專利名稱：一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，特別涉及一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著沿海經(jīng)濟(jì)的高速增長(zhǎng)和對(duì)外貿(mào)易的加強(qiáng)，港口的建設(shè)和遠(yuǎn)洋運(yùn)輸能力不斷增強(qiáng)，沿海水域富營(yíng)養(yǎng)化急劇增加。有毒、有害赤潮呈不斷上升的趨勢(shì)，造成沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重大經(jīng)濟(jì)損失。有毒、有害赤潮的研究亦成為國(guó)際赤潮與海洋環(huán)境研究領(lǐng)域重要的議題和內(nèi)容?，F(xiàn)場(chǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，1997年10月間發(fā)生在廣東饒平柘林灣的球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)赤潮使該灣養(yǎng)殖的魚類全部死亡,損失達(dá)六千萬(wàn)人民幣；2005年 5月間發(fā)生在湛江港養(yǎng)殖區(qū)的同種赤潮，僅引起少數(shù)魚類死亡，在渤海灣發(fā)生的同種赤潮對(duì)魚類也沒(méi)有毒性。上述現(xiàn)象均說(shuō)明環(huán)境因子可能影響著藻類毒素的生成。魚毒性赤潮藻溶血毒素毒性很強(qiáng)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難快速檢測(cè)該藻是否具魚毒性，且測(cè)定結(jié)果在時(shí)間上明顯滯后。當(dāng)毒性實(shí)驗(yàn)完成時(shí)，赤潮災(zāi)害或許已經(jīng)發(fā)生，雖然在某種程度上這些方法可以避免人類中毒，在保障海產(chǎn)品食用安全方面發(fā)揮一定作用，但不能化解和減少因赤潮毒素對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。只有從毒素源頭上入手，及時(shí)、準(zhǔn)確的預(yù)報(bào)產(chǎn)毒生物的消長(zhǎng)情況，才有可能從根本上克服赤潮毒素對(duì)人類的威脅、減少因之帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。赤潮毒素主要來(lái)源于赤潮藻，因此迫切需要建立快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)毒藻株鑒別技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)赤潮的應(yīng)急監(jiān)測(cè)。三維熒光光譜法是近二十年發(fā)展起來(lái)并趨于成熟的熒光分析技術(shù)。該方法具有檢測(cè)速度快、簡(jiǎn)單易攜、高靈敏度的特點(diǎn)。目前被廣泛應(yīng)用于油種鑒別、水體檢測(cè)以及中藥鑒別等分析領(lǐng)域。目前國(guó)內(nèi)外尚未有人利用三維熒光分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)魚毒性赤潮藻溶血毒素活性的大小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法，包含以下步驟(I)通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定藻細(xì)胞樣品的三維熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為400 600nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為650 750nm，得到藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)；(2)將藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TXT文件格式，根據(jù)Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對(duì)其三維熒光光譜進(jìn)行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；(3)在波長(zhǎng) λ Em = 650 700nm，波長(zhǎng) λ Em = 725 750nm，波長(zhǎng) λ Ex = 400 425nm出現(xiàn)與藻類的溶血活性強(qiáng)弱一致的熒光強(qiáng)度變化，初步判斷所檢測(cè)的藻細(xì)胞樣品為魚毒性赤潮藻；若在波長(zhǎng)λ Em = 650 700nm，波長(zhǎng)λ Em = 725 750nm，波長(zhǎng)λ Ex = 400 425nm沒(méi)有出現(xiàn)熒光光譜強(qiáng)度變化，初步判斷所檢測(cè)的藻細(xì)胞樣品為非魚毒性赤潮藻；(4)將步驟(2)得到的熒光特征譜進(jìn)行Fisher判別，F(xiàn)isher判別函數(shù)方程為Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4· 311χ4+16. 307χ5_9· 476χ6_0· 173χ7+3 .866χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；γ2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8· 457χ6+4. 273χ7+ 8. 653χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X為自變量值，即步驟(2)測(cè)得的特征熒光譜的熒光強(qiáng)度；y為測(cè)得的溶血活性數(shù)值；當(dāng)檢測(cè)樣品時(shí)，分別計(jì)算I1和y2值，取大者為其y，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定藻細(xì)胞樣品毒性的大小y = 10 20HU為中毒性；y < IOHU為弱毒性；y > 20HU為強(qiáng)毒性。步驟⑴中所述的發(fā)射波長(zhǎng)優(yōu)選為650 680nm或725 750nm ；步驟(2)所述的三維熒光數(shù)據(jù)首先通過(guò)Matlab6. 5軟件消除瑞利散射、最大歸一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13. O進(jìn)行Fisher判別，最后通過(guò)0rigin8. O制圖，得到熒光特征譜。步驟(4)所述的Fisher判別優(yōu)選通過(guò)SPSS 13. O進(jìn)行；所述檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法在海洋赤潮水體毒性檢測(cè)中應(yīng)用；所述的藻類優(yōu)選為魚毒性赤潮藻，更優(yōu)選為海洋卡盾藻、卵圓卡盾藻或米氏凱倫藻中的至少一種。本發(fā)明的原理藻類溶血毒素主要成分為糖脂類和多不飽和脂肪酸類，而這些物質(zhì)的合成直接與光合作用有關(guān)，葉綠素?zé)晒饪梢匀娣从彻夂献饔萌^(guò)程，本發(fā)明以光合作用為中心點(diǎn)，把糖脂類的合成與藻類的葉綠素?zé)晒庾兓?lián)系起來(lái)。通過(guò)藻類活體熒光特征的識(shí)別，可以判定糖脂類物質(zhì)的變化，從而確定該藻類細(xì)胞的溶血活性大小。本發(fā)明首先通過(guò)傳統(tǒng)的洋地黃皂甙溶血活性測(cè)定方法分別測(cè)定不同溶血性的魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的溶血毒素，再將之與魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的三維熒光進(jìn)行分析，最終確定三維熒光數(shù)據(jù)的處理過(guò)程，從而與傳統(tǒng)的洋地黃皂甙溶血活性測(cè)定方法得到的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明成功解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間滯后的難題，在我國(guó)實(shí)屬首創(chuàng)。本發(fā)明改變傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間滯后、被動(dòng)的窘境，現(xiàn)場(chǎng)的操作性強(qiáng)，化解和減少因赤潮毒素對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的巨大的經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)海產(chǎn)品安全體系的建立。


圖I是魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的Fisher判別圖。圖2是魚毒性赤潮藻溶血活性高低的Fisher判別圖。圖3是卵圓卡盾藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表不培養(yǎng)液中鐵濃度為IX 10_5mol/L ;b表不培養(yǎng)液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養(yǎng)液中鐵濃度為2 X105mol/L。圖4是海洋卡盾藻(香港株)小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X l(T5mol/L ;b表示培養(yǎng)液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養(yǎng)液中鐵濃度為 2 X105mol/L。圖5是海洋卡盾藻(日本株)小波分解后的熒光特征譜圖； 其中，a表不培養(yǎng)液中鐵濃度為IX 10_5mol/L ;b表不培養(yǎng)液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養(yǎng)液中鐵濃度為 2 X105mol/L。圖6是米氏凱倫藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養(yǎng)液中鐵濃度為IX l(T5mol/L O. 5 X l(T8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。圖7是東海原甲藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養(yǎng)液中鐵濃度為IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。圖8是錐狀斯氏藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養(yǎng)液中鐵濃度為IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培養(yǎng)液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。
;b表不培養(yǎng)液中鐵濃度為 ;(1表示培養(yǎng)液中鐵濃度為
;b表不培養(yǎng)液中鐵濃度為 ;(1表示培養(yǎng)液中鐵濃度為
;b表不培養(yǎng)液中鐵濃度為 ;(1表示培養(yǎng)液中鐵濃度為
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I(I)分別培養(yǎng)海洋卡盾藻香港株(已在“海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分離”公開(kāi))、海洋卡盾藻日本株(已在“海洋卡盾藻日本株過(guò)氧化氫產(chǎn)生的影響因素”公開(kāi))、卵圓卡盾藻(已在“五種赤潮藻單克隆抗體的制備”公開(kāi))、米氏凱倫藻(已在“米氏凱倫藻溶血毒素的溶血反應(yīng)特征”公開(kāi))、東海原甲藻(已在“混合培養(yǎng)條件下幾種赤潮藻對(duì)無(wú)機(jī)氮源的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)研究”公開(kāi))和錐狀斯氏藻(已在“多氯聯(lián)苯對(duì)2種微藻的急性毒性研究”公開(kāi))。以上藻類均來(lái)自暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心。①培養(yǎng)基的制備先將自然海水用O. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，收集I. 2L濾液于2L錐形瓶中，121 °C、15psi下滅菌25min，冷卻到室溫，然后加入f/2培養(yǎng)液改良配方(如表I所示)，根據(jù)下表得到的培養(yǎng)基鐵離子濃度為lX10_5mOl/L。由于鐵離子的濃度影響藻的溶血活性，因此，再分別制備得到鐵離子濃度為O. 5X 10_8mol/L、l X 10_7mol/L和2X 10_5mol/L 的培養(yǎng)基。使用不同鐵離子濃度的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)藻類。表I f/2培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于包含以下步驟(1)通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定藻細(xì)胞樣品的三維熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為400 600nm，發(fā)射波長(zhǎng)為650 750nm，得到藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)；(2)將藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TXT文件格式，根據(jù)Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對(duì)其三維熒光光譜進(jìn)行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；(3)在波長(zhǎng)λ Em = 650 700nm，波長(zhǎng) λ Em = 725 750nm，波長(zhǎng) λ Ex = 400 425nm 出現(xiàn)與藻類的溶血活性強(qiáng)弱一致的熒光光譜強(qiáng)度變化，初步判斷所檢測(cè)的藻細(xì)胞樣品為魚毒性赤潮藻；若在波長(zhǎng)λ Em = 650 700nm，波長(zhǎng)λ Em = 725 750nm，波長(zhǎng)λ Ex = 400 425nm沒(méi)有出現(xiàn)熒光光譜強(qiáng)度變化，初步判斷所檢測(cè)的藻細(xì)胞樣品為非魚毒性赤潮藻；(4)將步驟(2)得到的熒光特征譜進(jìn)行Fisher判別，F(xiàn)isher判別函數(shù)方程為Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4. 311χ4+16. 307χ5_9. 476χ6_0. 173χ7+3. 866 χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；Y2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8. 457χ6+4. 273χ7+8. 65 3χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X為自變量值，即步驟(2)測(cè)得的特征熒光譜的熒光強(qiáng)度；y為測(cè)得的溶血活性數(shù)值；當(dāng)檢測(cè)樣品時(shí)，分別計(jì)算Y1和y2值，取大者為其y，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定藻細(xì)胞樣品毒性的大小y = 10 20HU為中毒性；y < IOHU為弱毒性；y > 20HU為強(qiáng)毒性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(I)中所述的發(fā)射波長(zhǎng)為650 680nm或725 750nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(2)所述的三維熒光數(shù)據(jù)首先通過(guò)Matlab6. 5軟件消除瑞利散射、最大歸一化以及Coif2小波分析， 再通過(guò)SPSS13. O進(jìn)行Fisher判別，最后通過(guò)0rigin8. O制圖，得到熒光特征譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(4)所述的Fisher判別通過(guò)SPSS 13. O進(jìn)行。
5.權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測(cè)中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測(cè)中應(yīng)用，其特征在于所述的藻類為魚毒性赤潮藻。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測(cè)中應(yīng)用，其特征在于所述的魚毒性赤潮藻為海洋卡盾藻、卵圓卡盾藻或米氏凱倫藻中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種檢測(cè)藻類溶血毒素活性的方法與應(yīng)用。該方法通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定藻細(xì)胞樣品的三維熒光，得到藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)；再將藻細(xì)胞樣品的三維熒光數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TXT文件格式，根據(jù)Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對(duì)其三維熒光光譜進(jìn)行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；根據(jù)熒光特征譜初步判斷所檢測(cè)的藻細(xì)胞樣品為魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻；再將熒光特征譜進(jìn)行Fisher判別，從而判定藻細(xì)胞樣品毒性的大小。本發(fā)明成功解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間滯后的難題，在我國(guó)實(shí)屬首創(chuàng)。本發(fā)明改變傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間滯后、被動(dòng)的窘境，有利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)赤潮藻的魚毒性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102608085SQ201210005410
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳霓, 李支薇, 杜克梅, 桓清柳, 江天久 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)