一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦薄膜器件及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦薄膜器件及其制備方法和應用，該鈣鈦礦復合薄膜器件為典型的“三明治”結構，自下而上依次包括導電基板、鈣鈦礦層、導電封閉層及蛋白層，所述的鈣鈦礦復合薄膜器件可高效吸收可見光并轉(zhuǎn)化為電勢，并具有良好的細胞相容性。將其用于可見光致細胞收割的方法是：以鈣鈦礦復合薄膜器件作為細胞培養(yǎng)表面進行細胞體外培養(yǎng)，再采用可見光照射該培養(yǎng)表面，細胞及細胞片層即可從上述器件表面脫附。本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)酶解法對細胞功能造成的損傷。利用該方法可獲得成骨細胞、心肌細胞等多種細胞片層，具有普適性，且實驗條件溫和，易操作，便于推廣實施。
【專利說明】
一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦薄膜器件及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領域，具體涉及一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件及其制備方法，以及利用該鈣鈦礦復合薄膜器件進行可見光致獲取體外培養(yǎng)的細胞及細胞片層的方法。
【背景技術】
[0002]隨著生命科學的發(fā)展，機體由于損傷和病變造成的組織缺損被再生和替換已不再是夢想。組織工程技術的基本要素包括有良好應答特性的組織細胞、起支撐作用的細胞外基質(zhì)以及促進細胞和組織再生的生物活性因子。而細胞片層組織工程可以實現(xiàn)這些目標。細胞片層不僅包括應答性良好的組織細胞，還可以保存組織所必須的細胞表面蛋白、細胞外基質(zhì)環(huán)境及細胞間連接的完整。這些因素對組織工程修復是非常重要的。因此，如何以溫和的非侵入式的方法獲得完整的細胞片層對于細胞片層組織工程來說是關鍵問題。目前，大多數(shù)的細胞片層獲取都是采用溫敏系統(tǒng)，即通過降低溫度改變材料表面的親疏水性進而獲得細胞片層。但長時間的低溫在一定程度上會損傷細胞功能。近年來，一些其他的細胞收割方法也相繼被報道，包括電致、磁致、PH改變及紫外光致細胞脫附等。事實上，在這些脫附過程中，也伴隨著細胞質(zhì)蛋白分子的調(diào)節(jié)而影響細胞功能。因此，更有效的及更易操縱的細胞收割方法對細胞片層技術的發(fā)展非常關鍵。
[0003]洪逸等采用光敏半導體二氧化鈦通過紫外光照改變材料表面的親疏水性成功獲得細胞片層(Yi Hong , Mengf e i Yu , Wen j ian Weng , et a 1.Light-1nduced celldetachment for cell sheet technology ,B1materials，34(2013) 11-18)。但是，紫外光對細胞存在一定的毒性并可能造成基因突變，故這種方法也存在一定缺陷。因此，利用可見光實現(xiàn)細胞脫附受到關注。
[0004]可見光響應材料目前研究最多的是太陽能領域。太陽能是人類取之不盡的清潔能源，傳統(tǒng)的太陽能電池材料即對可見光吸收，并可將其轉(zhuǎn)化為電能。近年來，新興的一種利用有機金屬鹵化物鈣鈦礦結構(CH3NH3PbX3Per0Vskite)作為吸光材料的全固態(tài)鈣鈦礦太陽能電池被稱為太陽能技術中的一個重要突破。鈣鈦礦材料及器件的最大優(yōu)勢在于可以高效吸收可見光并實現(xiàn)光生載流子的激發(fā)、運輸及分離等過程，并產(chǎn)生很高的開路電壓。因此，選取對可見光響應的鈣鈦礦薄膜器件作為細胞培養(yǎng)表面，通過材料的制備工藝及可見光的強弱來調(diào)控光敏器件對可見光的響應及光電效應，研究可見光下材料與細胞或細胞與細胞之間的相互作用，對于細胞片層脫附、組織工程、細胞治療等的發(fā)展都有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件及其制備方法和應用，該鈣鈦礦復合薄膜器件為典型的“三明治”結構，可高效吸收可見光并轉(zhuǎn)化為電勢，此外具有良好的細胞相容性。利用上述鈣鈦礦復合薄膜器件用于可見光下體外培養(yǎng)細胞收割，可在可見光條件下高效溫和的獲取低損傷的完整細胞片層。
[0006]本發(fā)明的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件采用典型的“三明治”結構，其自下而上依次包括導電基板、鈣鈦礦層、導電封閉層及蛋白層，所述的導電基板為導電玻璃、鉭片或醫(yī)用金屬鈦片，導電玻璃通常為ITO或FT0;所述的鈣鈦礦層為鉛鈣鈦礦CH3NH3PbI3-xBrx或錫鈣鈦礦CH3NH3SnI3-XC1X，其中O彡X彡3，優(yōu)選地，其厚度為300?lOOOnm，可以采用溶液一步沉積技術(如旋涂法)制備獲得;所述的導電封閉層為Pt(其厚度優(yōu)選為50nm)、Ag(其厚度優(yōu)選為40nm)或Au層(其厚度優(yōu)選為40nm)，可以通過真空蒸鍍或旋涂法獲得;所述的蛋白層為牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白，可通過物理吸附制備得到。
[0007]其制備方法如下:在潔凈的導電基板上采用旋涂法制備鈣鈦礦層，干燥后在鈣鈦礦層上制備導電封閉層，將所得樣品放入蛋白溶液中浸泡，在導電封閉層上物理吸附獲得蛋白層，所述的蛋白溶液為牛血清白蛋白溶液、纖連蛋白溶液、膠原蛋白溶液。所述的蛋白溶液濃度通常為0.5mg/mL-2mg/mLo
[0008]利用上述的鈣鈦礦復合薄膜器件進行可見光致細胞收割的方法，是以鈣鈦礦復合薄膜器件作為細胞培養(yǎng)表面接種細胞并進行細胞體外培養(yǎng)，再采用可見光照射該培養(yǎng)表面，細胞及細胞片層即可從上述器件表面脫附。
[0009]所述細胞為在體外模擬生理環(huán)境下培養(yǎng)的貼壁細胞，包括成骨細胞、心肌細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞及干細胞。
[0010]上述方法具體包括以下步驟:
[0011 ] a.在進行體外細胞培養(yǎng)前，將所述的鈣鈦礦復合薄膜器件以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；
[0012]b.將上述器件作為體外細胞培養(yǎng)表面，在其表面以2 X 14?2 X 16個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養(yǎng)基，并放入37攝氏度恒溫及5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I?14天；
[0013]c.將上述進行細胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度50?300mW/cm2的可見光照射上述器件表面I?30分鐘，即可將細胞或細胞片層從器件表面脫附。
[0014]本發(fā)明的方法選擇在可見光照射下存在光伏效應的鈣鈦礦復合薄膜器件，其可以高效的吸收可見光并將其轉(zhuǎn)化為電勢，在細胞培養(yǎng)過程中將該器件作為細胞培養(yǎng)表面，所培養(yǎng)的細胞在經(jīng)可見光照射后，表面發(fā)生光電轉(zhuǎn)變，使得細胞自發(fā)從培養(yǎng)器具表面脫離，實現(xiàn)細胞脫附。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:
[0016]本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)酶解法細胞脫附時對細胞功能造成的損傷，具有高效的、低損傷、操作簡便并且適用細胞范圍廣等特點，具有很強的實用性。對于散在的細胞，可使85 %以上的細胞脫附;對于細胞薄層，則可使細胞薄層完整脫附。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的鈣鈦礦復合薄膜器件的結構示意圖；
[0018]圖2為實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光光照前的激光共聚焦圖。
[0019]圖3為實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光光照后的激光共聚焦圖。
[0020]圖4為光學顯微鏡獲得的細胞片層再迀移圖片。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。
[0022]實施例1
[0023]將含有ITO導電層的玻璃基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3PbI3鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為4000rpm/40s，干燥后將旋涂后的ITO玻璃基板置于加熱臺60°C退火處理10分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Ag層。最后，將制備好的器件放入lmg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其I丐鈦礦層厚度為300nm，Ag層厚度40nm，開路電壓達到0.5V。說明此光敏器件具有明顯的光伏效應。并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面，進行大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2 X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射20分鐘，即可使91%細胞從表面脫離。圖2和圖3分別為采用激光共聚焦顯微鏡所觀察到的實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光照前、后的激光共聚焦顯微圖。對比圖2和圖3，可以看出經(jīng)可見光照射后大量細胞脫離，說明可見光實現(xiàn)單細胞的脫附。
[0024]實施例2
[0025]在實施案例I所述CH3NH3PbI3鈣鈦礦光敏器件表面進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為I X 15個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10分鐘，即可使細胞片層從表面脫離。圖4為采用光學顯微鏡所觀察到的實施例2中培養(yǎng)細胞片層在可見光照后脫附再培養(yǎng)2天后的迀移圖片。可以看出經(jīng)可見光脫附后的細胞片層重新再培養(yǎng)后，能夠很好的爬出新的細胞，并保持良好的細胞形態(tài)及活力，說明可見光脫附的細胞片層保持了良好的再迀移性能，這在組織工程中細胞片層的再應用是很關鍵的。
[0026]實施例3
[0027]將含有FTO導電層的玻璃基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3PbI2Br鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為4000rpm/40s，干燥后將旋涂后的FTO玻璃基板置于加熱臺60°C退火處理10分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Au層。最后，將制備好的器件放入lmg/mL的纖連蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其I丐鈦礦層厚度為500nm，Au層厚度為40nm，開路電壓達到0.45V。說明此光敏器件具有明顯的光伏效應。并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面。進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5 X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10分鐘，即可使94 %細胞從表面脫離。
[0028]實施例4
[0029]在實施案例3所述CH3NH3PbI2Br鈣鈦礦光敏器件表面進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X 15個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度200mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射8分鐘，即可使細胞片層從表面脫離。
[0030]實施例5
[0031]將鉭基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3PbBr3鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為4000rpm/40s，干燥后將旋涂后的鉭基板置于加熱臺60°C退火處理10分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Pt層。最后，將制備好的器件放入lmg/mL的膠原蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其鈣鈦礦層厚度為1000nm，Pt層厚度為50nm，開路電壓達到0.52V。說明此光敏器件具有明顯的光伏效應。并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面。進行心肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為6X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射30分鐘，即可使86%細胞從表面脫離。
[0032]實施例6
[0033]在實施案例5所述CH3NH3PbBr3鈣鈦礦光敏器件表面進行心肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2X 15個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射30分鐘，即可使細胞片層從表面脫離。
[0034]實施例7
[0035]將醫(yī)用金屬鈦基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3SnI3鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為3000rpm/45s，干燥后將旋涂后的醫(yī)用金屬鈦基板置于加熱臺100°C退火處理20分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Pt層。最后，將制備好的器件放入2mg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡12h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其鈣鈦礦層厚度為500nm，Pt層厚度為50nm，并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面。進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2 X 16個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5 % 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，以波長為400?800納米、強度150mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射8分鐘，即可獲得完整的細胞片層。
[0036]實施例8
[0037]在實施案例7所述CH3NH3SnI3鈣鈦礦光敏器件表面進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為4X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度80mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射25分鐘，即可使91 %細胞從表面脫離。
[0038]實施例9
[0039]將醫(yī)用金屬鈦基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3SnI2Cl鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為3000rpm/45s，干燥后將旋涂后的醫(yī)用金屬鈦基板置于加熱臺100°C退火處理20分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Au層。最后，將制備好的器件放入2mg/mL的膠原蛋白溶液中浸泡12h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其鈣鈦礦層厚度為300nm，Au層厚度為40nm。并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面。進行上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5 X 15個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5 % 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度80mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射5分鐘，即可獲得完整的細胞片層。
[0040]實施例10
[0041]在實施案例7所述CH3NH3SnI2Cl鈣鈦礦光敏器件表面進行上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度180mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射I分鐘，即可使90%細胞從表面脫離。
[0042]實施例11
[0043]將醫(yī)用金屬鈦基板依次用洗滌劑水溶液、去離子水、丙酮和異丙醇超聲洗滌后，在基底上旋涂法制備CH3NH3SnCl3鈣鈦礦層，其中旋涂參數(shù)為3000rpm/45s，干燥后將旋涂后的醫(yī)用金屬鈦基板置于加熱臺100°C退火處理20分鐘，然后用真空蒸鍍的方法制備表面Ag層。最后，將制備好的器件放入0.5mg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡36h，得到物理吸附的蛋白層。所制備的器件，其鈣鈦礦層厚度為500nm，Ag層厚度為40nm。并以此基板作為細胞培養(yǎng)表面。進行內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2 X 15個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5 % 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度10mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射15分鐘，即可獲得完整的細胞片層。
[0044]實施例12
[0045]在實施案例7所述CH3NH3SnCl3鈣鈦礦光敏器件表面進行內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為6X 14個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天后，以波長為400?800納米、強度100mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射30分鐘，即可使98%細胞從表面脫離。
【主權項】
1.一種用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件，其特征在于，所述的鈣鈦礦復合薄膜器件自下而上依次包括導電基板、鈣鈦礦層、導電封閉層及蛋白層，所述的導電基板為導電玻璃、鉭片或醫(yī)用金屬鈦片;所述的鈣鈦礦層為鉛鈣鈦礦CH3NH3PbIhBrx或錫鈣鈦礦CH3NH3SnI3-XC1X，其中O彡X彡3;所述的導電封閉層為Pt、Ag或Au層，所述的蛋白層為牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白層。2.根據(jù)權利要求1所述的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件，其特征在于，所述的鈣鈦礦層的厚度為300?100nm03.如權利要求1所述的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件，其特征在于，所述的導電封閉層為Pt，其膜層厚度為50nm。4.如權利要求1所述的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件，其特征在于，所述的導電封閉層為Ag，其膜層厚度為40nm。5.如權利要求1所述的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件，其特征在于，所述的導電封閉層為Au，其膜層厚度為40nm。6.如權利要求1-5任一項所述的用于可見光致細胞收割的鈣鈦礦復合薄膜器件的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 在潔凈的導電基板上采用旋涂法制備鈣鈦礦層，干燥后在鈣鈦礦層上制備導電封閉層，將所得樣品放入蛋白溶液中浸泡，在導電封閉層上物理吸附獲得蛋白層，所述的蛋白溶液為牛血清白蛋白溶液、纖連蛋白溶液、膠原蛋白溶液。7.如權利要求6所述的鈣鈦礦復合薄膜器件的制備方法，其特征在于，所述的蛋白溶液濃度為0.5mg/mL-2mg/mL。8.將如權利要求1-5任一項所述的鈣鈦礦復合薄膜器件用于可見光致細胞收割的方法，其特征在于，以鈣鈦礦復合薄膜器件作為細胞培養(yǎng)表面接種細胞并進行細胞體外培養(yǎng)，再采用可見光照射該培養(yǎng)表面，細胞及細胞片層即可從上述器件表面脫附。9.如權利要求8所述的利用鈣鈦礦復合薄膜器件進行可見光致細胞收割的方法，其特征在于，所述的細胞為成骨細胞、心肌細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞或干細胞。10.如權利要求8所述的利用鈣鈦礦復合薄膜器件進行可見光致細胞收割的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟: a.在進行體外細胞培養(yǎng)前，將所述的鈣鈦礦復合薄膜器件以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒； b.將上述器件作為體外細胞培養(yǎng)表面，在其表面以2X 14?2 X 16個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養(yǎng)基，并放入37攝氏度恒溫及5 % 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I?14天； c.將上述進行細胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度50?300mW/cm2的可見光照射上述器件表面I?30分鐘，即可將細胞或細胞片層從器件表面脫附。
【文檔編號】C12N5/071GK106047692SQ201610428480
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】程逵, 王小召, 翁文劍
【申請人】浙江大學