Eif5a2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，EIF5A2在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的非腫瘤組織。免疫組化數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：EIF5A2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤分期正相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示EIF5A2過(guò)表達(dá)的病人總體生存率較差(P<0.001)。多變量分析也證明EIF5A2是獨(dú)立的預(yù)后因子。EIF5A2在食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，EIF5A2的過(guò)表達(dá)可由基因擴(kuò)增和缺氧導(dǎo)致；EIF5A2可以結(jié)合到HIF1α的啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)HIF1α的表達(dá)；EIF5A2可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)換，促進(jìn)食管鱗癌的血管形成，進(jìn)而促進(jìn)食管鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。敲除EIF5A2能顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移，沉默EIF5A2有望成為食管鱗癌治療的潛在靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及EIF5A2的新應(yīng)用，特別涉及EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]食管鱗狀細(xì)胞癌是世界上腫瘤發(fā)病率排名第七，致死率排名第五的常見(jiàn)惡性腫瘤。食管切除術(shù)是早期食管癌患者有力的根治性治療。然而，大多數(shù)患者癥狀顯現(xiàn)時(shí)局部腫瘤已進(jìn)展到晚期，并且20-30%已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是食管癌致死的主要原因，因此確定其具體機(jī)制顯得重要而又迫切。像其他實(shí)體腫瘤一樣，食管癌的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)涉及多基因改變的長(zhǎng)期過(guò)程。
[0003]真核細(xì)胞翻譯起始因子5A2(EIF5A2)是EIF5A家族中高度進(jìn)化保守的基因之一。EIF5A2作為可能的癌基因在多種人類上皮源性腫瘤內(nèi)呈高表達(dá)，并與腫瘤的分期和/或預(yù)后不佳相關(guān)。EIF5A2通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。EIF5A-MTA1/C-MYC軸可能是上皮源性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控通路之一。相關(guān)分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究(孟慶彬，于健春，馬志強(qiáng).EIF5A2在腫瘤中的作用研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(001): 123-125.XEIF5A2的過(guò)度表達(dá)與結(jié)直腸癌和肝癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且提示了卵巢癌、肺癌、膀胱癌的不良預(yù)后。在肝細(xì)胞癌中，過(guò)度表達(dá)的EIF5A2可通過(guò)介導(dǎo)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)換而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這些過(guò)度表達(dá)的EIF5A2主要在侵犯周?chē)M織的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到。盡管EIF5A2可以促進(jìn)肝癌與結(jié)直腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，但是目前關(guān)于EIF5A2促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚進(jìn)展甚微。
[0004]現(xiàn)有研究中，EIF5A2與食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后之后的關(guān)系尚未明確。Kim D H，Muto M， Kuwahara Y， et al.Array-based comparative genomic hybridizationof circulating esophageal tumor cells [J].0ncology reports， 2006， 16(5):1053-1059.中指出，EIF5A2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)量的升高有限，不到0.6倍，不適用于作為該腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種治療食管鱗狀細(xì)胞癌的制劑。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用，EIF5A2高表達(dá)表明預(yù)后差，EIF5A2高表達(dá)的定義為:熒光定量PCR法:癌組織中EIF5A2的表達(dá)量超過(guò)癌旁非腫瘤組織的2.5倍；免疫組化檢測(cè)法:腫瘤組織中染色深度X染色面積高于癌旁非腫瘤組織。
[0008]一種治療食管鱗狀細(xì)胞癌的制劑，含有可以減少EIF5A2的表達(dá)量的起效因子。
[0009]優(yōu)選的，起效因子選自可使EIF5A2表達(dá)量下降的shRNA、siRNA。
[0010]特別的，shRNA的序列為sh2:
top strand: 5’-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3’ (SEQ IDNO:1)；
bottom strand:5’-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3’ (SEQ IDNO:2)
或 sh4:
top strand:5’-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3’ (SEQ IDNO:3)
bottom strand:5’-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3’ (SEQID NO:4)0
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
發(fā)明人通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了 71例食管鱗狀細(xì)胞癌病例中腫瘤和與相應(yīng)的非腫瘤組織中EIF5A2的表達(dá)差異。EIF5A2在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的非腫瘤組織(P = 0.05)。與相應(yīng)的非腫瘤組織相比，在31/71 (43.66%)食管鱗癌病例中檢查到EIF5A2的過(guò)表達(dá)。232例資料完整的食管鱗癌病例的免疫組化數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:EIF5A2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P〈0.001)，腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.037)和腫瘤分期(P=O-OOl)正相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示EIF5A2過(guò)表達(dá)的病人總體生存率較差(P〈0.001)。多變量分析也證明EIF5A2是獨(dú)立的預(yù)后因子。這些結(jié)果表明:EIF5A2在食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。
[0012]進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，EIF5A2的過(guò)表達(dá)可由基因擴(kuò)增和缺氧導(dǎo)致；EIF5A2可以可以結(jié)合到HIFla的啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)HIFl a的表達(dá)；EIF5A2可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)換，促進(jìn)食管鱗癌的血管形成，進(jìn)而促進(jìn)食管鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。敲除EIF5A2能顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移，沉默EIF5A2有望成為食管鱗癌治療的潛在祀點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1，EIF5A2在食管鱗癌中的過(guò)表達(dá)情況；
圖2，EIF5A2的表達(dá)可被缺氧誘導(dǎo)并且EIF5A2可以上調(diào)HIFl a ； 圖34正5么2可直接調(diào)控!1正10的表達(dá)；
圖4，沉默EIF5A2能降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力；
圖5，EIF5A2促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；
圖6，敲除EIF5A2具有潛在治療價(jià)值；
圖7，細(xì)胞角蛋白免疫組化染色結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]材料和方法
原發(fā)腫瘤組織，組織芯片與免疫組化
食管鱗癌病例是從林州腫瘤醫(yī)院外科病理檔案室中連續(xù)挑選的(河南，中國(guó))。在這項(xiàng)研究中，所有病例都沒(méi)有接受過(guò)術(shù)前放化療。 組織芯片(TMA)是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建。研究用人體組織經(jīng)過(guò)中山大學(xué)涉及人體受試者研究的倫理審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。免疫組化染色(IHC)使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)細(xì)染色方法進(jìn)行。
[0015]原位雜交免疫熒光
EIF5A2基因和3號(hào)染色體著絲粒分別用紅色和綠色探針標(biāo)記。原位雜交免疫熒光按照之前描述進(jìn)行操作9。
[0016]亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離
根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)，使用NucBuster蛋白提取試劑盒分離出胞漿蛋白與胞核蛋白。
[0017]EIF5A2與HIFl α的相互作用
EIF5A2與HIFla的相互作用機(jī)制是通過(guò)熒光素酶試驗(yàn)與染色體免疫共沉淀試驗(yàn)研究的。
[0018]體外遷移試驗(yàn)
將重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞種植于內(nèi)置8微米膜濾器小室中。細(xì)胞被含10%胎牛血清的培養(yǎng)基所吸引。30小時(shí)后，細(xì)胞被固定、染色、計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，膜濾器為一層基質(zhì)膠覆蓋。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
體內(nèi)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)
所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)對(duì)動(dòng)物保健委員會(huì)的指導(dǎo)方針并且經(jīng)中山大學(xué)批準(zhǔn)進(jìn)行。此次研究中使用的是四~六周齡的BALB/c裸鼠。動(dòng)物根據(jù)血行轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、對(duì)照組隨機(jī)分為三組。注射前2天，使用感染復(fù)數(shù)為150的腺病毒和對(duì)照載體(Ad LacZ)分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染。經(jīng)尾靜脈向動(dòng)物體內(nèi)注射重懸于PBS中的6X IO5個(gè)細(xì)胞，或經(jīng)皮下足墊注射重懸于PBS中的1.5X IO5個(gè)細(xì)胞。45天后處死所有動(dòng)物。對(duì)肺和肝臟進(jìn)行檢查。對(duì)肝臟表面的腫瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)。將腹股溝淋巴結(jié)分離并用10%福爾馬林固定。
[0019]微血管計(jì)數(shù)
微血管計(jì)數(shù)是使用CD34抗體對(duì)切片進(jìn)行免疫組化染色后分析的。血管的最高值是在20倍物鏡下計(jì)數(shù)的。
[0020]分子治療實(shí)驗(yàn)
由于KYSE180細(xì)胞優(yōu)良的成瘤性，用它來(lái)做裸鼠成瘤。在治療實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用了兩步成瘤法。首先，把KYSE180細(xì)胞接種到小鼠皮下。當(dāng)腫瘤直徑長(zhǎng)到約8毫米時(shí)，將腫瘤分離并切成約I X I毫米碎塊，然后把它們?cè)俜N植到裸鼠皮下。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5~6毫米，動(dòng)物分組如下:PBS組，多西紫杉醇組(TXT)，腺病毒EIF5A2-sh2組，多西紫杉醇+腺病毒EIF5A2_sh2 ;或PBS組，順鉬組，順鉬+腺病毒EIF5A2-sh2組，與順鉬+腺病毒EIF5A2_sh4組。瘤內(nèi)注射腺病毒(IXlO9 IFU /每個(gè)腫瘤)，每周一次，連續(xù)四周。腺病毒劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定。多西紫杉醇用法為:腹腔注射，0.311毫克/只/次(用量根據(jù)于40 mg/體表面積計(jì)算)，每周一次，連續(xù)3周。順鉬用法為:0.2毫克/只/次。每?jī)芍軠y(cè)量一次腫瘤體積來(lái)檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。最后一次腺病毒注射后，處死動(dòng)物，對(duì)腫瘤重量進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)中所用的shRNA序列如下:
【權(quán)利要求】
1.EIF5A2在制備食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后診斷試劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:EIF5A2高表達(dá)表明預(yù)后差，EIF5A2高表達(dá)的定義為: 熒光定量PCR法:癌組織中EIF5A2的表達(dá)量超過(guò)癌旁非腫瘤組織的2.5倍； 免疫組化檢測(cè)法:腫瘤組織中染色深度X染色面積高于癌旁非腫瘤組織。
3.一種治療食管鱗狀細(xì)胞癌的制劑，所述制劑含有可以減少EIF5A2的表達(dá)量的起效因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其特征在于:起效因子選自可使EIF5A2表達(dá)量下降的shRNA、SiRNA0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于:所述shRNA的序列為
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103468799SQ201310367825
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】關(guān)新元, 李焱 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院