/L，蛋白腺3g/L)中，28°C，200rpm振蕩 培養(yǎng)4她；
[0094] 3)向步驟1)所得產油微生物培養(yǎng)基種接入步驟2)制備的產油微生物種子液，接種 量15%(v/v)，在28°C下通氣培養(yǎng)96h;
[00M] 4)終止發(fā)酵，此時發(fā)酵液中殘余葡萄糖、木糖和甘油濃度分別為0g/L、1.3g/L和 Og/L，最終得干菌體20.8g/L，油脂量11.7g/L，油脂含量56.3 % (w/w)。
[0096] 實施例12
[0097] 1)粗甘油和稻殼水解液混合物的制備：參照文獻（Zhang J，et al .Bioresour Technol，2011，102:4480-4488)，W稻殼為原料，干燥，粉碎過40目篩，并用2.5%的硫酸浸 潰18h，190°C蒸汽處理3min后，稀釋至料液比為10% (w/w)，調抑4.8;添加纖維素酶10FPU/ g，β-葡萄糖巧酶20CBU/g，木聚糖酶40U/g，調整pH至4.8，于水浴搖床中50°C、200巧m水解 72h，得水解液;真空抽濾得水解上清，上清中葡萄糖和木糖濃度分別為32g/L和19.2g/L，添 加粗甘油(廢餐飲油制備生物柴油過程的副產物)至終濃度為12.8g/L，得到產油微生物培 養(yǎng)基，C/N比35，調整抑至9.0后于121°C滅菌20min后備用；
[0098] 2)彎曲隱球酵母Cryptococ州S curvatus ATCC 20509(購自美國典型培養(yǎng)物保藏 中屯、）接種在種子培養(yǎng)基(甘油20g/L，酵母粉lOg/L，蛋白腺20g/L)中，25°C，200rpm振蕩培 養(yǎng)2她；
[0099] 3)向步驟1)所得產油微生物培養(yǎng)基中接入步驟2)制備的產油微生物種子液，接種 量2%(v/v)，在25°C下通氣培養(yǎng)96h;
[0100] 4)終止發(fā)酵，此時發(fā)酵液中未檢測到葡萄糖、木糖和甘油，最終得干菌體24. Ig/L， 油脂量11.8g/L，油脂含量49.1 % (w/w)。
[0101] 實施例13
[0102] 1)粗甘油和水葫蘆水解液混合物的制備:參照文獻(Zhu SD，et al.Biosyst化g, 2006,94:437-442)，W水葫蘆為原料，洗凈，干燥，粉碎過40目篩，進行微波輔助堿預處理， 調整料液比為5%(w/w);添加纖維素酶10FPU/g，i3-葡萄糖巧酶20CBU/g，木聚糖酶40U/g，調 整抑至4.8，于水浴搖床中50°C、200rpm水解72h，得水解液;離屯、得水解上清，上清中葡萄糖 和木糖濃度分別為11.4g/L和8.8g/L，添加粗甘油（深黃被抱霉制備生物柴油過程的副產 物）至終濃度為80g/L，得到產油微生物培養(yǎng)基，C/N比186,調整pH至4.0后于121°C滅菌 20min后備用；
[0103] 2)發(fā)酵性絲抱酵母Trichosporon fermentans CICC 1368(購自中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中屯、)接種在種子培養(yǎng)基(甘油20g/L，酵母粉lOg/L，蛋白腺20g/L)中，32°C， 200巧m振蕩培養(yǎng)2她；
[0104] 3)向步驟1)所得產油微生物培養(yǎng)基中接入步驟2)制備的產油微生物種子液，接種 量12%(v/v)，在32°C下通氣培養(yǎng)144h;
[0105] 4)終止發(fā)酵，此時發(fā)酵液中殘余甘油2.7g/L，最終得干菌體27.7g/L，油脂量 17.8g/L，油脂含量64.3 % (w/w)。
[0…6] 實施例14
[0107] 1)粗甘油和棉花桿水解液混合物的制備：參照文獻（Singh P，et al.Word J Microbiol Biot ,2008,24,667-673)生物預處理的方法，稱取50g過40目篩的棉花桿，采用 白腐真菌固態(tài)發(fā)酵預處理;調整固液比至7%(w/w)，添加纖維素酶10FPU/g，i3-葡萄糖巧酶 20C腳/g和木聚糖酶50U/g，調整pH至4.8，于水浴搖床中50°C、200巧m水解4她，得水解液;真 空抽濾得水解上清，上清中葡萄糖和木糖濃度分別為18.8g/L和11.5g/L，添加粗甘油(小桐 子油脂制備生物柴油過程的副產物)至終濃度為50g/L，得到產油微生物培養(yǎng)基，C/N比92， 調整pH至7.5后于121°C滅菌20min后備用；
[0108] 2)彎曲隱球酵母Cryptococ州S curvatus ATCC 20509(購自美國典型培養(yǎng)物保藏 中屯、)接種在種子培養(yǎng)基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白腺3g/L)中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng) 24h；
[0109] 3)向步驟1)所得產油微生物培養(yǎng)基中接入步驟2)制備的產油微生物種子液，接種 量20%(v/v)，在37°C下通氣培養(yǎng)14化；
[0110] 4)終止發(fā)酵，此時發(fā)酵液中殘余甘油1.5g/l;固液分離收集菌體，得干菌體26. Ig/ 1，油脂量14.5邑/1，油脂含量55.6%(>/\￥)。
[0111] 實施例15
[0112] 參照文獻化iu B,Zhao ZK.J Chem Technol Biotechnol ,2007,82(8) :775-780) 的方法，W實施例1獲得的干菌體l.Og為材料，制備生物柴油，得生物柴油〇.50g，收率為 92%，所得生物柴油的辛燒值為58,適合作為柴油的替代品。
[0…]實施例16
[0114] 參照文獻化i YH，et al.Enzyme Microb Technol,2007,41:312-317)的方法，從 實施例10獲得菌體中提取微生物油脂，得到0.30g。參照文獻（里偉，等.過程工程學報， 2007，7 (1 )，137-140)的方法，取0.25g油脂在酶催化條件下轉醋化制備和純化生物柴油，得 到0.23g，生物柴油收率91 %，所得生物柴油的辛燒值為59，適合作為柴油的替代品。
[0115] 上述對比例1、2和實施例1-14的結果如下表所示：
[0116]
[0117] 通過比較對比例1、2和實施例1的實驗結果發(fā)現，將粗甘油和木質纖維素水解液混 合后，生物量（即干菌體含量)和油脂量都顯著提高，并且大于對比例兩者之和，且甘油和木 質纖維素水解液中的主要碳水化合物葡萄糖和木糖基本可被徹底利用，總的油脂得率也明 顯提高。實施例2-14表明，采用粗甘油和木質纖維素水解液共轉化生產微生物油脂方法，能 夠實現甘油和碳水化合物的完全利用且主要導向油脂合成。因此，采用本發(fā)明方案培養(yǎng)產 油微生物的油脂產量和原料利用效率均有提高，當大量生產時，可W明顯降低成本。
[0118] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種粗甘油與木質纖維素水解液共轉化生產微生物油脂的方法，其特征在于，所述 方法包括下述步驟： 預處理木質纖維素，按照2%-20%的固液比，并添加適量的木質纖維素降解酶進行降 解反應，經固液分離得到木質纖維素水解液，所述水解液中包含有由木質纖維素降解得的 可發(fā)酵性生物質糖，所述固液比為質量比； 將粗甘油與所述木質纖維素水解液按比例混合，得到產油微生物培養(yǎng)基，將產油微生 物培養(yǎng)基的pH值調整為4.0-9.0，然后滅菌備用;其中所述粗甘油所含碳源占總碳源質量的 20%-90%，所述生物質糖所含碳源占總碳源質量的10%-80%，控制碳氮摩爾比C/N為35-400； 取產油微生物并在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到產油微生物種子液； 將所述產油微生物種子液接種至所述產油微生物培養(yǎng)基中，接種量為2%-20%，于20 °C_37°C通氣培養(yǎng)，直至發(fā)酵液中殘余甘油和糖的濃度低于5g/L，終止發(fā)酵，固液分離收集 產油微生物菌體，所述接種量為體積比。2. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述產油微生物培養(yǎng)還添加有營養(yǎng)物質，包括 占產油微生物培養(yǎng)基總質量0.01 %-2 %的氮源、占產油微生物培養(yǎng)基總質量0.01 % -2 %的 磷源、占產油微生物培養(yǎng)基總質量〇. 01 %_1 %的硫源、占產油微生物培養(yǎng)基總質量〇. 001 % 以內的維生素之一或者組合。3. 如權利要求2所述方法，其特征在于，將收集到的產油微生物菌體提取油脂，可作為 制備生物柴油的原料。4. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述木質纖維素為含有纖維素、半纖維素和木 質素的生物質材料，包括農業(yè)生物質、林業(yè)生物質、工業(yè)生物質、能源植物之一或者以上組 合。5. 如權利要求1所述方法，其特征在于，所述預處理木質纖維素包括物理、化學、物理化 學或生物的方法預處理。6. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述粗甘油是由各種動植物油脂、油 脂下腳料、地溝油或微生物油脂原料經酯化或者轉酯化制備生物柴油過程中得到的副產 物。7. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述生物質糖為葡萄糖和木糖，另外 還含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纖維二糖和半乳糖醛酸。8. 如權利要求1-5任一項所述方法，其特征在于，所述產油微生物為經發(fā)酵后菌體油脂 含量超過細胞干重20%的真核微生物，可選油脂酵母、紅酵母、絲孢酵母、隱球酵母或產油 霉菌。9. 如權利要求8所述方法，其特征在于，收集得到的產油微生物菌體中所含油脂是一種 或多種長鏈脂肪酸及其衍生物的油脂。
【專利摘要】本發(fā)明適用于產油微生物培養(yǎng)技術領域，提供一種粗甘油與木質纖維素水解液共轉化生產微生物油脂的方法，具體的，將生物柴油副產物粗甘油和木質纖維素水解液按比例混合調配，使混合物的C/N比適中，這樣原料混合液中的甘油和碳水化合物均徹底轉化且主要導向油脂合成，從而實現油脂的大量積累。本方法實現非常簡單，可以有效避免粗甘油作為原料油脂發(fā)酵過程中需額外添加氮源營養(yǎng)，以及木質纖維素水解液作為原料進行油脂發(fā)酵前需脫氮和/或除磷處理的問題，很大程度上降低了原料成本和過程操作成本，具有明顯的綜合技術優(yōu)勢。從產油微生物菌體提取的微生物油脂可作為制備生物柴油和油脂化工產品的原料。
【IPC分類】C12P7/64, C12R1/645
【公開號】CN105543301
【申請?zhí)枴緾N201610012661
【發(fā)明人】龔志偉, 趙覓
【申請人】武漢科技大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月8日