本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和碳納米材料，具體涉及一種基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著全球人口的增長，對糧食的需求日益激增，然而由于環(huán)境污染所造成的土壤有機質(zhì)下降、養(yǎng)分流失等問題，使世界農(nóng)業(yè)的可持續(xù)化發(fā)展面臨著巨大的挑戰(zhàn)。納米材料作為一種創(chuàng)新工具具有顯著促進作物生長、提高作物品質(zhì)以及幫助作物抵御病蟲害等優(yōu)勢，在保證促進糧食安全的同時，建立一個更加可持續(xù)、更加有效和有彈性的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)，為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展提供新思路。碳點作為納米材料的一部分，其小尺寸效應(yīng)使得它們易于跨越生物屏障，可以快速從根或莖擴散到植物脈管系統(tǒng)中，能通過準(zhǔn)確輸送養(yǎng)分和農(nóng)藥來改善植物生長情況。因此，尋找或開發(fā)新型的低成本、綠色環(huán)保且高效促生的納米級植物生長調(diào)節(jié)劑具有重要應(yīng)用前景。

2、我國具有豐富的煤炭資源，其中褐煤由于密度小、煤化程度低、含氧量高、灰分及灰熔點變化大、燃燒效率低的，以及在工業(yè)轉(zhuǎn)化上高能耗、高環(huán)境污染力的缺點，工業(yè)應(yīng)用價值較低。為了實現(xiàn)褐煤的精細化利用，提高資源利用率，常溫常壓下利用微生物對褐煤進行生物轉(zhuǎn)化具有綠色經(jīng)濟、安全環(huán)保、工藝簡單、低本高效的優(yōu)勢。褐煤作為一種低階煤，其組成結(jié)構(gòu)含多種芳香族化合物、多個不飽和鍵以及混雜多種元素，符合合成碳點前體的高碳含量、多基團結(jié)構(gòu)及多不飽和鍵的特征。目前有專利cn?113528133?a以褐煤為原料，通過加酸加堿、加壓加氧制成熒光碳點；或?qū)＠鹀n?111690405?a以褐煤提取腐植酸制品為原料，通過化學(xué)處理獲得特異性檢測金屬離子的熒光碳點。但以上專利在工藝上存在高成本、高能耗及環(huán)境污染問題，在碳點成品上存在尺寸不均一、熒光激發(fā)發(fā)射波段低以及應(yīng)用領(lǐng)域受限等缺陷。因此，以褐煤為原料，通過簡單的操作單元，綠色安全高效地制備出尺寸均一、得率高、熒光穩(wěn)定、應(yīng)用性強的碳點材料具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題之一，本發(fā)明提供了一種基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點及其制備方法和應(yīng)用。由于褐煤屬礦源腐植酸來源之一，成分結(jié)構(gòu)包含碳、氫、氧、氮、硫元素多種元素和羰基、酚羥基、羧基等多種基團，經(jīng)過工業(yè)轉(zhuǎn)化或生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，可提取出促進植物生長的腐植酸類產(chǎn)物。因此，本發(fā)明以褐煤為原料，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)物作為前體，利用水熱法合成出綠色環(huán)保、高效促生的熒光碳點。本發(fā)明所述基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點的制備方法簡單高效，有效提高褐煤的高值化利用、解決農(nóng)業(yè)肥料合成工藝復(fù)及環(huán)境污染問題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點，所述熒光碳點以褐煤經(jīng)微生物發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物為原料制備得到。

3、在一些實施方式中，所述熒光碳點具有類石墨烯碳核結(jié)構(gòu)，晶格條紋間距為0.20-0.21nm(例如0.203nm)。

4、在一些實施方式中，所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的平均粒徑為4-5nm。

5、在一些實施方式中，所述微生物包括芽孢桿菌。

6、本發(fā)明所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的熒光激發(fā)波長在300-500nm范圍內(nèi)且熒光發(fā)射峰隨激發(fā)波長增加出現(xiàn)紅移現(xiàn)象。在一些實施方案中，所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的熒光激發(fā)波長為350-400nm，優(yōu)選為360-380nm，更優(yōu)選為365-375nm，最佳激發(fā)波長為370nm。在一些實施方案中，所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的熒光發(fā)射波長為450-500nm，優(yōu)選為450-470nm，更優(yōu)選為455-465nm，最佳發(fā)射波長為460nm。本發(fā)明的基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的熒光范圍與葉綠體中葉綠素的吸收波長相一致，可以促進植物光合作用對光的吸收率，在促進植物生長方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

7、在一些實施方式中，以摩爾百分比計，所述熒光碳點中含有：c元素30-40％、n元素5-10％、o元素50-60％。在一些實施例中，本發(fā)明所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的c、n和o元素的摩爾占比分別為34.86％、7.17％和57.97％。

8、在一些實施方式中，所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的c1s譜圖中包含c-c、c-o、c-n和c＝o化學(xué)鍵；所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的n1s譜圖中包含c-n化學(xué)鍵；所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的o1s譜圖中包含c＝o和c-o化學(xué)鍵。所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的紫外可見吸收光譜中包含n→σ*、π→π*和n→π*電子躍遷，包括c-n、c＝c、c-o和c＝o化學(xué)鍵。所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點的傅里葉紅外光譜圖包括含-oh、c-o、c＝o、c-n和c-n-c化學(xué)鍵的官能團。本發(fā)明的基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點表面官能團存在大量羧基和羥基，具有良好的水分散特性，利于基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點被植物吸收和利用。

9、在一些實施方式中，所述褐煤中的腐植酸含量為5-70wt％，優(yōu)選30-60wt％，更優(yōu)選為40-60wt％。

10、在一些實施方式中，所述微生物包括芽孢桿菌。

11、在一些實施方案中，所述發(fā)酵的溫度為25-40℃，優(yōu)選為32-37℃，更優(yōu)選為35℃。

12、在一些實施方案中，所述發(fā)酵的時間為3-10天，優(yōu)選為7-9天，更優(yōu)選為8天。

13、在一些實施方案中，所述熒光碳點通過將褐煤經(jīng)微生物發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物進行水熱處理后制備得到。在一些具體實施方案中，所述水熱處理的溫度為140-240℃，例如140℃、160℃、180℃、200℃、220℃、240℃或它們之間的任意值，優(yōu)選160-190℃。在一些具體實施方案中，所述水熱處理的時間為2-18小時，優(yōu)選4-12小時。在一些實施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物中還添加有有機胺，例如c2-c6的二元脂肪胺，包括但不限于：乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺中的一種或多種。

14、在一些實施方案中，所述發(fā)酵包括：將微生物發(fā)酵種子液接種至含褐煤的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，將發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水混合后進行固液分離，得到含發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵液。在一些具體實施方案中，每160ml所述培養(yǎng)基中褐煤的添加量為25-55g，優(yōu)選40-50g，更優(yōu)選45g。在一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中還添加有輔料和水，本發(fā)明中所述輔料包括但不限于：豆粉、尿素、麥麩、鋸末中的一種或多種。在一些具體實施方案中，豆粉與褐煤的重量比為1:(1.5-4)，優(yōu)選為1:(2-3)。在一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中，尿素與褐煤的重量比為1:(25-55)，優(yōu)選為1:(40-45)。在一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中，麥麩與褐煤的重量比為1:(1-3)，優(yōu)選為1:(2-2.5)。在一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中，鋸末與褐煤的重量比為1:(1-3)，優(yōu)選為1:(2-2.5)。

15、第二方面，本發(fā)明提供一種基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

16、(1)將微生物發(fā)酵種子液接種至含褐煤的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，將發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水混合后進行固液分離，得到含發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵液；

17、(2)將所述發(fā)酵液進行水熱處理，得到熒光碳點。

18、在一些實施方案中，所述褐煤中的腐植酸含量為5-70wt％，優(yōu)選30-60wt％，更優(yōu)選40-60wt％。

19、在一些實施方案中，所述發(fā)酵的溫度為25-40℃，優(yōu)選為32-37℃，更優(yōu)選為35℃。

20、在一些實施方案中，所述發(fā)酵的時間為3-10天，優(yōu)選為7-9天，更優(yōu)選為8天。

21、在一些實施方案中，所述微生物包括芽孢桿菌。

22、在一些實施方案中，每160ml所述的培養(yǎng)基中褐煤的添加量為25-55g，優(yōu)選40-50g，更優(yōu)選45g。

23、在一些實施方案中，所述發(fā)酵種子液的接種量為3-12％(v/w)，優(yōu)選為7-10％(v/w)，更優(yōu)選為8％(v/w)。

24、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基中還添加有輔料和水，本發(fā)明中所述輔料包括但不限于：豆粉、尿素、麥麩、鋸末中的一種或多種。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基中，豆粉與褐煤的重量比為1:(1.5-4)，例如1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：4或它們之間的任意值，優(yōu)選為1:(2-3)。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基中，尿素與褐煤的重量比為1:(25-55)，例如1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55或它們之間的任意值，優(yōu)選為1:(40-45)。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基中，麥麩與褐煤的重量比為1:(1-3)，例如1：1、1：1.2、1：1.5、1：2、1：2.2、1：2.5、1：2.8、1：3或它們之間的任意值，優(yōu)選為1:(2-2.5)。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基中，鋸末與褐煤的重量比為1:(1-3)，例如1：1、1：1.2、1：1.5、1：2、1：2.2、1：2.5、1：2.8、1：3或它們之間的任意值，優(yōu)選為1:(2-2.5)。在一些實施方式中，所述豆粉添加量與褐煤的重量之比為3:5-9(w/w)。在一些實施方式中，尿素添加量與褐煤的重量之比為1:25-45(w/w)。在一些實施方式中，麥麩添加量與褐煤的重量之比4:5-9(w/w)。在一些實施方式中，鋸末添加量與褐煤的重量之比為19:25-45(w/w)。在一些實施例中，豆粉添加量與褐煤的重量之比為3:9(w/w)、尿素添加量與褐煤的重量之比為1:45(w/w)、麥麩添加量與褐煤的重量之比為4:9(w/w)、鋸末添加量與褐煤的重量之比為19:45(w/w)。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基中水的含量為褐煤和輔料總質(zhì)量的50-70％，優(yōu)選55-65％。

25、在一些實施方案中，所述發(fā)酵種子液通過包括如下步驟的方法制備得到：

26、將微生物發(fā)酵菌株在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-18h，得到所述發(fā)酵種子液。

27、在一些具體實施方案中，所述發(fā)酵種子液通過包括如下步驟的方法制備得到：

28、將所述微生物發(fā)酵菌株按每毫升cfu為107接種到100ml新鮮的lb培養(yǎng)基中，在26-30℃、100-200rpm培養(yǎng)16-18h，得到所述發(fā)酵種子液。

29、在一些實施方案中，步驟(2)中，所述發(fā)酵液中還添加有有機胺。本發(fā)明所述有機胺包括c2-c6的二元脂肪胺，包括但不限于：乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺中的一種或多種。在一些實施例中，所述有機胺包括乙二胺。在一些實施方案中，所述有機胺與所述發(fā)酵液的體積之比為1:(5-20)，例如1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20或它們之間的任意值，優(yōu)選1:(8-12)。

30、在一些實施方案中，步驟(1)中，將發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水按1:5-20(w/v)進行混合，優(yōu)選按照1:8-12(w/v)進行混合。在一些實施例中將發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水按照1:10(w/v)進行混合。

31、在一些實施方案中，步驟(2)中，先調(diào)節(jié)所述發(fā)酵液的ph再進行水熱處理。在一些實施方案中，步驟(2)中，先用堿調(diào)節(jié)所述發(fā)酵液的ph至6.5-7.5，優(yōu)選至7.0。在一些實施方式中，所述堿包括堿金屬氫氧化物，優(yōu)選包括氫氧化鈉。

32、在一些實施方案中，所述水熱處理的溫度為140-240℃，例如140℃、160℃、180℃、200℃、220℃、240℃或它們之間的任意值，優(yōu)選160-190℃。在一些實施方案中，所述水熱處理的時間為2-18小時，優(yōu)選4-12小時。

33、在一些實施方案中，所述水熱處理在加壓條件下進行。在一些實施方案中，所述水熱處理在高壓反應(yīng)釜中進行。

34、在一些實施方案中，所述方法還包括：對水熱處理后的反應(yīng)液進行固液分離和干燥，得到基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點。在一些實施方式中，所述固液分離包括離心和/或膜過濾。在一些實施方式中，所述膜過濾采用0.22μm無菌過濾膜進行過濾。在一些實施方式中，所述干燥包括真空冷凍干燥。

35、第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點或者本發(fā)明第二方面所述的制備方法得到的基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點在促進植物生長中的應(yīng)用。

36、在一些實施方案中，所述植物包括農(nóng)作物。本發(fā)明所述農(nóng)作物包括但不限于：生菜、大豆等。

37、在一些實施方案中，所述應(yīng)用包括：使所述植物的種子、根或葉與基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點溶液接觸。本發(fā)明所述接觸的方式包括但不限于：種子包衣、拌土、澆灌、噴施等。

38、在一些實施方案中，所述基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點溶液中基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點的濃度為1-500mg/l，例如為1mg/l、10mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l或它們之間的任意值。在一些實施方案中，所述施用方式為澆灌，所用基于微生物發(fā)酵褐煤碳點濃度為10-500mg/l，每棵植物5-20ml。在一些實施方案中，所述施用方式為噴施，所用基于微生物發(fā)酵褐煤碳點濃度為10-100mg/l，每棵植物5-10ml。

39、在一些實施方案中，所述應(yīng)用包括：將豆科種子或生菜幼苗培養(yǎng)至第一對真葉張開時，對幼苗澆灌或噴施基于微生物發(fā)酵褐煤的熒光碳點溶液。所述根澆條件共4-8次，每4-7天一次，每次根澆體積為4-8ml。

40、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

41、(1)本發(fā)明選擇以微生物發(fā)酵褐煤的產(chǎn)物作為原料，結(jié)合水熱法，從源頭褐煤合成熒光碳點，簡化工藝操作單元、實現(xiàn)降本增效目標(biāo)，為褐煤資源的高效利用提供新的發(fā)展策略。

42、(2)本發(fā)明的制備熒光碳點的方法，碳點得率達60.3±0.43％，實現(xiàn)了褐煤高值轉(zhuǎn)化。碳點熒光發(fā)射波段在400-550nm范圍，與葉綠素吸收光譜波段部分重合，可以增強葉片對光的吸收率，提高植物光合作用效率。

43、(3)本發(fā)明的基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點的單分散性強、水溶性好、滲透性強等特點，可顯著促進植物吸收。施用于果蔬作物生長，如生菜，可顯著的提高生菜葉綠素含量及葉片鮮重，最高能增產(chǎn)204.6％。施用于糧食作物生長，如大豆，可顯著提高50％以上的植株生物量，增強共生結(jié)瘤系統(tǒng)40％以上的固氮能力，以及15-25％的大豆產(chǎn)量。相較微生物發(fā)酵產(chǎn)物前體，作用濃度更低，下降了25倍以上。

44、(4)本發(fā)明利用微生物發(fā)酵技術(shù)結(jié)合水熱法，簡捷快速從褐煤出發(fā)成功制備出高效促生的納米碳點，大大降低了合成成本，提高了經(jīng)濟效益。同時，本發(fā)明的基于微生物發(fā)酵褐煤熒光碳點制備及應(yīng)用為新材料的合成提供了理論指導(dǎo)，為褐煤的高值化應(yīng)用提供了新角度。