辟了一個新途徑。目前黑色素生產(chǎn)主要為動植物提取和采用化學法 以酪氨酸為原料生產(chǎn)，這兩種方法成本高、工藝繁瑣，使黑色素因價格昂貴而限制其大規(guī)模 的生產(chǎn)與應(yīng)用。微生物所產(chǎn)的黑色素是由其體內(nèi)的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴類黑色 素，是氨基酸的衍生物，具有無毒、無害等特點，而且產(chǎn)黑色素的微生物種類繁多，生產(chǎn)工藝 簡單，易于操作，不受時間與地域的限制，因此用微生物來生產(chǎn)黑色素具有巨大的優(yōu)勢。
[0004] Streptomyces kathirae SC-I是本實驗室前期篩選獲得的一株高產(chǎn)黑色素菌株 (保藏編號為：CCTCC M 2012432,專利申請公布號：CN104403975A)，對 S.kathirae SC-I 發(fā) 酵產(chǎn)黑色素條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該菌株具有極高的黑色素生產(chǎn)潛力，但發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶的 穩(wěn)定性較低，導(dǎo)致黑色素發(fā)酵后勁不足，嚴重限制黑色素的產(chǎn)量。因此需要提高酪氨酸酶的 穩(wěn)定性。
[0005] 定點突變是提高酶穩(wěn)定性的重要手段之一。與其他提高酶穩(wěn)定性的策略相比，定 點突變更迅速，直接并且節(jié)約成本。而隨著生物信息學的發(fā)展，很多預(yù)測軟件被研宄開發(fā) 出來用來輔助定點突變，使定點突變得到正突變的效率明顯提高。本發(fā)明基于已得到的酪 氨酸酶在大腸桿菌中的表達平臺，利用以計算機模擬為基礎(chǔ)的定點突變技術(shù)，對酪氨酸酶 進行分子改造，獲得穩(wěn)定性顯著提高的酪氨酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，通過對酪氨酸酶進行分子改造，使改造后的酪氨酸酶在穩(wěn)定 性方面有所提高，最終應(yīng)用于黑色素的生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明提供了一種定點突變改造的酪氨酸酶突變體，有鏈霉菌Streptomyces kathirae SC-I酪氨酸酶基因出發(fā)，運用定點突變獲得，所述的酪氨酸酶突變體的氨基酸序 列為SEQ ID No. 1，該酪氨酸酶突變體是由SEQ ID No. 2的核苷酸系列所編碼。
[0008] 所述發(fā)生突變的氨基酸位于酪氨酸酶蛋白結(jié)構(gòu)的表面，所述突變可以增加蛋白表 面的靜電相互作用或增加蛋白疏水相互作用。
[0009] 所述的氨基酸發(fā)生突變的是酪氨酸酶第7位谷氨酰胺替換成賴氨酸、第234位甘 氨酸替換成脯氨酸，所得單突變體分別命名為Q7K、G234P。
[0010] 所述多個氨基酸發(fā)生突變包括：第7位谷氨酰胺替換成賴氨酸、第234位甘氨酸替 換成脯氨酸，所得單突變體分別命名為Q7K/G234P。
[0011] 本發(fā)明提供一種所述酪氨酸酶突變體的制備方法，具體步奏如下：
[0012] 1、將SEQ ID No. 2通過PCR的方法，以含有酪氨酸酶基因序列的pET-28aC2為 模板，獲得含有pET-28a(+)質(zhì)粒RBS序列的酪氨酸酶基因，并且克隆至已含有酪氨酸酶 金屬伴侶基因序列的質(zhì)粒pET-28aCl中，使酪氨酸酶金屬伴侶及酪氨酸酶各自攜帶有 pET-28a(+)的RBS序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28aClNC2 ;
[0013] 2、利用Swiss-Model軟件對親本酪氨酸酶進行模擬，獲得酪氨酸酶空間結(jié)構(gòu)；
[0014] 3、設(shè)計突變引物，通過反向PCR對酪氨酸酶基因序列進行定點突變，獲得含有突 變酪氨酸酶基因序列的重組載體；
[0015] 4、將突變后的重組載體熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，破細胞 后使用Ni-NTA進行蛋白純化獲得酪氨酸酶突變體。
[0016] 本發(fā)明提供的酪氨酸酶單突變體或組合突變體熱穩(wěn)定性均顯著提高，其中組合突 變體的最適作用溫度提高了 l〇°C，在60°C下的半衰期提高了 3倍。相對于采用篩菌或定向 進化等手段，縮短了酶學性質(zhì)的改造時間。將該酪氨酸酶體變體應(yīng)用于提高黑色素的產(chǎn)量 及其他相關(guān)應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0017] 具體實施方法
[0018] 實施例1酪氨酸酶突變位點的確定
[0019] 利用Swiss-Model軟件對親本酪氨酸酶進行模擬，獲得酪氨酸酶空間結(jié)構(gòu)為基 礎(chǔ)，利用POPMuSiC在線服務(wù)器計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（Λ AG) 來輔助設(shè)計提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性，選擇去折疊自由能變化顯著的氨基酸作為突變位