專利名稱：保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測白藜蘆醇含量的方法，特別是涉及應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜儀檢測保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(英文名稱為Resveratrol)化學(xué)名:(E)_5-[2-(4_輕苯基)-乙烯基]-1, 3-苯二酌.;3,5,4，’ -三輕基苗;苗三酌.;Trans-3_4’ -trihydroxystiIbene ;分子式:C14H1203 ;分子量:228.25。物理性質(zhì):無味、白色晶體粉末；難溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有機(jī)溶劑。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，可預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。抑制腫瘤的作用還具有雌激素樣作用，可用于治療乳腺癌等疾病。延緩衰老、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心腦血管、抗腫瘤活性、抗菌抗病毒、抗肝炎、白藜蘆醇通過抑制血小板凝集和降低血脂的雙重作用預(yù)防心血管疾?。粶p少心肌損傷和慢性缺血。具有降低血清膽固醇和甘油三酯在肝臟中沉積的功能；明顯提高血清中高密度脂蛋白水平和抑制低密度脂蛋白氧化的作用。對PRL腺瘤有治療和預(yù)防雙重作用，在T細(xì)胞白血病藥物治療中也具有潛在應(yīng)用價值。植物來源:白藜蘆醇是蒽醌萜類化合物，現(xiàn)階段市場主要來源之一為于寥科植物虎杖的根莖提取物。虎杖:多年生灌木狀草本，高達(dá)I米以上。根莖橫臥地下，木質(zhì)黃褐色，節(jié)明顯。莖直立，圓柱形，表面無毛，散生著多數(shù)紅色斑點(diǎn)，中空。單葉互生，闊卵形至近圓形,長7-12cm,寬5-9cm,先端短尖,基部圓形或楔形；葉柄長1_1.5cm托鞘膜質(zhì),褐色,早落?；ㄆ?-9月，果期9-10月，春秋均可采挖，切斷，曬干。多生于山谷、溪旁或岸邊。分布去國中部及南部，產(chǎn)于江蘇、浙江、江西、福建、山東、河南、陜西、四川等地。另一市場主要來源為葡萄穗軸，是葡萄酒廠的下腳料。因其成本極其低廉，且提取物不含有害添加成分，而逐漸為市場所接受。檢測食品和保健品中白藜蘆醇含量現(xiàn)有的方法主要有以下幾種:1、氣相色譜法用乙酸乙酯萃取法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，以硅烷化試劑對萃取物進(jìn)行衍生。用GC進(jìn)行定性與定量分析。其缺點(diǎn)就是衍生化形成的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成較大困難；在衍生化過程中，容易引入雜質(zhì)或干擾峰，或使樣品損失。2、高效液相色譜法(HPLC法)用乙酸乙酯萃取法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，但無需衍生化，相對步驟繁瑣，且白藜蘆醇的異構(gòu)化會導(dǎo)致測定失真。失真原因是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著對照品在紫外光下的照射，反式白藜蘆醇的色譜峰面積逐漸降低，而順式白藜蘆醇的色譜峰面積逐漸增大
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的測定步驟繁瑣、耗時長且白藜蘆醇在紫外線照射下的異構(gòu)化會導(dǎo)致測定結(jié)果失真的不足，提供一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，包括如下步驟:(I)稱取待測樣品0.1-0.5g于錐形瓶中，加入40_60mL甲醇,于超聲波水浴中處理20min,靜置冷卻至室溫,在5000r/min離心5分鐘,用快速定性濾紙過濾,濾液用甲醇定容至 IOOmL ；(2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液；(3)將所述待測樣液注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；(4)精確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；將所述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,
0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)將步驟(3)獲得的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；所述HPLC條件:流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B: IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫；進(jìn)樣量:IOyL;柱溫:35°C；流速:0.3mL/min ；所述MS/MS條件:電離方式:電噴霧電離，正離子ESr ;毛細(xì)管電壓:3.5kV;離子源溫度:110°C;錐孔氣:氮?dú)猓?0L/Hr ；脫溶劑氣:氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C ；碰撞氣:IS氣；掃描模式:多反應(yīng)檢測MRM模式。本發(fā)明的有益效果是:HPLC-MS_MS技術(shù)靈敏度高，選擇性和特異性好，不僅可對樣品中低濃度的多藥物殘留進(jìn)行定性確認(rèn)，克服樣品基質(zhì)干擾，而且能夠有效排除假陽性，進(jìn)行功能性食品中殘留物準(zhǔn)確的定量分析。本發(fā)明的方法準(zhǔn)確度好、精度高、線性良好，且便于開展保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定。白藜蘆醇鑒別實(shí)驗(yàn)的方法，因成分含量都很低，部分可能超出氣相色譜和液相色譜儀器的最小檢出限，所以開發(fā)高效液相色譜-質(zhì)譜儀高精密度的方法將能更有效的輔助檢測這些成分。與氣相色譜法相比減少了衍生化的步驟，減少了引入干擾介質(zhì)的可能；與液相色譜法相比，減少了沸水浴回流提取的步驟，且因高效液相色譜-質(zhì)譜檢測原理，樣液以及對照品都不會有紫外光的照射，不會發(fā)生液相紫外檢測器或二極管陣列檢測器紫外光照射引起的檢測失真。


圖1為實(shí)施例1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜質(zhì)譜圖。圖2為實(shí)施例1的樣品液相色譜質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本發(fā)明內(nèi)容所做的等同替換或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1(I)以葡萄籽提取物為待測樣品，稱取待測樣品0.5g于IOOmL容量瓶中，加入40mL甲醇溶解，于超聲波水浴中處理20min，靜置冷卻至室溫，用離心機(jī)5000r/min離心5分鐘，用快速定性濾紙過濾，濾液用甲醇定容至刻度，搖勻；(2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液；(3)將待測樣液注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；(4)精確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品IOmg于IOOmL容量瓶，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；將所述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,
0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)將步驟(3)獲得的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；所述HPLC條件:a)色譜柱:XTerra MS C18,1 SOmmX 2.1mm, 5 μ m ;b)流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B =IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫；c)進(jìn)樣量:IOyL;d)柱溫:35°C ;e)流速:0.3mL/min ；所述MS/MS條件:a)電離方式:電噴霧電離，正離子ESI_。b)毛細(xì)管電壓:3.5kV。c)離子源溫度:110°C。d)錐孔氣:氮?dú)猓?0L/Hr。e)脫溶劑氣:氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C。f)碰撞氣:IS氣。g)掃描模式:多反應(yīng)檢測MRM模式。見圖1和圖2 ;其中取184.9m/z子離子用于定量。表I化合物的離子對和電壓
權(quán)利要求
1.一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，其特征是包括如下步驟: (1)稱取待測樣品0.1-0.5g于錐形瓶中，加入40-60mL甲醇，于超聲波水浴中處理.20min,靜置冷卻至室溫,在5000r/min離心5分鐘,用快速定性濾紙過濾,濾液用甲醇定容至 IOOmL ； (2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液； (3)將所述待測樣液注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測； (4)精確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；將所述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL，0.2 μ g/mL,.0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，用反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；得到標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5)將步驟(3)獲得的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度； 所述HPLC條件: 流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B =IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫； 進(jìn)樣量:10μL; 柱溫:35°C ；流速:0.3mL/min ； 所述MS/MS條件: 電離方式:電噴霧電離，正離子ESI_ ； 毛細(xì)管電壓:3.5kV ； 離子源溫度:110°C ; 錐孔氣:氮?dú)猓?0L/Hr ； 脫溶劑氣:氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C ； 碰撞氣:気氣； 掃描模式:多反應(yīng)檢測MRM模式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，步驟稱取待測樣品加入甲醇，于超聲波水浴中處理，靜置冷卻至室溫，離心，過濾，濾液用甲醇定容；用甲醇稀釋成待測樣液；注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；精確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用甲醇分別稀釋，配成0.1μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL，0.8μg/mL，1μg/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；將獲得的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；本發(fā)明的方法準(zhǔn)確度好、精度高、線性良好，且便于開展保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定。
文檔編號G01N30/88GK103105448SQ20111036157
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者趙曉娟, 李星芝, 孫俊峰 申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司, 天獅集團(tuán)有限公司, 天津天獅生命源有限公司