本發(fā)明屬于農(nóng)藥分析檢測，具體涉及一種拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、赭曲霉毒素a(ochratoxin，ota)是曲霉菌屬或青霉菌屬產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，具有很強的腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。因其較為穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，使其在食品加工過程中難以被有效去除。ota廣泛存在于谷物、水果、牛奶、咖啡豆等多種食品原料及其制品中，攝入受污染的食物會對人體多個組織造成損害。同時，ota有較強的熱穩(wěn)定性，在食品加工過程中難以被去除。我國也制定了嚴格的衛(wèi)生標準，規(guī)定谷物、豆類及其制品中的赭曲霉毒素的限量定為5μg/kg，葡萄酒等酒類中則不得超過2μg/kg。實現(xiàn)對ota的靈敏和快速檢測是及早發(fā)現(xiàn)和降低ota污染的關(guān)鍵。

2、目前，針對檢測農(nóng)產(chǎn)品和食品中ota的研究已有大量報道，主要檢測方法主要包括高效液相色譜(hplc)、熒光光譜分析、毛細管電泳、試紙條法、免疫分析和表面增強拉曼散射(sers)。色譜法的操作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作大型儀器；熒光光譜分析的穩(wěn)定性和準確性仍需進一步優(yōu)化，且操作繁瑣；毛細管電泳法雖然檢測方法簡單省時，但是由于毛細管內(nèi)徑較薄，導(dǎo)致柱內(nèi)反應(yīng)不夠徹底，需要進一步改進。免疫分析法中的酶聯(lián)免疫分析法靈敏度和準確度較低，且抗原抗體孵育時間較長。而傳統(tǒng)的sers檢測方法不容易出現(xiàn)信號。因此，開發(fā)一種快速準確、操作簡單、成本低的檢測方法，對谷物中的ota進行實時有效的檢測是十分必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中ota檢測方法中存在的問題，本發(fā)明提供一種拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球，可以基于分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的表面增強拉曼光譜非標記檢測谷物中赭曲霉毒素a，從而實現(xiàn)對ota的定量檢測，利用本發(fā)明微球的檢測方法特異性和重復(fù)性良好、靈敏度高、線性范圍寬且檢測限低，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中ota檢測操作步驟繁瑣，儀器設(shè)備昂貴，試劑消耗量大，檢測限較高且耗時長等問題。

2、本發(fā)明利用微流控自組裝制備出大小均一、排列整齊、結(jié)構(gòu)色一致的光子晶體微球，具有孔道結(jié)構(gòu)有序、比表面積大、可回收且易于修飾等優(yōu)點，因此其獨特的結(jié)構(gòu)被認為是理想的載體或生物分子檢測平臺，其大比表面積非常適合結(jié)合膠體金，再加入ota的假模板、功能單體和交聯(lián)劑結(jié)合分子印跡層，制備的光子晶體微球可特異性吸附檢測ota，通過拉曼檢測儀器收集拉曼信號，根據(jù)拉曼信號的變化得出線性關(guān)系，即根據(jù)分子印跡結(jié)合目標物的量引起的拉曼信號的強弱變化得到與赭曲霉毒素a含量之間的線性關(guān)系。

3、本發(fā)明還提供所述拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的制備方法和應(yīng)用。

4、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球，所述分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球以表面羥基化和氨基化的二氧化硅微球為基底，在其表面結(jié)合包括膠體金、雙功能單體以及和待檢測毒素結(jié)構(gòu)類似的假模版。本發(fā)明通過表面分子印跡策略利用雙功能單體和假模板合成能夠特異性識別赭曲霉毒素a的分子印跡層。

5、其中，所述雙功能單體為aptes和ptmos，所述待檢測毒素結(jié)構(gòu)類似的假模版為f-d-phe。其中，雙功能單體讓分子印跡層的結(jié)合更加穩(wěn)定，同時增強拉曼信號。假模版形成分子印跡空腔，以便有選擇性地去結(jié)合所測毒素。

6、本發(fā)明所述的拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的制備方法，包括如下步驟：

7、(1)制備磁性反蛋白石二氧化硅光子晶體微球，對微球表面進行羥基化和氨基化修飾；

8、(2)將修飾后的光子晶體微球表面結(jié)合膠體金；

9、(3)將結(jié)合膠體金的微球加入到假模板、雙功能單體以及交聯(lián)劑中，制備拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。

10、其中，步驟(2)中將經(jīng)過羥基化和氨基化的1-2mg微球加入濃縮5-20倍的1-2ml膠體金溶液，浸沒微球，在室溫條件下以100-200rpm的轉(zhuǎn)速震蕩5-25min，震蕩結(jié)束后清洗多余未結(jié)合的aunps。所述濃縮即通過在離心機中以10000rpm離心10min，棄去部分上清液，得到高倍數(shù)膠體金溶液。

11、作為優(yōu)選，步驟(2)中所述經(jīng)過羥基化和氨基化的2mg微球加入1ml濃縮5倍的膠體金溶液，浸沒微球，在室溫條件下以200rpm的轉(zhuǎn)速震蕩20min。

12、其中，步驟(3)中向假模板中加入雙功能單體進行攪拌，然后加入交聯(lián)劑，加入結(jié)合膠體金的微球并在25℃下攪拌48小時；去除模板和未反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，得到拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。

13、作為優(yōu)選，步驟(3)中向假模板中加入雙功能單體進行攪拌，然后加入交聯(lián)劑，加入結(jié)合膠體金的微球并在25℃下攪拌48小時。使用甲醇-乙酸(9:1，v/v)溶液去除模板和未反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，得到拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。

14、其中，步驟(3)中假模板、雙功能單體與結(jié)合膠體金的微球的摩爾比為1：2-8:5-20。

15、進一步地，步驟(3)中假模板、雙功能單體與結(jié)合膠體金的微球的比例為f-d-phe:aptes:ptmos:teos＝0.1mmol:0.2mmol:0.4mmol:1mmol。

16、本發(fā)明所述的拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球在赭曲霉毒素a非標記檢測中的應(yīng)用。

17、其中，所述將含有赭曲霉毒素a的待測物加入拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球進行反應(yīng)，反應(yīng)后通過表面增強拉曼光譜儀器采集微球表面的拉曼信號，對拉曼光譜儀采集到的光子晶體微球表面的拉曼信號進行定量分析，建立拉曼強度和目標物分子濃度的線性關(guān)系，對赭曲霉毒素a進行定量非標記檢測。

18、其中，所述反應(yīng)條件為1030℃，100-200rpm，反應(yīng)10-50min，線性范圍為0.1-1000ng/ml，檢測限為0.078ng/ml，該拉曼增強基底至少可以重復(fù)使用5次。

19、作為優(yōu)選，反應(yīng)條件為25℃，160rpm，反應(yīng)20min。

20、本發(fā)明利用微流控自組裝制備出大小均一、排列整齊、結(jié)構(gòu)色一致的光子晶體微球，具有有序孔道結(jié)構(gòu)、大比表面積、靈活的表面功能化、可回收且易于修飾等優(yōu)點。本發(fā)明的微球表面固定膠體金分子以及包裹分子印跡層；將濃縮5倍的膠體金溶液加入活化的微球中，能夠有效結(jié)合在微球表面并且使拉曼信號顯著增強。加入與ota結(jié)構(gòu)相似的假模板f-d-phe、雙功能單體aptes、ptmos以及交聯(lián)劑teos以制備分子印跡。所述光子晶體微球其表面結(jié)合膠體金并包裹分子印跡層，將其與含有目標物的溶液進行特異性反應(yīng)，根據(jù)光子晶體微球表面結(jié)合目標物的量引起的拉曼信號的強弱變化得到與ota含量之間的線性關(guān)系。

21、其中，所述分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球直徑約為200μm。

22、作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的制備方法，包括如下步驟：

23、(1)制備磁性反蛋白石二氧化硅光子晶體微球，采用雙氧水與濃硫酸的混合液對光子晶體微球進行羥基化，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷對微球表面進行氨基基團的修飾；

24、(2)將修飾后的光子晶體微球表面結(jié)合膠體金；

25、(3)將結(jié)合膠體金的微球加入假模板f-d-phe，后加入雙功能單體aptes、ptmos和交聯(lián)劑teos，制備分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。

26、本發(fā)明首先將使用食人魚溶液和5％aptes-甲苯溶液對微球表面羥基化和氨基化，再加入濃縮5倍的膠體金溶液，放置于搖床震蕩20分鐘，制備表面結(jié)合上膠體金的光子晶體微球，拉曼信號主要來自光與金表面相互作用產(chǎn)生的電磁場。進一步，向圓底燒瓶中加入0.1mmol的假模板(f-d-phe)、4ml乙醇和8ml水，再加入0.2mmolaptes、0.4mmolptmos以及1mmolteos。最后，加入10mg制備的結(jié)合膠體金的光子晶體微球并在25℃下攪拌48小時，所制備的分子印跡層能夠吸附更多的目標物從而使拉曼信號增強效果更加顯著，增強因子ef＝2.67×107。

27、將本發(fā)明制備拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球排列在載玻片上，通過表面增強拉曼光譜儀器(電流強度550ma)采集微球表面的拉曼信號，讀取記錄下拉曼信號強度。

28、其中，拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球能夠特異性識別并吸附谷物中的赭曲霉毒素a，將微球加入待測物中(2μl/球)，置于搖床在25℃震蕩反應(yīng)20分鐘，反應(yīng)后將光子晶體微球放在載玻片上并置于顯微鏡上，再通過表面增強拉曼光譜儀器采集微球表面的拉曼信號，利用origin軟件數(shù)據(jù)處理工具對拉曼光譜儀采集到的光子晶體微球表面的拉曼信號進行定量分析，建立拉曼強度和目標物分子濃度的線性關(guān)系。

29、其中，本發(fā)明檢測的毒素ota檢測結(jié)果的線性范圍分別為10-1-103ng/ml，檢測限為0.078ng/ml。其通過乙腈(2μl/球)洗脫結(jié)合物，可重復(fù)利用不少于5次，且不會明顯降低拉曼信號強度，誤差不超過15％。使用相同的方法制備不同批次分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球，任意批次分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球均可以選擇性地結(jié)合ota并在1336cm-1處顯示穩(wěn)定的拉曼信號，且誤差僅為6.26％。

30、進一步地，統(tǒng)計分析了在3種實際樣品(小麥、大米和玉米)中運用該方法時的批內(nèi)誤差和批間誤差，所述實際樣品前三天的批內(nèi)誤差范圍分別為5.63％～8.33％，5.76％～9.37％，4.27％～8.80％，整體批間誤差范圍小于10％。

31、進一步地，本發(fā)明制備的拉曼信號增強的分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球非標記檢測谷物中赭曲霉毒素a，其檢測步驟如下：

32、步驟一：使用微流控自組裝平臺制備磁性反蛋白石光子晶體微球。

33、步驟二：磁性二氧化硅光子晶體微球表面的化學(xué)修飾，采用雙氧水與濃硫酸的混合液以及5％aptes-甲苯溶液對步驟一制備的光子晶體微球進行羥基化和氨基化。

34、步驟三：光子晶體微球表面結(jié)合膠體金。

35、步驟四：向圓底燒瓶加入一定量的假模板f-d-phe，后加入雙功能單體aptes、ptmos以及交聯(lián)劑teos，最后加入一定量微球，得到分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。

36、步驟五：采用步驟四所制備的光子晶體微球與目標物在離心管中進行特異性結(jié)合，置于搖床震蕩反應(yīng)。

37、步驟六：微球拉曼信號的檢測，經(jīng)過步驟五的光子晶體微球反應(yīng)后取出排列于載玻片上并放置在拉曼光譜儀中進行檢測。采集微球表面的拉曼信號后利用origin軟件數(shù)據(jù)處理工具對試紙卡采集到的光子晶體微球表面的拉曼信號進行定量分析，建立拉曼信號和ota濃度的線性關(guān)系，其中采用拉曼信號的平均值作為指標進行定量。

38、其中，步驟一制備光子晶體微球時，乳液的配方為正硅酸乙酯：二氧化硅：四氧化三鐵＝20：4：1＝4ml：0.8ml：0.2ml，制備光子晶體微球所需微流注射泵的參數(shù)為：油相8ml/h，乳相5ml/h，乳液作為乳相，甲基硅油作為油相。制成得微球用盛有甲基硅油的塑料板收集，并于60℃的電熱鼓風干燥箱中烘48小時。后用正己烷、乙醇清洗微球，再置于通風櫥揮發(fā)掉乙醇，最后放置在馬弗爐中700℃高溫煅燒進行固化。

39、其中，步驟二中取步驟一中制備好的二氧化硅光子晶體微球，加入食人魚溶液(按雙氧水與濃硫酸7:3配制)，置于室溫下180rpm反應(yīng)6小時，采用雙蒸水清洗3次，于100℃電熱鼓風干燥箱中烘2-3小時，除去多余水分；再將光子晶體微球浸泡于5％的aptes-甲苯溶液中，置于60℃下180rpm反應(yīng)6小時，對微球進行氨基基團的修飾，再依次采用甲苯、無水乙醇、雙蒸水各清洗3次，于100℃電熱鼓風干燥箱中烘2-3小時，除去多余水分。

40、其中，步驟三取步驟二烘干的二氧化硅光子晶體微球，加入濃縮5倍的膠體金溶液，在室溫下震蕩20分鐘，震蕩結(jié)束后用雙蒸水清洗3-4遍多余未結(jié)合的膠體金。

41、其中，步驟四所述分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球的制備時，向圓底燒瓶中加入0.1mmol的假模板(f-d-phe)、乙醇和水，并置于磁力攪拌器上，以800rpm的速度攪拌10分鐘。然后，加入雙功能單體0.2mmolaptes和0.4mmolptmos攪拌30分鐘。然后加入交聯(lián)劑1mmolteos。最后，加入10mg步驟三制備的光子晶體微球并在25℃下攪拌48小時。使用甲醇-乙酸(9:1，v/v)溶液去除模板和未反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，得到分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球。最后，分子印跡磁性反蛋白石光子晶體微球用純乙醇洗滌以去除殘留的乙酸，并在室溫下儲存。

42、其中，步驟五特異性結(jié)合時，先將10顆微球和20μl待測物分別加入200ul離心管中，放入搖床中以25℃，160rpm反應(yīng)20min。

43、其中，步驟六進行拉曼檢測時，電流強度為550ma，激發(fā)波長為784.4nm。通過收集拉曼信號，讀取記錄下拉曼信號響應(yīng)值，再利用origin軟件數(shù)據(jù)處理工具對采集到的光子晶體微球表面的拉曼信號進行定量分析。

44、進一步地，所述光子晶體微球經(jīng)過上述處理可以在較短時間內(nèi)簡單高效、特異性、快速地完成檢測待測物中的ota。

45、本發(fā)明利用微流控自組裝制備出大小均一、排列整齊、結(jié)構(gòu)色一致的光子晶體微球，并在其表面修飾上膠體金，在結(jié)合上膠體金的光子晶體微球中加入一定比例的假模板、雙功能單體和交聯(lián)劑，結(jié)合上分子印跡層，制成反蛋白石光子晶體微球。將微球與樣品中ota置于同一反應(yīng)體系中，即可進行特異性結(jié)合。根據(jù)微球表面結(jié)合ota的拉曼強度變化得出線性關(guān)系，從而實現(xiàn)對ota的定量檢測。本發(fā)明結(jié)合了拉曼光譜和分子印跡的特性，檢測成本低、操作簡單、靈敏度高、識別率高，所需樣品量少，滿足快速即時檢測實際樣品。

46、本發(fā)明針對現(xiàn)有真菌毒素檢測操作步驟繁瑣，儀器設(shè)備昂貴，試劑消耗量大，靈敏度不夠且耗時長等問題，本發(fā)明在現(xiàn)有報道中利用光子晶體微球為載體的單個微球級別的檢測基礎(chǔ)上，結(jié)合表面拉曼增強光譜的特點，將單個微球的檢測路徑轉(zhuǎn)移到簡單易操作的拉曼儀器中，來提高了檢測效率，實現(xiàn)了檢測工具的高靈敏度和可重復(fù)利用。

47、本發(fā)明首先利用微流控自組裝制備出大小均一、排列整齊、結(jié)構(gòu)色一致的磁性反蛋白石光子晶體微球，該材料具有有序孔道結(jié)構(gòu)、大比表面積、靈活的表面功能化且易于修飾等優(yōu)點，并且其自身沒有拉曼信號干擾，因此其獨特的結(jié)構(gòu)被認為是理想的載體或生物分子篩選平臺，其表面非常適合來包被膠體金和分子印跡層，，將微球與樣品中ota置于同一反應(yīng)體系中，即可進行特異性結(jié)合。根據(jù)微球表面結(jié)合ota的拉曼強度變化得出線性關(guān)系，從而實現(xiàn)對ota的定量檢測。本發(fā)明微球表面進行活化以固定膠體金并通過假模板、雙功能單體和交聯(lián)劑制備分子印跡層。采用的微球具有有序孔道結(jié)構(gòu)、大比表面積，能夠更穩(wěn)定地結(jié)合膠體金。本發(fā)明使用ptmos和aptes作為雙功能單體，較以往常用的單功能單體，能夠顯著增加分子印跡層結(jié)合目標物的能力，使拉曼信號增強，本發(fā)明在aptes與teos和ptmos共聚形成三維硅膠骨架，確保mip的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。aptes和ptmos分別提供極性基團(氨基)和非極性基團(苯環(huán))，形成互補的分子識別位點，協(xié)同增強對赭曲霉毒素a(ota)的結(jié)合能力，本發(fā)明圖5表示了單功能單體(aptes)、雙功能單體(aptes和ptmos)的效果。通過加入與ota毒素結(jié)構(gòu)類似的f-d-phe作為假模板，能夠制成分子印跡空腔并且有選擇性地結(jié)合目標毒素，根據(jù)拉曼信號的強度變化得出檢測線性關(guān)系，實現(xiàn)對赭曲霉毒素a的定量檢測。本發(fā)明微球具有磁性，易于回收，可實現(xiàn)重復(fù)利用。該檢測方法特異性和重復(fù)性良好、靈敏度高、線性范圍寬且檢測限低，可用于實時快速檢測目標物。

48、本發(fā)明重點將雙功能單體分子印跡結(jié)合在反結(jié)構(gòu)光子晶體微球去特異性檢測ota，通過將ota結(jié)構(gòu)相似的f-d-phe作為分子印跡的假模板，經(jīng)過洗脫后能夠特異性結(jié)合待測物中的ota，實現(xiàn)ota的有效檢測。并且檢測完的微球還能夠使用磁鐵快速回收，實現(xiàn)了檢測工具的可重復(fù)利用。本發(fā)明通過優(yōu)化了膠體金的濃縮倍數(shù)，并將其結(jié)合在微球上，從而能夠產(chǎn)生顯著的拉曼信號并保持穩(wěn)定，提高本發(fā)明準確性和可行性。相較于傳統(tǒng)的使用單功能單體結(jié)合分子印跡層，本發(fā)明首次提出采用雙功能單體制成分子印跡并結(jié)合在微球表面，能夠顯著增加分子印跡層結(jié)合目標物的能力，并使拉曼信號增強。目前本方法快速高效檢測ota，后續(xù)還可以根據(jù)需求進行其他毒素的分子印跡層的合成，增加毒素種類檢測數(shù)量。本發(fā)明制備的微球吸附能力強，尺寸均一，且穩(wěn)定準確。本發(fā)明的檢測方法操作簡便、響應(yīng)速度快、成本低，能夠廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。

49、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

50、(1)相較于傳統(tǒng)的在正結(jié)構(gòu)微球表面結(jié)合分子印跡，本發(fā)明采用的反結(jié)構(gòu)光子晶體微球具有表面靈活、具有獨特的有序孔道結(jié)構(gòu)、較大的比表面積作為基底，能更好地結(jié)合上分子印跡從而吸附更多待測物中的ota，提高了檢測的靈敏度。

51、(2)本發(fā)明所使用的膠體金，具有結(jié)合牢固、顯著增強拉曼信號且信號穩(wěn)定等優(yōu)點，從而提高本發(fā)明的準確性和可行性。

52、(3)本發(fā)明所使用的微流控自組裝裝置，具有極高的可控性、試劑消耗少、反應(yīng)速度均勻等諸多優(yōu)勢，能夠產(chǎn)生具有可控尺寸、組成和結(jié)構(gòu)的乳狀液滴，并且可以使得液滴在液體環(huán)境中穩(wěn)定存在，在外界環(huán)境的變化下可以自組裝成均勻可調(diào)的光子晶體微球。

53、(4)檢測過程操作簡單安全，收集信號的速度快，大大提高了檢測效率。具有成本低、檢測快速、操作簡單等優(yōu)點，

54、(5)拉曼光譜儀收集拉曼信號并用origin使得實驗結(jié)果實現(xiàn)數(shù)字化，并根據(jù)特異性、準確性、精密度、靈敏度和線性范圍評估其性能，得出該檢測方法特異性強、靈敏度高且線性范圍寬，可快速檢測目標，能夠廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。

55、(6)本發(fā)明檢測方法最后微球能夠通過磁鐵快速回收，回收過的微球經(jīng)過處理可重復(fù)利用，相對于現(xiàn)有的傳統(tǒng)檢測方法更加環(huán)保，符合可持續(xù)發(fā)展的理念。

56、(7)本發(fā)明所制備微球經(jīng)過乙腈洗脫ota可重復(fù)利用不少于5次，且不會明顯降低拉曼信號強度。使用相同的方法制備不同批次微球，任意批次微球均可以選擇性地結(jié)合ota并顯示穩(wěn)定的拉曼信號，且誤差較小，具有重復(fù)性高且再現(xiàn)性良好的優(yōu)點。