本發(fā)明屬于檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

將兩個遺傳不同的個體之淋巴細胞在體外混合共同培養(yǎng)時，因其表面的組織相容性抗原不同而相互刺激，會導(dǎo)致對方淋巴細胞分裂增殖和轉(zhuǎn)化，這種反應(yīng)稱為雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)(twowaymlc)；若將其中一方的淋巴細胞先用絲裂霉素c(mytomycinec)處理或射線照射使之細胞中dna失去復(fù)制能力，但仍能刺激另一方淋巴細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，稱為單向混合淋巴細胞培養(yǎng)(onewaymlc)。主要組織相容性復(fù)合體(mhc)和/或m位點基因編碼的細胞表面抗原是這種反應(yīng)的主要刺激物，反應(yīng)細胞為t細胞。根據(jù)淋巴細胞反應(yīng)的強度，可評價兩者組織相容性抗原的差異程度以及淋巴細胞對同種異體細胞的反應(yīng)能力。因此，混合淋巴細胞反應(yīng)常用于器官移植前的組織配型，以測定受體和供體mhc相容的程度；以及藥物及移植物的免疫排斥作用檢測，以評估其使用風(fēng)險。由于混合淋巴細胞培養(yǎng)中淋巴細胞接受同種異型抗原的刺激而發(fā)生活化、增殖，產(chǎn)生種類眾多的細胞因子，促進自然殺傷細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞和細胞毒性t淋巴細胞等殺傷細胞的分化，因此又是免疫調(diào)節(jié)研究中常用的實驗?zāi)Ｐ?。此外，混合淋巴細胞反?yīng)還可用于檢測其他細胞或外界刺激物作用下，t細胞的增殖情況。簡言之，與對照組相比，t細胞增殖增多意味著待測物能夠促進t細胞反應(yīng)；t細胞增殖減少則意味著待測物能夠抑制t細胞反應(yīng)。

然而目前，國內(nèi)外并沒有混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的成品試劑盒，導(dǎo)致各醫(yī)院、高校、科研院所、第三方檢驗機構(gòu)進行本試驗檢測時困難重重，需要進行大量前期實驗條件摸索；且由于參考文獻不同等原因，可能導(dǎo)致不同機構(gòu)進行檢測時所用實驗方法不同，因此檢測結(jié)果差異性很大。因此，有必要提供一種用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的方法和試劑盒以克服上述缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對目前國內(nèi)外市場上沒有混合淋巴細胞共培養(yǎng)相關(guān)的試劑盒的現(xiàn)狀，研發(fā)一種新型的用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒基于羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester,cfse)染色結(jié)合流式細胞分析法檢測混合淋巴細胞共培養(yǎng)結(jié)果，其主要原理為(參見圖1)：利用絲裂霉素c(mitomycinc)預(yù)先處理刺激細胞(刺激細胞與第二種淋巴細胞表面主要組織相容性復(fù)合體不同，可以為淋巴細胞或其他細胞，例如eb病毒轉(zhuǎn)化的b淋巴母細胞(如n23細胞株，經(jīng)過克隆化)、htc細胞或pbmc細胞等)，使刺激細胞中dna失去復(fù)制能力，不再進行增殖，但仍能刺激第二種淋巴細胞(可以為淋巴細胞或分離純化的t淋巴細胞等)的活化，進一步的，利用cfse標記第二種淋巴細胞，并將其與mitomycinc預(yù)處理的刺激細胞共同培養(yǎng)3-5天后，即可通過流式細胞術(shù)檢測經(jīng)cfse標記的第二種淋巴細胞的增殖情況。本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，一種用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的方法，包括以下步驟：

第一步，將刺激細胞利用絲裂霉素c處理；

第二步，將第二種淋巴細胞利用cfse熒光染料染色；

第三步，將經(jīng)絲裂霉素c處理的刺激細胞與經(jīng)cfse熒光染料染色的第二種淋巴細胞共同培養(yǎng)；

第四步，使用流式細胞術(shù)檢測第二種淋巴細胞的增殖情況；

其中，所述刺激細胞與所述第二種淋巴細胞表面主要組織相容性復(fù)合體不同。

根據(jù)本發(fā)明，所述刺激細胞包括淋巴細胞或其他細胞，所述其他細胞包括eb病毒轉(zhuǎn)化的b淋巴母細胞、htc細胞或pbmc細胞等，所述第二種淋巴細胞包括淋巴細胞或分離純化的t淋巴細胞等。

根據(jù)本發(fā)明，所述絲裂霉素c的終濃度為5-100μg/ml，優(yōu)選的，所述絲裂霉素c的終濃度為10μg/ml。

根據(jù)本發(fā)明，所述cfse熒光染料的終濃度為1-10μm，優(yōu)選的，所述cfse熒光染料的終濃度為5μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述經(jīng)絲裂霉素c處理的刺激細胞與經(jīng)cfse熒光染料染色的第二種淋巴細胞按照1:1-1:20的比例共同培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明，所述共同培養(yǎng)的時間為3-5天。

根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，一種用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測的試劑盒，所述試劑盒包含絲裂霉素c和cfse熒光染料。

根據(jù)本發(fā)明，所述絲裂霉素c的終濃度為5-100μg/ml，優(yōu)選的，所述絲裂霉素c的終濃度為10μg/ml。

根據(jù)本發(fā)明，所述cfse熒光染料的終濃度為1-10μm，優(yōu)選的，所述cfse熒光染料的終濃度為5μm。

本發(fā)明的方法和試劑盒能夠用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗檢測，具有如下優(yōu)點：

1)操作簡單，僅需按照產(chǎn)品說明書進行簡單操作即可，無需特別的實驗技巧，可操作性強；

2)利用cfse染色法結(jié)合流式細胞術(shù)法檢測淋巴細胞的增殖情況，精確度高；

3)流式檢測法可直觀真實地反應(yīng)淋巴細胞的增殖情況，不受操作者主觀判斷影響，結(jié)果可重復(fù)性強；

4)所需樣本量少，檢測結(jié)果清晰，特異性強，易于分析；

5)成本低，推廣性強。

本發(fā)明提供了可用于混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗的檢測的方法和試劑盒，適用于器官移植前的組織配型試驗，免疫力低下患者的免疫功能檢測，藥物及移植物的免疫排斥作用檢測，其他細胞或外界刺激物對于t淋巴細胞活化的影響檢測，對影響t細胞活化能力的藥物篩選，以及其他免疫調(diào)節(jié)試驗研究等。本發(fā)明的方法和試劑盒不僅限于人類樣本的檢測，還可用于其他物種混合淋巴細胞共培養(yǎng)的檢測，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、豬等，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法的原理示意圖。

圖2為實施例1的操作說明示意圖。

圖3為實施例1的實驗結(jié)果示意圖。

圖4為實施例2的操作說明示意圖。

圖5為實施例2的實驗結(jié)果示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

通過本發(fā)明的方法和試劑盒可檢測受試者器官移植前的組織配型試驗，以判定受試者是否適于接受本次器官移植，預(yù)測移植后發(fā)生排斥的風(fēng)險。通常需要獲取器官移植提供者(以下簡稱供體)及器官移植接受者(以下簡稱受體)的新鮮外周靜脈血進行試驗。

如圖2所示，本實施例的具體操作步驟如下：

第一步，供體淋巴細胞的制備：

1)取供體新鮮外周靜脈血，與pbs按照1：1的比例稀釋。沿管壁徐徐滴流疊加盛有1/2體積的淋巴細胞分離液的試管內(nèi)(注意不要破壞液面分層)，然后2000rpm水平離心20min。管內(nèi)分為4層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞。用毛細管伸至單個核細胞層中(位于細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然后用pbs洗兩次，每次1500rpm離心10min。臺盼藍染色，計數(shù)板計數(shù)。調(diào)整細胞密度為1～2×10⁶/ml，離心，留取沉淀。

2)向上述細胞中加入1μl絲裂霉素(終濃度10μg/ml)和1mlpbs，37℃水浴30min，pbs離心洗滌2次。

3)用含10％fbs的rpmi1640液調(diào)整細胞密度為1×10⁷/ml，標記為d。

第二步，受體淋巴細胞的制備：

1)取受體新鮮外周靜脈血，與pbs按照1：1的比例稀釋。沿管壁徐徐滴流疊加盛有1/2體積的淋巴細胞分離液的試管內(nèi)(注意不要破壞液面分層)，然后2000rpm水平離心20min。管內(nèi)分為4層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞。用毛細管伸至單個核細胞層中(位于細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然后用pbs洗兩次，每次1500rpm離心10min。臺盼藍染色，計數(shù)板計數(shù)。

2)將上述細胞用含有5％fbs的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10⁷/ml。加入終濃度為5μm的cfse溶液，37℃避光水浴5min。然后利用預(yù)冷的含5％fbs的pbs洗滌2次。

3)用含有10％fbs的prmi1640重懸上述細胞，調(diào)整細胞密度為1×10⁷/ml，標記為r。

第三步，混合淋巴細胞培養(yǎng)

將上述已制備好的r和d按如下分組加入96孔板，置37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。

實驗組：r(50μl)+d(50μl)；

對照組：r(50μl)；

每組3個復(fù)孔，空白對照組為rpmi1640培養(yǎng)液100μl。

第四步，流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞的增殖情況

通過流式細胞術(shù)，通過設(shè)門圈出淋巴細胞群，并分析淋巴細胞的增殖情況。結(jié)果以刺激指數(shù)(stimulationindices,si)表示，si＝實驗組淋巴細胞增殖百分比-對照組淋巴細胞增殖百分比。

檢測結(jié)果如圖3所示，對照組細胞沒有或僅有少量淋巴細胞增殖，實驗組有大量淋巴細胞增殖。若si值大于10，則提示供體與受體二者配型可能不符，不適宜進行后續(xù)的器官移植。

實施例2

通過本發(fā)明的方法和試劑盒可檢測受試者t淋巴細胞功能是否低下，通常需要獲取受試者的新鮮外周靜脈血進行試驗。

如圖4所示，本實施例的具體操作步驟如下：

第一步，刺激細胞的制備：

1)常用的刺激細胞有eb病毒轉(zhuǎn)化的b淋巴母細胞(如n23細胞株，經(jīng)過克隆化)、htc細胞或pbmc細胞等。以n23細胞為例，取處于對數(shù)生長期的n23細胞，離心后重懸于新鮮完全培養(yǎng)基中，臺盼藍染色，計數(shù)板計數(shù)。

2)向上述細胞中加入1μl絲裂霉素(終濃度10μg/ml)和1mlpbs，37℃水浴30min，pbs離心洗滌2次。

3)用含10％fbs的rpmi1640液調(diào)整細胞密度為1×10⁷/ml。標記為s。

第二步，受試者外周血pbmc細胞的制備：

1)取受試者個體新鮮外周靜脈血，與pbs按照1：1的比例稀釋。沿管壁徐徐滴流疊加盛有1/2體積的淋巴細胞分離液的試管內(nèi)(注意不要破壞液面分層)，然后2000rpm水平離心20min。管內(nèi)分為4層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞。用毛細管伸至單個核細胞層中(位于細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然后用pbs洗兩次，每次1500rpm離心10min。臺盼藍染色，計數(shù)板計數(shù)。

2)將上述細胞用含有5％fbs的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10⁷/ml。加入終濃度為5μm的cfse溶液，37℃避光水浴5min。然后利用預(yù)冷的含5％fbs的pbs洗滌2次。

3)用含有10％fbs的prmi1640重懸上述細胞，調(diào)整細胞密度為1×10⁷/ml，標記為u。

第三步，混合淋巴細胞培養(yǎng)

將已制備好的s和u按照20:1的比例，如下分組加入96孔板，置37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。

實驗組：u(2×10⁵個細胞)+s(1×10⁴個細胞)；

對照組：u(2×10⁵個細胞)

每組3個復(fù)孔，空白對照組為rpmi1640培養(yǎng)液200μl。

第四步，流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞的增殖情況

利用cd3、cd8流式抗體標記培養(yǎng)細胞，通過流式細胞術(shù)，通過設(shè)門圈出各類t淋巴細胞群，并分析t淋巴細胞的增殖情況。結(jié)果以刺激指數(shù)(stimulationindices,si)表示，si＝實驗組淋巴細胞增殖百分比-對照組淋巴細胞增殖百分比。

檢測結(jié)果如圖5所示，對于t淋巴細胞功能正常的健康人來說，對照組細胞沒有或僅有少量淋巴細胞增殖，實驗組有大量淋巴細胞增殖；對于t淋巴細胞功能缺陷患者來說，對照組及實驗組細胞均沒有或僅有少量淋巴細胞增殖。