專(zhuān)利名稱(chēng)：一種同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品中糖和糖醇的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及到葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇這十三種常見(jiàn)糖與糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
糖類(lèi)是食品中的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，其主要影響食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、甜味等性質(zhì)，同時(shí)糖類(lèi)也是人體的主要能量來(lái)源。食品中常見(jiàn)的糖類(lèi)包括單糖，如木糖、葡萄糖、果糖，雙糖，如麥芽糖、乳糖、蔗糖，功能性低聚糖，如低聚果糖(包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖)，功能性糖醇，如赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇等。其中單、雙糖是食品中的主要甜味來(lái)源，同時(shí)也是某些食品的安全指標(biāo)，如GB14963-2011中明確規(guī)定蜂蜜中果糖和 葡萄糖含量應(yīng)> 60g/100g，蔗糖含量應(yīng)< 10g/100g ;功能性低聚糖如低聚果糖作為益生元已被廣泛用于各種配方食品、保健食品，特別是嬰幼兒配方食品中，但添加量一般較低，在2g/100g以下，功能性糖醇如赤蘚糖醇、木糖醇、甘露醇、麥芽糖醇一般作為糖類(lèi)替代成分添加到無(wú)糖食品如無(wú)糖口香糖、無(wú)糖肉松等食品中，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽通則》規(guī)定“無(wú)糖”的要求是指固體或液體食品中每IOOg或IOOml的含糖量不高于O. 5g。目前糖類(lèi)檢測(cè)方法的研究中，主要有高效液相色譜(HPLC)-熒光檢測(cè)法(FLD)，HPLC-示差折光法，離子色譜法，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)，高效氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)。HPLC-FLD法雖然靈敏度較高，但是具有較強(qiáng)的選擇性；離子色譜法具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，但是糖類(lèi)能在電極表面還原樣品中某些分子；HPLC-MS/MS法和GC-MS/MS法雖然具有高分離、高選擇、高靈敏的特性，但是其設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，通用性較差；現(xiàn)行國(guó)標(biāo)中對(duì)單、雙糖、糖醇的檢測(cè)方法主要為化學(xué)還原法和HPLC-示差折光檢測(cè)法，前者費(fèi)時(shí)，操作繁瑣，并且只能對(duì)具有還原性的糖進(jìn)行定量檢測(cè)，無(wú)法準(zhǔn)確定性；后者由于靈敏度不高，平衡時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法進(jìn)行梯度洗脫，亦無(wú)法完成多種單、雙糖、低聚糖和糖醇的同時(shí)檢測(cè)。而功能性低聚糖的檢測(cè)方法仍在探索中，尚無(wú)成熟的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本法采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)，對(duì)以上十三種單、雙糖、功能性低聚糖、糖醇進(jìn)行檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便、靈敏度較高、穩(wěn)定性較好、重復(fù)性較高。目前未見(jiàn)采用HPLC-ELSD法對(duì)以上十三種單、雙糖、功能性低聚糖、功能性糖醇進(jìn)行同時(shí)分離檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法簡(jiǎn)便、通用性較高的糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下(I)十三種單標(biāo)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇各O. 25g(精確至O. Img)于150ml燒杯中，用少量超純水溶解，超聲波震蕩2min，過(guò)O. 45 μ m水相濾膜并轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶，定容至刻度，配制成10mg/ml的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。于4°C冰箱保存，待用。(2)含十三種單標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別取配制好的單標(biāo)液各Iml于25ml容量瓶中，取超純水定容至刻度，超聲振蕩2min,配制成O. 4mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于4°C冰箱保存，用于HPLC檢測(cè)。(3)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度洗脫米用Agilent ZORBAX NH2柱(5 μ m, 4. 6X 250mm)對(duì)十三種糖與糖醇進(jìn)行分離。分離條件為流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫程序?yàn)镺-Imin時(shí)，乙腈水的體積比為80 20，
l-5min時(shí)，乙腈水的體積比從80 : 20變到85 : 15, 5_20min時(shí)，乙腈-水的體積比從85 15變到70 30，20-40min時(shí)，乙腈水的體積比為70 30，柱溫為30°C，洗脫速度為 I. Oml/min,進(jìn)樣量 10 μ I ;·(4)蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測(cè)蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件漂移管溫度60°C，載氣N2流速I(mǎi). 5L/min，增益為I。在上述液相分離和ELSD檢測(cè)條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得到了較好的分離，分離圖譜見(jiàn)附圖I。(5)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-ELSD法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出限的測(cè)定將10mg/ml的各種單標(biāo)溶液的濃度依次稀釋為5mg/ml, 3mg/ml, 2mg/ml, lmg/ml,
0.5mg/ml,0. lmg/ml,0. 05mg/ml,按步驟(3)和(4)進(jìn)行分離檢測(cè)，根據(jù)峰面積(Y)與對(duì)應(yīng)糖和糖醇的濃度(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，可得到13種糖、糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、線(xiàn)性范圍，可用于實(shí)際樣品中的各糖和糖醇含量的定量檢測(cè)。同時(shí)將各單標(biāo)溶液不斷稀釋?zhuān)?dāng)液相色譜峰的信噪比為3時(shí)，確定該濃度為單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與有益效果是采用本發(fā)明同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖與糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法對(duì)糖與糖醇進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低，操作簡(jiǎn)便，可快速準(zhǔn)確定性、定量食品中的十三種糖與糖醇，可用于大規(guī)模樣品檢測(cè)，適于標(biāo)準(zhǔn)化。


圖I十三種糖與糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜蒸發(fā)光散射圖譜，I.赤蘚糖醇
2.木糖3.木糖醇4.果糖5.葡萄糖6.甘露糖醇7.蔗糖8.麥芽糖9.麥芽糖醇10.乳糖11.蔗果三糖12.蔗果四糖13.蔗果五糖。圖2各單標(biāo)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實(shí)施例。實(shí)施例I將IOmg/ml的各種單標(biāo)液的濃度依次稀釋為5mg/ml, 3mg/ml, 2mg/ml, lmg/ml,
0.5mg/ml,0. lmg/ml, 0. 05mg/ml,分別在確佳分離檢測(cè)條件下進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)峰面積(Y)與對(duì)應(yīng)糖和糖醇的濃度(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，可得到13種糖、糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、線(xiàn)性范圍，并將濃度不斷稀釋?zhuān)?dāng)信噪比為3時(shí)，確定每種糖或糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限，具體結(jié)果見(jiàn)表I。表I十三種糖與糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)及檢出限
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于包括以下步驟 (1)配制十三種糖和糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各單品的濃度均為O.4mg/ml ； (2)采用乙腈-水的混合溶液為分離流動(dòng)相，在氨基柱上進(jìn)行梯度洗脫分離； (3)分離后采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)； (4)取一定量的步驟(I)所得的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣高效液相色譜儀，采用步驟(2)進(jìn)行分離，采用步驟(3)進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟(I)中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程如下分別準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇各O. 25g(精確至O. Img)于150ml燒杯中，用少量超純水溶解，超聲波震蕩2min,過(guò)O. 45 μ m水相濾膜并轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶,定容至刻度,配制成10mg/ml的單標(biāo)溶液。分別取配制好的單標(biāo)溶液各Iml于25ml容量瓶中，取超純水定容至刻度，超聲振蕩2min,配制成O. 4mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟(I)中涉及的十三種糖和糖醇分別為葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟⑵中氨基柱為Agilent ZORBAX NH2柱(5 μ m，4.6 X 250mm)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟(2)中的梯度洗脫程序?yàn)镺-Imin時(shí)，乙腈水的體積比為80 20，l-5min時(shí)，乙腈水的體積比從80 20變到85 15，5_20min時(shí)，乙腈-水的體積比從85 15變到70 30，20-40min時(shí)，乙腈水的體積比為70 30，洗脫速度為O.8-1. 2ml/min,柱溫為 30°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟(3)中的蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件為漂移管溫度為40-70°C，載氣N2,流速為O. 8-1. 51/min，增益為I。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)分離檢測(cè)十三種糖和糖醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，其特征在于所述步驟(4)中的進(jìn)樣量3-20 μ I。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品中糖和糖醇的檢測(cè)領(lǐng)域。包括以下步驟對(duì)十三種糖與糖醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用乙腈-水的混合溶液為分離流動(dòng)相，在氨基柱上進(jìn)行梯度洗脫分離，洗脫速度為0.8-1.2ml/min；分離后采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)條件為漂移管溫度為40-70℃，載氣為N2，流速為0.8-1.5l/min，增益為1。本法提供了一種食品中常見(jiàn)的多種糖及糖醇的同時(shí)分離檢測(cè)的高效，便捷，低檢出限，高通用性的分析方法。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102914603SQ20121036364
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者李培, 李 燦, 孫秀蘭, 陳英, 丁洪流, 陳尚衛(wèi), 戴軍, 謝云飛, 姚衛(wèi)蓉 申請(qǐng)人:蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所, 江南大學(xué)