本申請要求享有2014年4月9日申請的新加坡專利申請No.10201401377X的優(yōu)先權，它的內容通過整體引用被結合于此以用于各種目的。

技術領域

本發(fā)明涉及生物化學和生物醫(yī)學工程領域，特別涉及用于檢測生物化學分子的微流體裝置。

背景技術：

聚合酶鏈反應(PCR)是用于核酸擴增和基因檢測的成熟方法。該方法通常是在諸如PCR管和孔板之類的裝置中進行。但是，針對基于微流體芯片的PCR裝置的研究日益增多，以用于各種應用，包括食品安全試驗，環(huán)境監(jiān)視和即時臨床診斷。與常規(guī)裝置相比，基于微流體/納流體芯片的PCR系統(tǒng)具備許多優(yōu)勢，諸如操作快，樣品體積小，樣品易于輸送到分析段并且在多個孔中平行擴增。微流體PCR裝置的一個這樣的實施例是具有3個PCR反應孔的盒上實驗室系統(tǒng)。為了進一步加強本實施例的系統(tǒng)的檢測能力，已經(jīng)開發(fā)出了具有更多孔的PCR芯片，努力滿足各種應用之需，諸如癌癥和傳染病診斷，其中可以有10個以上的目標。

微流體PCR平臺可以被分為三類：腔室靜止的PCR系統(tǒng)，連續(xù)流動的PCR系統(tǒng)和熱對流驅動的PCR系統(tǒng)。其中，腔室靜止的PCR系統(tǒng)最適合于具有高流通量的多腔室PCR擴增。但是，要在單個芯片上有效地進行聚合酶鏈反應有相當多的挑戰(zhàn)要克服。例如，不容易將少量PCR混合物均勻地輸送到各個腔中。此外，由于PCR腔的體積非常小，防止反應混合物在高溫下(例如95℃)因蒸發(fā)而損失非常重要。另外，在聚合酶鏈反應過程中可能形成氣泡，這會顯著地影響芯片操作并降低聚合酶鏈反應的效率。解決這些問題最常用的方法是將泵和閥集成到用于加載和密封PCR混合物的芯片上。但是，將許多部件集成到單個芯片上使得裝置的建造與操作復雜化。

一個替代方法是利用毛細作用驅動的微流體將樣品加載到反應室內，用表面活性劑使PCR混合物和PCR芯片之間的接觸角最小化可以實現(xiàn)這種方法。但是，增加的表面活性劑對PCR擴增效率通常有不良的影響。離心力是另一個選項，這是由于它易于應用于盤式微流體裝置，以精確輸送PCR混合物。但是，基于離心力的流體輸送不太靈活，特別是當PCR部分與其他的生物樣品制備部分集成時。

已經(jīng)開發(fā)出PCR快速填充的不同方法。例如，已經(jīng)開發(fā)出PCR陣列芯片，通過將分配通道/反應孔的表面硅烷化以增強毛細作用力來驅動流體，該陣列芯片將PCR混合物自動吸入到分配通道和反應孔內。但是，這種方法需要額外的步驟來改善表面。

防止PCR混合物損失對于基于微流體的PCR系統(tǒng)來說是個挑戰(zhàn)。樣品損失的三個主要原因如下：(i)在樣品加載過程中圈閉在反應孔中空氣在高溫下膨脹，并將樣品溶液推出反應孔。已經(jīng)開發(fā)出幾種方法以避免空氣圈閉，包括改進PCR孔的形狀設計，并且改變孔的表面以使它非常親水。(ii)原來溶于PCR混合物中的氣體在高溫下因可溶性降低而釋放；這也可能將樣品溶液推出反應孔。在加載之前為PCR混合物脫氣可以有助于使這一影響最小化。(iii)PCR混合物在高溫下會蒸發(fā)，導致樣品容積損失；在多個熱循環(huán)之后這一點特別顯著。為了解決這一問題，在填充各反應室之后用單獨的閥來密封它們。

此外，各種細菌的快速檢測是食品安全試驗和臨床診斷的關鍵。常規(guī)PCR或者反轉錄PCR(RT-PCR)通常用于細菌檢測。但是這要忍受一個重要的缺點，即它需要快速而精確的熱循環(huán)，以使目標DNA分子在反應過程中變性、延長和退火。

因此需要提供一種微流體裝置和系統(tǒng)，以克服或者至少改善上述的一個或多個缺點。

技術實現(xiàn)要素：

在第一方面中，提供了一種微流體裝置，包括：多個孔，每個孔包括一個充當該孔的入口和出口的開口，其中每個開口與共用流體通道流體連通，并且其中每個開口通過隔離通道與共用流體通道相連，并且所述多個孔在該裝置上被布置成徑向對稱的圖案。

在第二方面中，提供了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：此處公開的微流體裝置；布置在微流體裝置上方或下方的檢測裝置，以在使用過程中檢測由包含在孔中的可能的反應產物發(fā)射的信號。

在第三方面中，提供了一種使用此處公開的系統(tǒng)從液體樣品中檢測至少一種目標分子的方法，其中該方法依次包括：(i)用來自包含有目標分子的源頭的液體樣品填充多個孔；(ii)用來自密封劑源的密封劑填充共用流體通道；(iii)允許檢測探針和目標分子之間在多個孔中進行反應；(iv)檢測由反應產物發(fā)出的信號。

附圖說明

當結合非限定性的實施例和附圖考慮時，參照詳細說明會更好地理解本發(fā)明，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的裝置的示意圖。具體地說，圖1a顯示了裝置100的示意性的概覽，圖1b顯示了裝置100的放大的示意圖，而圖1c顯示了孔104的橫截面。圖1d顯示了另一個實施例，其中多個孔104在裝置100上被設置成線性圖案，這些孔通過隔離通道108與一個共用流體通道106流體連通。

圖2a顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的裝置的示意圖，該裝置被連接到真空源160和管170上，該管用作包含可能的目標分子的源頭。

圖2b顯示了圖2a的裝置的孔中的壓力的曲線，該壓力對應于注射泵160中的真空體積，在實施例2參考該圖。

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式的裝置的示意圖，該裝置被連接到真空源180、密封劑源180和包含可能的目標分子的源170。源160、170、180通過閥142、144、146連接到裝置100。

圖4a顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的系統(tǒng)200的示意圖。除了別的以外，系統(tǒng)200包括PCR裝置100、發(fā)熱元件202和光學系統(tǒng)210。

圖4b顯示了根據(jù)來自光學系統(tǒng)210的光的高斯正態(tài)分布的模擬結果，在實施例4中參考該圖。裝置100的多個孔可以以與光的分布互補的方式布置。

圖5a顯示了加載到裝置100內的樣品的照片，在實施例2中參考該圖。

圖5b顯示了每個孔的平均填充體積對所施加的真空的曲線，在實施例2中參考該圖。

圖5c顯示了不同孔中填充的體積對沿著流體通道的孔的位置的曲線，在實施例2中參考該圖。

圖6a顯示了當使用的真空體積不足、小于5毫升時PCR室的照片，而圖6b顯示了當使用22毫升的真空體積時PCR室的照片。在實施例3a中參考圖6a和圖6b。

圖7顯示了實施例3b中的密封過程的進程的照片。

圖8顯示了原料RNA樣品、其10倍到10,000倍的稀釋液(即濃度為1.00E+01、1.00E+02、1.00E+03和1.00E+04)和陰性對照的擴增曲線，在實施例5中參考該圖。

圖9顯示了在奧米伽PCR陣列芯片上對HPIV1和HPIV2病毒進行同步端點檢測的圖像，在實施例5中參考該圖。

圖10顯示了沸點溫度對不同甘油濃度的曲線，在實施例6b中參考該圖。

圖11顯示了從約10³、10⁵、10⁷、和10⁹的細菌細胞中提取出的質粒DNA的擴增曲線，在實施例6b中參考該圖。

圖12a顯示了在65℃下在40分鐘的HDA之后捕獲的端點熒光信號，在實施例6b中參考該圖。

圖12b顯示了逐孔的信號強度對孔數(shù)目的曲線，在實施例6b參考該圖。

圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的集成的多合一分子診斷裝置500的分解圖，該裝置包括PCR芯片102和樣品制備盒502。

具體實施方式

在一個實施方式中，提供了一種微流體裝置，包括：多個孔，每個孔包括一個充當該孔的入口和出口的開口，其中每個開口與一個共用流體通道流體連通，并且每個開口通過隔離通道與共用流體通道相連，并且所述多個孔在該裝置上被布置成徑向對稱的圖案。

公開的該裝置可以是簡單裝置，它不涉及太多部件。因此，該裝置的制造可以很經(jīng)濟，裝置的操作也很容易。此外，該公開裝置可以提高反應混合物輸送和密封的速度和精確度。

該公開的裝置可以包括多個孔，孔的數(shù)目根據(jù)應用的需要而定。例如，該裝置可以包括約2到100個孔，或者約5到100個孔，或者約10到100個孔，或者約20到100個孔，或者約5到50個孔，或者約10到50個孔，或者26個孔，或者28個孔。在有些情況下，公開的裝置很靈活，以滿足各種應用之需。

每個孔的直徑和深度可以調節(jié)，以適合裝置的用途。每個孔的體積可以精密控制。在一些例子中，有必要減小孔的體積。

孔可以具有適于包含反應混合物的形狀，諸如球形或者立方形或者燈泡形。每個孔可以具有不同的尺寸或者形狀。

每個孔的體積可以在約1微升到50微升，或者約2微升到50微升，或者約3微升到50微升，或者約2微升到10微升，或者約3微升到10微升，或者落在這些范圍內的任何值。包含在裝置內的總液體體積可以在約2微升到1000微升之間，或者約10微升到約200微升，或者約10微升到約150微升，或者約20微升到約200微升，或者約20微升到約150微升，或者約30微升到約200微升，或者約30微升到約150微升，或者約30微升到約100微升。在一個實施例中，孔的體積被精密控制到2.99到3.09微升。在一個實施例中，公開的裝置的總液體體積可以是現(xiàn)有技術裝置中要求的總液體體積的一小部分。例如，具有10個孔的公開裝置的總液體體積約為10個常規(guī)PCR管中要求的總體積的大約20％。通過再次引入從入口通道排出的過量液體，總液體體積可以進一步減小?？傄后w體積在這里包括孔的體積和入口通道中液體的體積。

孔的直徑可以在約1毫米到4毫米之間，或者約1.5毫米到4毫米，或者約1.7毫米到4毫米，或者約2毫米到4毫米，或者約2.2毫米到4毫米，或者約2.5毫米到4毫米，或者約3毫米到4毫米，或者約1毫米到3毫米，或者約1毫米到2.5毫米，或者約1毫米到2.2毫米，或者約1毫米到2毫米，或者約1.5毫米到3毫米，或者約2毫米到3毫米，或者約2毫米到2.5毫米?？椎纳疃然蛘吒叨瓤梢栽诩s0.5毫米到1.5毫米之間，或者約0.6毫米到1.5毫米，或者約0.7毫米到1.5毫米，或者約0.8毫米到1.5毫米，或者約0.9毫米到1.5毫米，或者約1毫米到1.5毫米，或者約0.5毫米到1毫米，或者約0.5毫米到0.9毫米，或者約0.5毫米到0.8毫米，或者約0.8毫米到1毫米。在一個實施例中，孔的直徑可以減少到約2毫米，孔的深度可以減小到約1毫米，以將孔的體積減少到約3微升。

當用在此處時，術語“直徑”是指目標的最大長度。對于具有不規(guī)則形狀的目標，直徑是目標最長的橫截面的長度。

每個孔包括一個開口。該開口允許進入孔內，以及從孔中退出。在一個實施例中，開口在任一給定時間可以充當入口或出口。液體通過孔的開口進入孔中?？椎拈_口可以通往隔離通道。因此，開口可以具有與隔離通道相同的尺寸，或者可以具有與隔離通道不同的尺寸，只要液體流不被阻止即可。

根據(jù)需要，隔離通道可以位于孔的頂部，或者孔的中部，或者孔的底部。也即，隔離通道可以允許液體進入孔的頂部、或者孔的中部、或者孔的底部。

在一個實施例中，可以允許液體快速進入孔中。在裝置被用于反應的情況下，該實施例有助于將反應混合物更快地輸送到孔內，以開始反應。在一些例子中，可以完全或者部分防止孔中的液體從孔中出來。隔離通道的尺寸可以相應調整。

隔離通道可以具有任意的橫截面形狀?？梢赃x擇隔離通道的橫截面形狀，以完全或者部分防止孔中的液體從孔中出來，而允許液體進入孔中。例如，隔離通道的橫截面形狀可以是錐形橫截面或者圓形橫截面或者正方形橫截面。在一個例子中，隔離通道的寬度可以在約0.05毫米到約3毫米之間。隔離通道的深度可以在約0.05毫米到約3毫米之間。如果隔離通道的橫截面是圓形，直徑可以在約0.05毫米到約3毫米之間。在一個例子中，隔離通道的橫截面尺寸可以為(約0.05-3毫米)乘以(約0.05-3毫米)。在另一個例子中，隔離通道的橫截面尺寸可以為約0.5毫米乘以約0.5毫米。

液體從共用流體通道進入孔中。共用流體通道可以具有任意的橫截面形狀?？梢赃x擇流體通道的橫截面形狀，以免阻礙液體流動，例如圓形橫截面或者正方形橫截面。在一個例子中，流體通道的寬度可以在約0.05毫米到約3毫米之間。流體通道的深度可以在約0.05毫米到約3毫米之間。如果流體通道的橫截面是圓形，直徑可以在約0.05毫米到約3毫米之間。在一個例子中，流體通道的橫截面尺寸可以為(約0.05-3毫米)乘以(約0.05-3毫米)。在另一個例子中，流體通道的橫截面尺寸可以為約0.5毫米乘以約0.5毫米。如果通道太小，例如小于公開的尺寸，那么可能會妨礙孔的填充。另一方面，如果通道太大，例如大于公開的尺寸，可能會浪費試劑。

共用流體通道的一端或者兩端可以是開口端。流體通道的開口端可以具有約0.05毫米到約3毫米之間的寬度或者深度或者直徑。在一個例子中，流體通道的直徑可以為約1毫米。

在一些例子中，眾多孔中的至少一些或者所有孔與共用流體通道流體連通。在一些例子中，液體可以從共用流體通道依次進入孔中。在一個例子中，液體可以沿著液體流動方向完全填充與共用流體通道相連的第一孔，然后從第一孔溢流到共用流體通道內，以填充接下來的孔。在另一個例子中，如圖5a所示，當液體在共用流體通道中時，許多孔可以同時被填充。

此處使用的術語“流體連通”可以是指液體或者氣體的連通。此處所稱的液體可以是溶液，諸如水溶液，或者混合物，諸如反應混合物。

多個孔以某種方式被布置在裝置上，以便所有孔可以被基本均勻地檢測到。如在下面將進一步詳細描述的那樣，每個孔可以包括能夠與目標分子形成反應產物的檢測探針。反應產物可以發(fā)出信號，公開的系統(tǒng)的檢測裝置通過例如將光照在多個孔上來檢測該信號。在一些例子中，多個孔以與檢測方式互補的方式被布置在該裝置中，以便可能的反應產物的檢測可以是基本均勻的。

在一個實施方式中，多個孔在裝置中被布置成徑向對稱的圖案。如此處使用的那樣，術語“徑向對稱”、或者它們的語法變體，是指構成部分的布置關于特殊的軸線對稱。在某些例子中，構成部分的布置關于三條以上的軸線對稱，其中這些軸線相交于中心點。

在一個例子中，多個孔可以按圓形布置定位在該裝置上，或者在該裝置上布置成圓環(huán)。連接多個孔的共用流體通道可以形成“Ω”形狀，因此可以被稱為“奧米伽PCR陣列芯片”。圖1a顯示了這一實施方式的一個實施例。在圖1d所示的另一個實施例中，多個孔在該裝置上布置成線性圖案，其中各孔與一個共用流體通道流體連通。

此處所用的術語“芯片”是指一般包括諸如公開的裝置之類的微流體裝置的基片，包括許多可以彼此互連或者可以彼此不互連的通道和室。通常，這樣的芯片包括許多有源的或者無源的元件，諸如通道、閥、泵和相關的控制系統(tǒng)。

多個孔可以被定位在共用流體通道的任一側。在一個實施例中，所有孔都可以在共同平面內被定位于流體通道的一側。如果多個孔被布置成圓形回路，那么所有孔都可以被布置在回路的外緣。在另一個實施例中，第一組孔可以定位在流體通道的第一側，而第二組孔可以定位在流體通道的沿著共同平面中的Y軸與第一側相對的側，如圖1d所示。在又一個實施例中，一組孔或者所有孔可以關于通過共用流體通道的軸以角度B定位在徑向上的任何位置，例如沿著Z軸，其中角度B為90°。每個孔相對于共用流體通道可以定位成介于約10°和約90°之間、或者45°、或者90°的角度。每個孔的隔離通道相對于共用流體通道可以以介于約10°和約90°之間、或者45°(如圖1d的(i)和(ii)中所示)、或者90°(如圖1d的(iii)和(iv)中所示)的角度A移動。如果多個孔被定位在共用流體通道的不同側，相對孔的隔離通道可以定位于共用流體通道的同一點上(如圖1d的(i)和(iii)中所示)。例如，共用流體通道上的一個點產生兩個隔離通道(正Y軸上的一個隔離通道和負Y軸上的另一個隔離通道)，其中X軸是平行于共用流體通道的軸。在另一個實施例中，相對孔的隔離通道被定位在共用流體通道的不同點或者交錯點上(如圖1d的(ii)和(iv)所示)。例如，共用流體通道上的一個點在正Y軸上產生一個隔離通道，而共用流體通道上的另一個點在負Y軸上產生另一個隔離通道，其中X軸是平行于共用流體通道的軸。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的公開裝置的一個實施例如圖1a，1b和1c所示。圖1顯示了裝置100的示意性的概覽圖。圖1b顯示了裝置100的放大的示意圖。圖1c顯示了孔104的橫截面。

裝置100包括基片102，基片包括多個孔洞104，這些孔洞將被光學粘膜110封閉在頂部和底部(如圖1c所示)，以便孔洞104充當孔。相應地，裝置100具有“夾心”結構?；?02用1.5毫米厚的聚碳酸酯(PC)制成。用兩片0.1毫米厚的光學粘膜110密封基片102的頂部和底部，形成封閉孔104。裝置100包含26個孔，均勻地定位在圓形的共用流體通道106的外側。每個孔104具有2.0毫米的直徑和1.0毫米的深度，對應于約3微升的樣品容積。各孔經(jīng)0.5毫米寬、0.5毫米深的隔離通道108與共用流體通道106相連。用于輸送液體到各個孔104的共用流體通道106分別具有0.5毫米的寬度和0.5毫米的深度。在共用流體通道106的兩端，有兩個直徑1毫米的孔112a、112b，它們將分別與入口管和出口管相連(未顯示)。液體從112a沿著箭頭A所示的方向被輸送到孔104。圖1c顯示預裝有引物114的孔104。

共用流體通道的第一端可以被構造成與將被引入該裝置中的流體流體連接。引入該裝置中的流體取決于裝置的用途。如果該裝置被用于進行聚合酶鏈反應，共用流體通道的第一端可以被構造成與以下源中的一個或多個流體連接：包括可能的目標分子的源、密封劑源、洗滌劑源和用于聚合酶鏈反應的試劑的其他源。共用流體通道的第一端還可以被構造成與正壓源流體連接，以幫助引入流體。如果一個以上的源將被連接到流體通道的第一端，那么在流體通道的第一端處，連接可以分支也可以匯合。在另一個實施例中，每個源都可以直接連接到第一端，也可以在匯合到流體通道第一端之前連接到分支連接。

共用流體通道的第二端可以構造成與真空源流體連接。真空源可以直接連接到第二端，也可以在流體通道第二端匯合之前連接到分支連接。由真空源產生的真空可以幫助從流體通道的第一端抽或者拉流體到流體通道的第二端。如果一個以上的源將被連接到流體通道的第一端，那么在流體通道的第一端處，連接可以分支，也可以匯合。

換句話說，流體通道的第一端可以配置成把流體推入通道，第二端可以配置成將流體拉過通道。

從各種源的每個分支或者每個連接都可以由一個或多個閥分別控制。

在流體通道的一端將被要么直接要么通過分支連接到一個源的情況下，可以提供一個或多個閥，以調節(jié)源的流動或者在不同分支之間切換。在流體通道的一端將被連接到一個以上的源的情況下，其中每個源要么直接要么通過分支連接，可以在每個連接上提供一個或多個閥，以調節(jié)源的流動或者在不同分支之間切換。

閥可以是電磁閥或者旋轉閥。閥的控制可以自動，藉此便于在該裝置內輸送各種流體。真空源可以自動化，以提供預定真空壓力。真空源可以通過反饋回路與閥相連。因此，公開的裝置、系統(tǒng)和方法可以完全自動化。

可以防止液體接觸真空源。相應地，在某些情況下，一個或多個液體流動封堵器被連接在流體通道的第二端和真空源之間。在一個實施例中，液體流動封堵器可以位于每個連接上，或者可以位于每個分支上。在另一個實施例中，液體流動封堵器可以位于某些分支上，或者只在一個分支上。

液體流動封堵器可以包括尺寸做成能防止液體通過但允許氣體通過的孔洞。流動封堵器可以用能幫助防止液體通過的材料制造。例如，如果液體是水基的，那么流動封堵器可以用排斥液體的疏水材料制造。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的公開裝置的一個實施例的示意圖如圖2a所示。將液體和密封劑抽到裝置100的共用流體通道106和孔104內的真空源160包括機動化驅動的帶有活塞162的10毫升注射器(NE-1000，新紀元泵系統(tǒng)公司，美國)，以及用于打開/關閉由真空源160抽出的真空的兩個夾閥(152和154)。液體沿箭頭A的方向流動。200微升的艾本德(Eppendorf)管170被用作保持液體的容器。管170經(jīng)硅膠管(未顯示)連接到共用流體通道的入口。裝置100的共用流體通道的出口經(jīng)另一個硅膠管(未顯示)連接到注射器160。

根據(jù)本發(fā)明另一個實施方式的公開裝置的另一個實施例的示意圖如圖3所示。在該實施例中，裝置100在流體通道106的第一端處將被流體連接到包含可能的目標分子的源170和密封劑源180。與源170的連接和與密封劑源180的連接匯合于流體通道106的第一端。與源170的連接包括可設定在“打開”位置142b和“閉合”位置142a之間的閥142，其中在"打開"位置，允許可能的目標分子從源170流入流體通道106的第一端并流過流體通道106；而在"閉合"位置，可能的目標分子的流動被阻斷。與密封劑源180的連接包括可設定在“打開”位置144a和“閉合”位置144b之間的閥144，其中在"打開"位置，允許密封劑從源180流入流體通道106的第一端并流過流體通道106；而在"閉合"位置，密封劑的流動被阻斷。

仍然參照圖3，真空源160將被流體連接到4個分支，其中4個分支中有3個匯合于流體通道106的第二端。與真空源160的連接包括可設定在對應于4個分支的4個位置(146a，146b，146c，146d)之間的閥146。第一分支包括連接在流體通道106的第二端和真空源160之間的試劑流動封堵器158，并且處于閥位146a處。第二分支包括開口端連接，并且處于閥位146b。第三分支直接連接到流體通道106的第二端，并且處于閥位146c。第四分支包括連接在流體通道106的第二端和真空源160之間的密封劑流動封堵器156，并且處于閥位146d。下面會進一步詳細解釋裝置100的該實施方式的操作。

在某些情況下，裝置在填充過程中設置在豎直位置。

在某些實施例中，每個孔都可以包含檢測探針。術語“檢測探針”泛指能夠與目標分子結合的分子，其中“檢測探針”可能包括固定到支撐體上的探針分子或者未固定到支撐體上的探針分子。在一個實施例中，檢測探針被固定到包括表面、薄膜或者顆粒的支撐體上。在另一個實施例中，檢測探針不固定到支撐體上。

檢測探針能夠通過共價鍵、氫鍵、靜電結合或者其他相互吸引結合到目標分子的至少一部分，例如目標核酸的特定序列，形成反應產物。反應產物可以發(fā)出能夠被檢測裝置檢測的信號，以檢測目標分子的存在，或者在未形成反應產物的情況下，檢測目標分子不存在。在一個實施例中，檢測探針可以是結合到目標分子的蛋白質，目標分子也可以是蛋白質。因此，該實施例中的結合是經(jīng)蛋白質-蛋白質相互作用來檢測，例如，蛋白質結構中的構型變化。在另一個實施例中，檢測探針可以是結合到目標分子的核酸，目標分子也可以是核酸。因此，該實施例中的結合是經(jīng)過雜交來檢測例如目標核酸存在與否或者核酸中存在單個核苷酸突變。

此處所指的液體可以是包括目標分子或者可能包括目標分子的源或者溶液。包括可能的目標源的源可以是從受驗者上取下的生物樣品，例如臉頰拭子，以檢測特定基因存在與否。此處所用的術語“目標核酸”是指它所包含的序列區(qū)域可以結合到檢測探針的互補區(qū)域上的核酸序列。目標核酸序列可以擴增，并且當與檢測探針的互補區(qū)域雜交時，它有可能檢測是否存在目標核酸以及目標核酸的定量。在該申請中所用的術語“雜交”是指兩個完全或者部分互補的單個核酸鏈能夠沿反向平行方向聚合，從而形成具有雙鏈區(qū)域的穩(wěn)定結構。這一雙鏈結構(有時稱為雜交種)的兩個組成鏈用氫鍵保持在一起。盡管這些氫鍵通常形成在單個核酸鏈上包含堿基腺嘌呤和胸腺嘧啶或者尿嘧啶(A和T或者U)或者胞嘧啶和鳥嘌呤(C和G)的核苷酸之間，但是堿基配對可以形成在不是這些“規(guī)范”對的成分的堿基之間。非規(guī)范堿基配對在本領域是公知的，例如，參見《核酸生物化學》(亞當?shù)龋琫ds.，1992)。

檢測探針可以結合到用于測量目標與檢測探針的雜交的檢測裝置，諸如標記物。標記物可以是放射性同位素或者熒光基團。在一個實施例中，每個檢測探針可以與不同的熒光基團配對，因此可以辨別不同的探針。

例如，檢測探針包括DNA或者RNA。在其他實施例中，檢測探針包括具有發(fā)夾回路結構的單鏈多核苷酸，它能夠與樣品多核苷酸的一個區(qū)域形成雙鏈絡合物。在一個實施例中，檢測探針可以是包含熒光基團和猝滅劑的引物或者分子信標(MB)探針。在一個實施例中，在使用之前，MB探針不需要任何進一步的改進。在另一個實施例中，檢測化驗不需要額外的一價或者二價鹽或者添加劑，諸如牛血清白蛋白(BSA)。在沒有目標分子的情況下，MB探針保持在穩(wěn)定的發(fā)夾結構中，以便來自熒光基團的熒光因熒光基團接近多核苷酸的一端而猝滅劑在多核苷酸的另一端而被完全猝滅。例如，MB探針的5’端的羧基熒光素(Fam)熒光基團或者Rox熒光基團接近3’端處的Dabsyl會猝滅任何熒光。如果存在目標分子，探針的一部分與目標分子的互補序列雜交，導致熒光基團和猝滅劑分開，隨后導致熒光基團發(fā)出熒光。

可以使用熒光染料的其他實施例，包括SYBR Green I、Eva Green和LG Green。

在某些實施例中，目標分子包括DNA或者RNA。在某些實施例中，目標分子包括所關心的基因。在一個實施例中，所關心的基因可以是賦予對抗抗病毒或者抗菌處理(例如用一種或多種抗生素處理)的抵抗力的基因。在另一個實施例中，所關心的基因可以是細菌和病毒的基因。在一個特殊的實施例中，所關心的基因與人副流感病毒(HPIV)有關，例如HPIV1和HPIV2。在另一個實施例中，所關心的基因可以是埃氏大腸桿菌質粒(E.coli plasmid)DNA。

在一個實施例中，檢測探針和目標分子之間的反應在室溫下(例如30℃)基本是瞬時的。所關心的目標可以與各個檢測探針雜交，發(fā)出的信號在30℃的最適溫度下以小噪聲獲得。在另一個實施例中，探針和目標不需要任何培育就能產生反應產物。可能的反應之前或之后也不需要任何洗滌。

該裝置可以包括覆蓋材料，以封閉多個孔或者通道。封閉多個孔或者通道的材料可以是透明的。在一個實施例中，多個孔或者通道被薄透明帶覆蓋，例如來自美國加利福尼亞應用生物系統(tǒng)公司的MicroAmp^TM光學粘膜，該光學粘膜與PCR兼容，且不含DNA/RNA/核糖核酸酶。裝置的剩余部分可以用半透明材料或者不透明材料制成。

該裝置可以用不阻礙檢測探針與目標分子結合的材料制成。材料可以是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯、聚乙烯醇、丙烯腈丁二烯苯乙烯或者聚苯乙烯。在一個實施例中，該裝置可以與市場上發(fā)現(xiàn)的共用PCR試劑兼容，例如來自荷蘭Qiagen公司的PCR主混合物(Taq PCR Master Mix試劑盒)，美國威斯康星州的Promega(GoTaq Hot Start Colorless Master Mix)和美國加州的Invitrogen(Platinum PCR SuperMix)。

此處公開的微流體裝置可以包含在下面將要詳細描述的系統(tǒng)中。

在一個實施方式中，提供了一個系統(tǒng)，包括：此處公開的微流體裝置，布置在微流體裝置上方或下方的檢測裝置，用于在使用過程中檢測由包含在孔中的可能的反應產物發(fā)射的信號。

檢測裝置可以是光學系統(tǒng)。光學系統(tǒng)可以包括光源和濾光器，濾光器能夠捕捉由檢測探針和目標分子的反應產物發(fā)出的信號。光源和微流體裝置的多個孔可以同心設置。在一個實例中，每個孔可以接受相同強度的光，由此對可能的反應產物進行基本上一致的探測。光源可以是紫外線-可見光(UV-Vi)寬譜帶汞/LED光源，濾光器可以是激勵、發(fā)射和分色濾光器，每個濾光器具有對準所用熒光染料的兼容波段。光源能夠照亮微流體裝置的多個孔，以便相機可以捕捉發(fā)出的可能信號的影像。包含在檢測裝置中的光源和濾光器還可以由透鏡和攝像機發(fā)出信號，以激發(fā)反應產物產生熒光。合適的攝像機的實施例是從加拿大QImaging公司得到的Retiga EXi CCD攝像機或者從加拿大不列顛哥倫比亞省列治文市的灰點研究公司獲得的基于Grasshopper2CCD的紅綠藍(RGB)攝像機，帶有從美國新澤西州埃德蒙光學系統(tǒng)公司獲得的25毫米焦距的透鏡。攝像機捕捉的影像可以用處理程序處理。例如，可以使用美國馬薩諸塞州Mathworks公司的Matlab圖像獲取工具箱中的定制圖像分析軟件。處理程序可以由處理器(例如計算機)管理。在一個實施例中，光學系統(tǒng)為發(fā)出信號(例如熒光)的一次成像提供非機械化裝備。

光電二極管和CCD攝像機都可以用來檢測PCR的熒光信號。由于光電二極管是點測器，因此為了同時監(jiān)視更多的PCR孔，必須使用光纜和光學多路復用器。由于處理能力進一步增加，因此這會變得日益復雜且昂貴。另一方面，CCD攝像機檢測的是一個區(qū)域而非一個點的信號，因此被監(jiān)視的PCR孔的數(shù)目沒關系。但是，由于光源和PCR孔之間以及PCR孔和攝像機之間需要一定的距離，因此基于攝像機的檢測的靈敏度一般小于基于光纜的檢測，后者隨距離增加會有小的傳輸損耗。但是，對于PCR產物檢測來說，靈敏度的降低一般不是問題。隨著更靈敏且成本更經(jīng)濟的CCD攝像機的可利用性的增加，越來越多的商用實時PCR系統(tǒng)可以使用CCD攝像機作檢測器。

公開的系統(tǒng)還可以包括與多個孔熱連通的發(fā)熱元件。

加熱模塊可以是帕爾貼熱電裝置。熱電裝置可以包括風扇、熱電(TE)加熱器/冷卻器、以及熱電控制工具包。熱電控制工具包可以包括擴增器和溫度控制器。熱電加熱器可以由擴增器供能，擴增器由溫度控制器控制。T型熱電偶可以安裝在熱電加熱器上以測量溫度，并且可以用作溫度控制器的反饋。熱電加熱器和孔內實際溫度之間的溫差可以通過用等體積的PCR產物直接測量孔內溫度來校準。鋁冷卻熱沉可以連接到熱電裝置。

該系統(tǒng)還可以包括連接到流體通道第一端的流體源，例如，包含可能的目標分子的源、密封劑源，洗滌劑源、用于反應的試劑的其他源、正壓源、或者其組合。

系統(tǒng)還可以包括連接到流體通道第二端的真空源。

一個或多個閥可以連接在流體通道和密封劑源、包含可能的目標分子的源和真空源之間。

各種可能的連接如上所述。

真空源可以是真空泵或者注射器。正壓源可以是正壓泵或者注射器。

真空源可以設置成考慮到微流體裝置、共用流體通道、隔離通道和/或孔的大小視情況而定提供合適容積的真空?？梢赃x擇真空容積，以獲得如下所述的填充步驟(i)的合適速度。在一個實施例中，對于約3微升的單孔容積而言，真空源可以配置成為填充步驟(i)提供約1到22毫升之間、或者約2到22毫升之間、或者約3到22毫升之間、或者約4到22毫升之間、或者約5到22毫升之間、或者約1到20毫升之間、或者約1到15毫升之間、或者約5到15毫升之間的真空容積?？蛇x地，可以為填充步驟(i)拉出約-50千帕到約-100千帕的真空。如果步驟(i)中施加的真空容積過高，微流體裝置內可能形成氣泡，從而降低可用于反應的樣品的體積。氣泡也可以改變反應結果。此外，在高填充速度下，可能產生紊流，導致氣泡被圈閉在液體內。如果步驟(i)中施加的真空過低，用于填充所有孔的時間可能太長，這也不方便。一些孔也可能不能完全充滿。

在一個實施例中，公開的裝置和系統(tǒng)可以配置成提供高達8毫秒/孔的液體填充速率，同時防止現(xiàn)有技術中面對的缺點。公開的裝置和系統(tǒng)可以提供更快的進行反應的方法。

真空源可以配置成為如下所述的填充步驟(ii)提供約10到100微升/分鐘或者約30到70微升/分鐘的真空流速。應該指出的是真空源可以配置成提供落在該范圍內的任何其他真空流速。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的公開系統(tǒng)的一個實施例的示意圖如圖4a所示。在該實施例中，系統(tǒng)200包括接觸加熱元件202的PCR裝置100。加熱元件202包括熱沉204和風扇206。系統(tǒng)200還包括光學系統(tǒng)210。光學系統(tǒng)210包括光源212。來自光源212的光經(jīng)光纖214傳遞，并且由激勵濾光器216過濾，以產生激勵光束。該光束由鏡子218反射，以橫向激發(fā)垂直位于其下方的PCR裝置100。由PCR芯片100中的樣品沿著箭頭B發(fā)出的光由發(fā)射濾光器219過濾，產生熒光信號。該信號被具有固定焦距的緊湊透鏡(未顯示)聚焦。聚焦的光隨后被冷卻的CCD攝像機220檢測，并且通過分析在某些時間點被攝像機捕捉到的圖像來獲得整個芯片100上的光強度。

在某些例子中，公開的系統(tǒng)不僅能夠單獨使用，而能夠作為集成系統(tǒng)的一部分。典型的集成系統(tǒng)公開在美國專利No.8343443B2中。

圖13提供了集成的多合一分子診斷裝置500的分解圖，該裝置包括PCR芯片102和樣品制備盒502。樣品制備盒502用原樣品504(例如血液和鼻拭子)制備目標分子，例如DNA/RNA或者蛋白質。樣品制備盒502還包括用于密封劑180的通道以及用于廢品508和洗滌劑510的通道。樣品制備盒502和PCR芯片102被裝配到集成盒500內。一裝好，包含目標分子的洗脫溶液506就被傳輸?shù)溅感涡酒?02，并且引入已經(jīng)預裝有分子探針的單孔104。根據(jù)用途，可能需要加熱器來加熱芯片孔中的PCR混合物?？赡苄枰獧z測裝置，例如CCD攝像機或者光電探測器，來測量從孔中發(fā)出的光信號。

下面詳細描述公開的裝置和系統(tǒng)的使用方法。

在一個實施方式中，提供了一種使用此處公開的系統(tǒng)從液體樣品中檢測至少一種目標分子的方法，其中該方法依次包括：(i)用來自包含有目標分子的源的液體樣品填充多個孔；(ii)用來自密封劑源的密封劑填充共用流體通道；(iii)允許檢測探針和目標分子之間在多個孔中進行反應；(iv)檢測由反應產物發(fā)出的信號。

步驟(i)可以包括當流體通道脫離包含可能的目標分子的源時，從真空源抽真空持續(xù)預定時間段；當連接或者斷開真空源時，將包含可能的目標分子的源連接到流體通道的第一端。在某些例子中，可以除去可能存在于微流體裝置內的空氣，例如在多個孔、隔離通道和/或共用流體通道中。例如，在除氣之后斷開真空源的實施例中，來自包含可能的目標分子的源的液體樣品仍可以因保持在微流體裝置之內的真空而填充多個孔。在除氣之后連接真空源的實施例中，步驟(i)的速度可以進一步增加。試劑流動封堵器可以設置在真空源之前，以防止液體樣品接觸真空源。

另外，步驟(i)可以包括當流體通道的第一端連接到包含可能的目標分子的源時，從真空源抽真空。例如，可以除去可能存在于微流體裝置內的空氣，例如在多個孔、隔離通道和/或共用流體通道中的，同時，來自包含可能的目標分子的源的液體樣品可以因抽出的真空而填充多個孔。試劑流動封堵器可以設置在真空源之前，以防止液體樣品接觸真空源。

在步驟(i)中，多個孔可以依次被填充?？椎奶畛淙莘e可能對抽真空的強度不敏感。因此，公開的方法的步驟(i)也許能產生前后一致的結果。此外，步驟(i)可以基本等量地填充多個孔。

在步驟(i)之后、步驟(ii)之前，公開的方法還可以包括，將包含可能的目標分子的源與流體通道斷開的步驟；以及從真空源抽真空持續(xù)預定時間段，以除去流體通道中過量的液體樣品。在一個實施例中，可以從流體通道中除去過量的液體樣品，以便可能的反應產物的檢測只能在孔中進行。在另一個實施例中，可以防止結果錯誤的檢測。

步驟(ii)可以包括當流體通道脫離密封劑源時，從真空源抽真空持續(xù)預定時間段；當連接或者斷開真空源時，將密封劑源連接到流體通道的第一端。例如，可以除去可能保持在共用流體通道之內的液體樣品。例如，在樣品除去之后斷開真空源的實施例中，來自密封劑源的密封劑仍有可能因保持在微流體裝置之內的真空而填充共用流體通道。在樣品除去之后連接真空源的實施例中，步驟(ii)的速度可以進一步增加。密封劑流動封堵器可以設置在真空源之前，以防止密封劑接觸真空源。在一個實施例中，密封劑防止樣品在反應過程中因溫度而蒸發(fā)。此外，密封劑隔離每個孔中的樣品，從而防止相鄰孔之間交叉污染。

密封劑可以是任何類型的可以至少部分阻斷或者防止孔中的液體泄漏以有效隔離孔中的液體的物質。所說的“隔離”，意指特殊的物種或者物質與混合物、樣品或者生物標本分開。例如，孔中的液體在隔離之后可以不失散到環(huán)境中，例如通過蒸發(fā)。例如，在隔離以后，包含在每個孔中的液體不會污染其他孔中的液體。還可以減少導致假陽性發(fā)射讀數(shù)的雜散信號發(fā)射出現(xiàn)。在一個實施例中，沒有出現(xiàn)假陽性或者假陰性。所說的“有效”，意指孔中的液體(包括隔離通道中的液體)與孔外的混合物、樣品或者樣本(例如共用流體通道中的)充分分離。密封劑可以是具有比孔中液體更低的汽化速度的任何類型的材料。密封劑可以是沸點高于孔中液體的任何類型的材料，以便在使用方法的最高工作溫度下保持為穩(wěn)定的液體，并防止水蒸汽的傳輸。密封劑可以是不與孔中液體混溶的任何類型的材料。密封劑可以是不允許孔中液體的蒸氣通過的任何類型的材料。密封劑可以是硅油、蠟、聚合物、明膠、樹膠、淀粉、或者它們的衍生物。

在一個實施例中，密封劑可以是液體蠟。此處使用的術語“蠟”包括諸如棕櫚蠟、坎臺里蠟、蜂蠟、等之類的天然存在的脂肪酸酯，礦物油，以及諸如聚乙烯、石蠟、地蠟、等具有蠟的物理性能的其他有機材料。固體石蠟一般被用于定義通常從來源于混合基或者石蠟基類型的礦物油的石油餾分中獲得的硬結晶蠟，并且可以包括諸如高沸點餾分蠟和微晶蠟之類的材料。

可選地，步驟(ii)可以包括當流體通道的第一端連接到密封劑源時，從真空源抽真空。例如，可以除去可能存在于共用流體通道中的樣品，同時來自密封劑源的密封劑仍有可能因抽得的真空而填充共用流體通道。密封劑流動封堵器可以設置在真空源之前，以防止密封劑接觸真空源。

為增加填充步驟(i)和/或(ii)的速度，密封劑可以從密封劑源泵送到流體通道的第一端，并且/或者可能的目標分子可以從其來源被泵送到流體通道的第一端。正壓可以從包含可能的目標分子的注射器中產生，因此活塞被向內推，以將可能的目標分子泵送到流體通道的第一端。正壓可以從包含密封劑的注射器中產生，因此活塞被向內推，以將密封劑泵送到流體通道的第一端。

在步驟(i)中產生的真空的真空容積可以如此處公開的那樣。例如，步驟(i)中產生的真空的真空容積可能在約5到22毫升之間。

可以按此處公開的速度除去流體通道中過量的液體樣品。例如，可以按30到70微升/分鐘的速度除去流體通道中過量的液體樣品。

在一個實施例中，下面將參照圖3描述圖3的根據(jù)本發(fā)明的實施方式的系統(tǒng)的操作方法。

步驟1:閥142被定位在142b處，而閥146被定位在146a處。泵160如圖所示處于其零容積位置。當活塞162開始沿著箭頭的方向向外移動時，原來包含在流體通道106、隔離通道108和孔104中的空氣被吸出，并且經(jīng)過試劑封堵器158被輸送到泵160。試劑封堵器158和密封劑封堵器156用帶有小孔洞的高疏水性薄膜制造，以阻止液體傳送，但允許氣體通過。

步驟2:閥142被切換到位置142a?，F(xiàn)在，試劑被步驟1產生的真空從試劑容器170抽到流體通道106和各個孔104內。一旦所有孔充滿試劑，額外的試劑到達試劑封堵器158并停在那里。來自壓力檢測器170的信號表明填充過程結束，并且阻止泵工作。

步驟3:閥146被切換到位置146b，以釋放泵中的真空。

步驟4:閥144被定位在144b處，而閥146被切換到位置146c?，F(xiàn)在泵160從其零容積位置慢慢向外移動，并且保持在流體通道106中的試劑被緩緩除去。

步驟5:閥144被切換到位置144a，而閥146被切換到位置146d。密封劑通過流體通道106，以密封所有孔104。一旦密封劑到達密封劑封堵器156，它停在那里，密封過程結束。

在一個備選實施方式中，正壓也可以代替抽真空，被用作芯片填充和密封的驅動力。為此，不需要在步驟1中產生真空。在此情況下，施加于試劑容器上的壓力會推著試劑流進流體通道，然后是隔離通道，并流進孔中?？赡苄枰诳字行纬深~外的出口，以允許原來存在于孔中的空氣逸出。例如，上覆蓋帶可以鉆上小洞，每個小洞對應一個孔。可選地，下覆蓋帶可以用帶有小孔隙(pores)的氣體滲透膜代替。在這兩種情況下，空氣可以離開小洞或者孔隙，但強表面張力有助于防止液體泄漏。在孔被填充之后，可以執(zhí)行步驟4和步驟5，以密封和隔離反應孔。然后密封在孔中的試劑準備進一步反應，例如PCR擴增和檢測。

可以用公開的裝置、系統(tǒng)和方法進行聚合酶鏈反應(PCR)。在一個實施例中，可以用公開的裝置、系統(tǒng)和方法進行聚合酶鏈反應，涉及的溫度小于95℃、小于90℃、小于85℃、或者小于80℃。根據(jù)用途，氣泡可以在80℃或者更高的反應溫度下形成在孔中。在一個實施例中，可以用公開的裝置、系統(tǒng)和方法進行等溫聚合酶鏈反應。如名字暗示的那樣，等溫聚合酶鏈反應在單一溫度下進行，并且不需要常規(guī)聚合酶鏈反應方法中所需的熱循環(huán)。由于不涉及任何熱循環(huán)過程，因此等溫聚合酶鏈反應系統(tǒng)，例如此處公開的裝置和系統(tǒng)，允許簡化的設計和低得多的能量消耗。約有8種等溫聚合酶鏈反應方法，包括最常用的基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、依賴解旋酶擴增(HDA)、滾環(huán)擴增(RCA)和鏈置換擴增(SDA)。在另一個實施例中，可以用公開的裝置、系統(tǒng)和方法進行不對稱聚合酶鏈反應。在又一個實施例中，可以用公開的裝置、系統(tǒng)和方法進行諸如酶聯(lián)免疫吸附試驗之類的抗體化驗、或者分子診斷用途。

等溫聚合酶鏈反應擴增方法的一個實施例是NASBA，它是連續(xù)方法。它在41℃的相對低溫下工作，這使得它非常適合與低功耗手持裝置一起使用，諸如公開的微流體裝置。NASBA擴增方法模擬逆轉錄RNA復制，而不需要熱循環(huán)。在擴增過程中，NASBA使用三種酶：逆轉錄酶、R Nase H和T7DNA依賴型RNA聚合酶。在一個實施例中，NASBA具有高擴增系數(shù)。例如，反應可以用兩個對目標RNA有特效的引物在1.5小時內產生大約十億個互補的RNA分子?？梢杂梅肿有艠藢崿F(xiàn)實時NASBA。

等溫聚合酶鏈反應擴增方法的另一個實施例是依賴解旋酶擴增(HDA)，它基于DNA復制叉的自然機制。HDA方法可以在65℃的唯一溫度下工作。HDA也可以具有高擴增系數(shù)。例如，IsoAmp tHDA試劑盒(新英格蘭生物實驗室(美國比弗利))可以擴增70到130bp的短DNA序列。已經(jīng)在短至85bp以及長至129bp的產物上實現(xiàn)了成功的tHDA擴增。

因此，在一個實施例中，目標分子是擴增反應的反應產物。擴增反應由依賴模板的方法使得核酸分子的濃度相對于其初始濃度增加。術語“模板依賴方法”是指涉及引物分子的模板依賴型延長部分的方法。擴增方法包括但不局限于聚合酶鏈反應(PCR)、DNA連接酶鏈反應和所屬領域技術人員熟知的其他擴增反應。擴增反應的成分包括用于擴增目標核酸的試劑，例如擴增引物、多核苷酸模板、脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽、聚合酶和核苷酸。在一個特殊的實施例中，目標分子是等溫聚合酶鏈反應的反應產物。

公開的裝置和系統(tǒng)可以提供多個孔，用于檢測多個目標。在某些實施方式中，布置成圓形的孔便于光強度從點光源均勻分配于所有孔。通過施加真空于裝置和系統(tǒng)上作為液體流的驅動力，公開的方法可以為孔快速填充液體。在一個實施例中，單個孔可以在8毫秒內填滿，并且不同孔可以獲得均勻的填充容積。裝置和系統(tǒng)的操作已經(jīng)在包括來自HPIV病毒的RNA樣品的NASBA等溫聚合酶鏈反應和來自埃氏大腸桿菌的目標DNA的HDA等溫聚合酶鏈反應的過程中成功得以證明。

此處說明性地描述的發(fā)明可能適合在沒有此處未特別說明的任何元件、限制的情況下實施。因此，例如，術語"包含"、"包括"、"含有"、等等應該擴大且不受限制地理解。另外，此處使用的術語和表達已經(jīng)用作描述的術語而非限制，在使用這些術語和表達時無意排除所示的和所描述的特征或其某些部分的任何等價物，但認為在要求保護的發(fā)明的范圍內可以進行各種改進。因此，應該理解雖然本發(fā)明已經(jīng)由優(yōu)選實施方式和優(yōu)選特征特別公開，但此處公開所體現(xiàn)的發(fā)明的任何改進和變形都可以訴諸于本領域技術人員，并且這些改進和變形被認為落在本發(fā)明的范圍內。

本發(fā)明已經(jīng)在此被廣泛而一般地描述。落在普通公開內的每個較窄的形式和亞屬分組也形成本發(fā)明的一部分。這包括發(fā)明的帶有從該類中除去任何主題的限制條款或者否定限制的一般描述，不考慮刪除的材料在此是否被特別列舉。

其他實施方式在以下權利要求和非限定性實施例的范圍內。另外，如果本發(fā)明的某些特征或者某些方面用馬庫什組來描述，本領域熟練技術人員會認為本發(fā)明也是用馬庫什組的任意單個成分或者各成分的子組來描述的。

實驗部分

實施例1：芯片制備

芯片設計是用CAD軟件Solidworks^TM(Dassault Systèmes SolidWorks公司，法國)生成的。然后用計算機數(shù)控(CNC)機器(WHITS技術，新加坡)制造帶孔的聚碳酸酯基片。制造的PC基片隨后被浸入0.2％的清潔劑(Decon 90，Decon實驗室有限公司，英國)溶液中12小時，隨后用去離子水徹底漂洗，以便從CNC機械加工程序中除去任何油污。接下來，芯片被浸入3％H₂O₂(MGC純化學品，新加坡)中12小時，用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)(Sigma-Aldrich，新加坡)漂洗，以除去RNA酶和DNA酶，然后在60℃下烘干6小時。吸量管尖端(體積：20微升)被切成7毫米長的段，以用作入口管和出口管，并且被粘到流體通道兩端處的兩個孔洞上。光學粘膜(MicroAmp^TM，應用生物系統(tǒng)公司，馬薩諸塞州，美國)被用40瓦的CO₂切割系統(tǒng)(Helix 40，Epilog公司，美國)在20％的激光功率下激光切斷成所需規(guī)格，然后被施加到聚碳酸酯基片的頂面和底面。

實施例2

來自實施例1的芯片被用在這個實施例中。芯片的示意圖被顯示在圖2a中，在這個實施例中參考圖2a。芯片的操作如下。

步驟1。真空注射器160被調整到零容積。入口夾閥152被關閉，同時出口閥154被打開。真空注射器160的活塞162向外移動，產生真空，以從芯片100的通道和孔中除去空氣。注射器的目標容積被調整到2.5、5、10或者15毫升，這取決于隨后的孔填充步驟所需的真空度。如圖2b所示，對應于注射泵的真空容積的孔中的實際壓力被校準。

步驟2。閥152被打開。由于共用流體通道和孔在步驟1中產生真空，因此PCR混合物在0.5秒內移動到芯片100的流體通道內并且按照順序一個接一個地填充各孔。一旦PCR混合物到達芯片100的出口，閥154被關閉，以使芯片100與注射泵160中的真空隔離。由于真空保持在共用流體通道和孔中，因此填充過程繼續(xù)。約10秒之后，當所有孔被完全填充時，閥152也被閉合。

步驟3。具有PCR混合物的艾本德管170被移走。同時，注射泵160中的真空被釋放。然后閥152和154被打開。注射泵160被啟動，并且以50微升/分鐘的低速運行。結果，保持在共用流體通道內的PCR混合物被緩緩地抽出芯片100。然后，另一個包含100微升液體蠟(Bio-Rad，新加坡)的艾本德管(未顯示)被連接到芯片100的入口。隨著從注射器160泵出，硅油逐漸充滿流體通道，而其不溶于水的性質有助于有效地密封芯片100中所有的單獨的孔。

為了研究PCR混合物填充/密封過程的細節(jié)，用高速攝像機(MotionPro X4，DEL成像系統(tǒng)，美國)以600幀/秒的記錄速率監(jiān)視上述過程。用去離子水模擬PCR混合物溶液，外加墨水以改善圖像對比度，以易于觀測。當獲得相應幀時，可以從該時間點處獲得瞬時信息。

接著上述步驟調查PCR芯片的填充/密封過程。

芯片的出口被連接到一個10毫升注射器上，該注射器通過電動注射泵控制。注射器的活塞被向內推到零容積。在開始樣品加載以前，入口和出口夾閥被分別調整到“閉合”和“打開”位置。當活塞開始向外移動時，原來密封在芯片通道和孔中的空氣(環(huán)境壓力＝P₀，容積＝V₀)膨脹。當空氣體積增加到V時，可以根據(jù)理想氣體定律計算通道/孔內的壓力P：

P＝P₀V₀/(V₀+V)

在這個實施例中，注射器的真空容積V被調整到1-10毫升，這產生-79.9到-89.9千帕的真空。在入口夾閥被打開之前，真空被保持10秒壓力穩(wěn)定。在入口閥打開之后，容器中承受壓差(P₀–P)的PCR混合物沿著流體通道移動，并且進入每一個反應孔。圖5a顯示了從用高速攝像機拍攝的影像中得到的樣品加載快照?？梢钥吹搅黧w通道和反應孔內的空氣被外部注射器吸出，然后PCR混合物被引入，以填充流體通道和反應孔。孔被順序填充-入口附近的孔比出口附近的孔被先填充。對于35孔的PCR芯片，填充過程在300毫秒內完成10毫升的真空容積。

每個孔的平均填充容積對所施真空的相關性如圖5b所示。每個孔中液體的體積通過用精密重量天平(AB204-S，Mettler Toledo，美國)測得的重量除以液體密度來計算。發(fā)現(xiàn)填充容積對于為本申請而最優(yōu)化的真空容積的范圍(5-15毫升)不敏感。例如，與5、10和15毫升的真空容積對應的填充容積分別為3.02、3.11和3.06微升。這些值非常接近根據(jù)孔尺寸(直徑＝2.0毫米，深度＝1.0毫米)計算得到的3.14微升的完全充滿的孔中的理論液體容積，表明在樣品加載過程中孔被完全或者幾乎完全充滿。

圖5c顯示了沿著流體通道填充在不同孔中的容積。第一孔具有3.09微升的稍高的填充容積，而最后的孔具有2.99微升的填充容積。它們在填充容積上的差別為3.3％，表明在不同孔的填充上具有優(yōu)良的均勻性。對于流動通道沿線的孔，填充容積僅有非常輕微的下降。這種較小的差別可能起因于填充過程中逐漸下降的真空度，即在稍微低點的真空水平下，下游孔可能填充得稍微少一點。

由于真空可以被輕易地施加到微流體系統(tǒng)上，因此該實施例表明公開的PCR混合物填充方法預計比現(xiàn)有技術的方法更有效，這已經(jīng)通過下面的實驗得到確定。

實施例3a：所施真空度的優(yōu)化

實施例2中公開的PCR混合物填充方法的有效性在這個實施例中被證實。

對真空填充重要的一個參數(shù)是所施加的用于驅動流體的真空度。真空不足會使填充過程減速。這會進一步導致相當多的空氣被圈閉在反應孔中，這可能會因圈閉空氣在高溫下膨脹而造成PCR過程出現(xiàn)故障，引起擴增和檢測上的問題。另一方面，如果真空度是過高，可能會因水在低壓下蒸發(fā)而形成氣泡，這會因阻斷流體和隔離通道而負面影響填充過程。

為了獲得最佳真空度，測試了1-22毫升的真空容積用于樣品加載，并且研究和比較了相應的填充質量。

圖6a顯示了當使用的真空容積不足、小于5毫升時PCR室的照片。如圖6a所示，幾個PCR室沒有完全充滿，如箭頭所示。

另一方面，圖6b顯示了當使用22毫升的真空容積時PCR室的照片，證明氣泡容易形成在流體通道和孔內(如箭頭所示)。在此情況下，一些PCR混合物溶液可能會蒸發(fā)，并且PCR混合物溶液可能會損失。此外，高填充速度也會產生紊流，因而空氣會被圈閉在填充液體內成為氣泡。因此，表明在這個實施例中合適的真空容積在5-15毫升的范圍內。

實施例3b：反應孔的密封優(yōu)化

為了密封和隔離每個PCR孔，研究了液體蠟。圖7顯示了該實施例中的密封程序的進程的照片。

參照圖2a，在PCR混合物被裝入孔104之后，出口夾閥154被關閉，注射泵160中的真空被釋放到大氣中。接下來，夾閥154被再次打開，注射泵160以50微升/分鐘的流速慢慢泵出保持在流體通道106內的PCR混合物。

圖7a到7c顯示PCR混合物的移除進程。在PCR混合物被完全除去之后，液體蠟從入口被引入，并且填充流體通道中的空隙。白色箭頭顯示了流體通道中的PCR混合物和空氣之間的界面。圖7d到7f顯示了液體蠟的引入進程。白色箭頭顯示了液體蠟在流體通道中的位置。PCR混合物被液體蠟密封在反應孔內，不會從奧米伽芯片中蒸發(fā)和逃逸。然后入口閥和出口閥都被關閉，然后整個芯片經(jīng)受PCR熱循環(huán)。

實施例4：實時PCR系統(tǒng)

在本實施例中構造和測試表征實施例1的PCR芯片的實時PCR系統(tǒng)。

示例性PCR系統(tǒng)如圖4a所示。參照圖4a，帕爾貼熱電裝置(TEC)202用于產生PCR反應要求的溫度。鋁冷熱沉204被連接到TEC 202的后側。此外，一個小冷卻風扇206被連接到鋁塊上，以加強冷卻效果。板的溫度用2.252k-Ω的電阻式溫度檢測器(RTD)(Cat.#201347，F(xiàn)erroTec，美國)測量。FerroTec的數(shù)字溫度控制器(FTC100)和H-橋式放大器(FTA600)被用于反饋溫度控制。

開發(fā)了光學系統(tǒng)210，用于在實時PCR系統(tǒng)中檢測SYBR Green I/Eva Green的熒光。來自固態(tài)可轉換光源212(Lumencor，Spectra Light Engine，Lumencor公司，美國俄勒岡州比弗頓)的光通過光纖214(400微米，0.75m UV-SR，海洋光學)傳遞，并用激勵濾光器216(D480/30X，色度技術公司，美國)過濾，以產生480納米的藍色激勵光束。光束被鏡子218反射，然后在垂直位于鏡子下方10厘米處的檢測PCR芯片100上被橫向激發(fā)。從PCR芯片100中的樣品發(fā)出的光被發(fā)射濾光器219(HQ535/50M，色度技術公司，美國)過濾，以在520納米處產生熒光信號。該信號被具有固定焦距的緊湊透鏡(Cat.59871，埃德蒙光學系統(tǒng)，美國)聚焦。透鏡和PCR芯片100之間的工作距離介于15到25厘米之間。聚焦的光隨后被冷卻的CCD攝像機220(Retiga EXi，QImaging，加拿大)檢測，通過分析在某些時間點被攝像機220獲得的圖像，獲得整個芯片上的光強度。

用功率計(841-PE型，新港公司，加州，美國)測量與光軸的各個橫向位移處的光強度(用μW/cm²表示)。數(shù)據(jù)(未顯示)非常契合基于高斯正態(tài)分布的模擬結果(MATLAB，Mathworks公司，美國)(見圖4b)。入射光的功率分布關于光軸軸對稱，并且對于從-15毫米到15毫米的位移——這可與奧米伽芯片的尺寸相比，可以獲得足夠高的強度。假定奧米伽芯片和光強度的高斯分布都是徑向對稱的，結論是當芯片和光學檢測同心設置時，每個孔都會接收相同強度的光。這是本光學檢測系統(tǒng)的重要特征，它允許每個開孔獲得相似的靈敏度。

實施例5：用于病毒檢測的芯片內NASBA擴增

基于核酸序列的擴增(NASBA)被用于在實施例1的芯片上檢測兩種類型的人副流感病毒(HPIV)。

HPIV是兒科病人中上、下呼吸道疾病的主要原因，每年冬季都會爆發(fā)。有4種認定的HPIV血清型：HPIV1、HPIV2、HPIV3和HPIV4，但只有HPIV1和HPIV2常被發(fā)現(xiàn)。在這個實施例中，HPIV1和HPIV2被用于測試目的。

從NucliSens基礎試劑盒(bioMérieux，英國)中選定NASBA所需的試劑。在進行實驗之前，根據(jù)廠家推薦的規(guī)程制備它們。簡單地說，80微升的試劑稀釋液被添加到一個來自試劑盒的試劑球，以制造備用的試劑溶液。將試劑盒中14微升的KCl儲備溶液與16微升的NASBA水混合，來制備備用的KCl溶液。將45微升來自試劑盒的酶稀釋液添加到一個酶球中，制備酶溶液。HPIV1(Cat.VR-94D)和HPIV2(Cat.VR-92D)的RNA分子購買自美國典型菌種保藏中心(ATCC)(美國)。

由于每個孔具有3微升的容積，填充28孔的PCR芯片需要84微升的總樣品容積。因此，制備120微升的PCR混合物來填充和測試，這包括30微升的病毒RNA模板、39微升的試劑溶液、15微升的KCl溶液、30微升的酶溶液和6微升的水。

引物和分子信標探針購買自Eurogentec(Cat.NB-PAI01-48用于使用Fam-Dabsyl分子信標的HPIV1檢測，Cat.NB-PAI02-48用于使用Rox-Dabsyl分子信標的HPIV1檢測)。在芯片組裝過程中，引物被預沉淀到各個孔內。

NASBA化驗涉及連續(xù)的等溫過程，不需要熱循環(huán)。在該實施例中用原始的病毒儲備溶液以及10到10,000倍的稀釋液來測試在芯片中進行NASBA化驗的靈敏度。稀釋的模板與其他組分混合，以制備120微升PCR混合物。為了制備陰性對照，無水的DNA酶和RNA酶被用于代替稀釋的病毒樣品。

用真空將PCR混合物引入奧米伽芯片的孔中，然后如上所述，用液體蠟密封。接下來，整個芯片被安裝到TEC加熱器上，然后在41℃下運行PCR擴增1.5小時。每5分鐘用CCD攝像機獲得芯片的影像。

圖8顯示了原料RNA樣品及其10倍到10,000倍的稀釋液(即在圖8中的濃度為1.00E+01，1.00E+02，1.00E+03和1.00E+04)在奧米伽芯片上的實時檢測中的擴增曲線。在反應約20分鐘以后，除了陰性對照之外，熒光強度開始近似直線增加。對于陽性擴增，到陽性的時間從20分鐘變化到30分鐘。熒光強度的增加速度和輸入模板RNA濃度之間有明確的關系。正如所料，較高的RNA濃度導致信號強度急劇增大。

圖9顯示了在奧米伽PCR陣列芯片上對HPIV1和HPIV2病毒進行同步端點檢測的影像。具有25毫米焦點透鏡的基于彩色Grasshopper2CCD的RGB攝像機(灰點研究公司，加拿大不列顛哥倫比亞省列治文)被用于該實施例。全象限帶通濾波裝置(Semrock公司，美國紐約州羅切斯特)被用作激勵濾光器。如上所述，各孔被預加載Fam-Dabsyl或Rox-Dabsyl分子信標。前者對HPIV1的陽性識別顯示藍色，而后者對HPIV2顯示紅色。HPIV1和HPIV2樣品的1:1體積比的混合物在該實施例中被用作RNA模板。

如圖9所示，從沉淀有Fam-Dabsyl的孔中觀測到深藍色熒光，而從具有Rox-Dabsyl的孔中看到紅色熒光。沒有任何引物的孔(標記有叉號)不顯示任何熒光信號，證實不同孔之間沒有串擾。該研究證明奧米伽PCR陣列芯片可用于同步檢測多個目標。

實施例6a：細菌培養(yǎng)和質粒DNA制備HDA

用于等溫依賴解旋酶擴增(HDA)研究的埃氏大腸桿菌(ATCC25922)從ATCC(美國)獲得。它們在胰蛋白酶大豆發(fā)酵液(TSB)緩沖液(BD，美國)中培養(yǎng)，緩沖液裝在1.5毫升的艾本德管中，管放在41.5℃的熱混合器(熱混合器Comfort，艾本德公司，美國)上。在整夜培養(yǎng)之后，用離心機收集細菌。10微升連續(xù)稀釋的細菌樣品被引入C芯片(DHC-N01，Incyto公司，韓國)，然后用光學顯微鏡的CCD攝像機(IX51，奧林帕斯，美國)捕捉細菌的影像。細菌的數(shù)目從影像中清點，然后計算相應的密度。約103到109個細菌細胞被收集到1.5毫升的管中，用質粒Minit試劑盒(Cat.12143，Qiagen，新加坡)進行質粒DNA提取。

根據(jù)廠商的用戶手冊，提取包括三個主要步驟：(i)細菌細胞溶解和溶解產物收集，(ii)DNA提取和提純，和(iii)DNA洗提。在細菌細胞溶解步驟中，細胞懸浮液在8000轉/分鐘下離心10分鐘。在上清液被除去之后，250微升的緩沖液P1被添加到管中，以使細菌再次懸浮。接下來，添加250微升的緩沖液P2，并通過輕輕地翻轉管子5次而徹底混合。在培育2分鐘之后，添加350微升的緩沖液N3，并通過翻轉管子10次而徹底混合。在細胞溶解步驟之后，溶液在10,000轉/分鐘下離心10分鐘。收集上清液，并轉移到QIAprep回旋柱進行DNA的提取和提純。通過讓溶液在3000轉/分鐘下回旋1分鐘進行DNA提取。DNA分子被固相提取到回旋柱上，而流過的被丟棄。提純過程涉及添加0.75毫升的緩沖液PE到柱上，然后在3,000轉/分鐘下離心1分鐘。在洗提過程中，帶有純化DNA分子的柱子被放在清潔的1.5毫升管中。50微升的緩沖液PE被添加到管中。在培育1分鐘之后，管在3000轉/分鐘下離心1分鐘，然后收集洗提溶液中的純質粒DNA分子，用于下游的等溫HDAPCR擴增。

實施例6b：實時HDAPCR擴增

HDA基于DNA復制叉的自然機制。它可以在65℃的唯一溫度下工作。

來自新英格蘭生物實驗室(美國比弗利)的IsoAmp tHDA-III試劑盒被用作在實施例6a中制備的埃氏大腸桿菌的質粒DNAs的等溫PCR擴增檢測。IsoAmp tHDA試劑盒可以放大70到130bp的短DNA序列。已經(jīng)在短至85bp以及長至129bp的產物上實現(xiàn)了成功的tHDA擴增。

tHDA試劑盒包含PCR擴增所需的試劑，除了DNA模板、正向引物和反向引物。tHDA反應主要包括以下材料：1×退火緩沖液，25×酶混合物，14×dNTP溶液，3-4.5毫摩爾的MgSO4，和20-50毫摩爾的NaCl。在該實施例中，埃氏大腸桿菌DNA的目標M13基因被放大。根據(jù)引物1233和1224(新英格蘭生物實驗室，美國)的序列，正、反向引物分別為5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’和5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。

IsoAmp tHDA試劑盒不提供實時PCR的報告染料。當前，SYBR Green I、Eva Green和LG Green是實時PCR最廣泛使用的報告染料。雖然Eva Green和SYBR Green都可以使用，但先前的研究表明Eva Green具有比其他染料低得多的PCR抑制作用。因此，Eva Green被選作實時HDA的報告染料。

雖然反應孔的液體蠟密封有助于防止氣體逃出芯片，但它不能消除高溫下孔內的水分蒸發(fā)。為了解決這個問題，PCR混合物與一定量甘油預混合，以降低蒸氣壓。根據(jù)拉烏爾定律，水/甘油混合物的蒸氣壓P可以近似為：

P_(T)＝P_W(T)x_W+P_G(T)x_G

其中P_W(T)和P_G(T)分別是水和甘油在溫度T下的蒸汽壓，而x_W和x_G分別是水和甘油的摩爾分數(shù)。水和甘油的分子量分別是18和92；實驗中使用的水和甘油的重量百分數(shù)可以用這些分子量轉換為摩爾分數(shù)。由于在相同溫度下甘油具有比水低得多的蒸氣壓，因此上述方程表明增加甘油可以降低PCR混合物的蒸氣壓。在沸點溫度下，混合物的蒸氣壓等于1大氣壓的環(huán)境壓力。對不同甘油濃度計算的沸點溫度如圖10所示。

已經(jīng)研究過增加5％到20％(w/w)的甘油不會顯著改變熒光強度和PCR的CT值。因此，在該實施例中添加15％(w/w)的甘油到PCR混合物。在該濃度下，混合物的沸點溫度為約103℃。

細菌DNA目標區(qū)特定的正、反向引物對被預加載到各孔內。用真空將PCR混合物引入奧米伽芯片的孔中，然后如上所述，用液體蠟密封。

從約10³、10⁵、10⁷和10⁹個細菌細胞中提取的質粒DNA被引入4個不同的芯片，然后經(jīng)受等溫PCR擴增。每2分鐘記錄一次來自各個孔的熒光信號。結果顯示在圖11中。如圖11所示，約27分鐘之后，PCR擴增變得非常明顯。對于不同細菌濃度的提取液，所需的時間沒有顯著差異，這表明HDA可能不適合埃氏大腸桿菌的定量檢測。

熒光信號的一致性在基因的定量檢測中很重要。為了核對奧米伽PCR中的檢測一致性，預加載相同量的引物，并且真空填充相同的PCR混合物(包括從109個細菌細胞中提取的DNA樣品)到每個孔中。在65℃下HDA40分鐘之后，被捕捉的端點熒光信號被顯示在圖12a中。用ImageJ軟件(NIH，美國)定量測量逐孔的信號強度，并且測量結果標繪如圖12b所示。28個孔的信號強度讀數(shù)從1208變到1533。28個孔的平均信號強度為1454，標準偏差為±93，這是平均信號強度的約6.3％，表明熒光信號完全均勻地分布在不同孔之間。