本發(fā)明屬于生物檢測，具體涉及一種基于智能手機檢測低密度脂蛋白的比色生物傳感器。

背景技術(shù)：

1、低密度脂蛋白（ldl）是血漿中膽固醇含量占比最高的一類脂蛋白，主要功能是將膽固醇運輸至外周組織，使外周組織攝取和利用膽固醇。發(fā)明專利cn116804678a公開了一種配合全自動生化分析儀的低密度脂蛋白測定試劑盒，能夠輔助臨床動脈粥樣硬化的檢測。發(fā)明專利cn109374717a提供了一種凝膠電泳體系，通過調(diào)節(jié)其中凝膠電泳分離柱中聚丙烯酰胺的含量以及電泳緩沖液的種類，能夠分離和檢測血漿脂蛋白ldl的各個亞型。但目前現(xiàn)有的檢測方式存在操作復雜、價格昂貴、儀器體積大等缺點，需要開發(fā)一種便攜、易于使用的比色型生物傳感器。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于還原氧化石墨烯@二硫化鉬-鉑納米顆粒（rgo-mos2-pt?nps）材料的比色生物傳感器，結(jié)合智能手機小程序進行rgb分析，用于檢測ldl；傳感器的線性檢測范圍為20~190?μg/ml，檢測限為2.034?μg/ml。

2、為了解決該技術(shù)問題，本發(fā)明采用具有良好過氧化物酶性質(zhì)的rgo-mos2-pt?nps納米酶，將rgo-mos2-pt?nps與ldl適配體（ldlapt）連接，形成rgo-mos2-pt?nps-apt復合物作為體系中的識別探針，并固定未修飾的ldlapt作為捕獲探針。將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（tmb）作為顯色試劑，加入ldl后，捕獲探針和識別探針特異性結(jié)合ldl，形成“三明治型”結(jié)構(gòu)，在h2o2存在下將無色的tmb氧化為藍色的oxtmb；當ldl濃度增大，捕獲探針和識別探針特異性結(jié)合的ldl增加，形成更多更穩(wěn)定的“三明治型”結(jié)構(gòu)，催化h2o2分解產(chǎn)生更多·oh，使tmb顏色加深，可以即時觀察檢測結(jié)果。在溶液反應后通過智能手機自帶的攝像頭拍攝，將圖片導入小程序，選取顏色進行rgb分析，首先分析大致的顏色，再對具體的rgb參數(shù)進行分析提取，將數(shù)據(jù)整合，計算亮度，繪制工作曲線?；诒壬珎鞲信c智能手機的結(jié)合，實現(xiàn)對ldl快速、便捷、高靈敏度的檢測。

3、本發(fā)明按照以下步驟進行：

4、步驟1：納米酶rgo-mos2-pt?nps-apt的制備

5、（1）rgo-mos2-pt?nps的制備：稱取一定量的單層氧化石墨烯（go），加入純水溶解破碎，加入抗壞血酸（aa）攪拌，將go還原為還原氧化石墨烯（rgo）。加入n’n二甲基甲酰胺（dmf）和β-巰基乙胺氨基化mos2，將rgo與mos2混合溶液進行高溫反應，冷卻后加入六氯鉑酸鈉（na2ptcl6）和水合肼混合攪拌，待攪拌完全后，離心，洗滌，干燥沉淀，得到rgo-mos2-ptnps固體；

6、（2）rgo-mos2-pt?nps-apt的制備：量取rgo-mos2-pt?nps和ldl適配體ldlapt溶液，孵育，得到rgo-mos2-pt?nps-apt溶液。

7、步驟2：基于智能手機和rgb分析小程序檢測ldl的比色型生物傳感器的構(gòu)建

8、（1）加入捕獲探針（ldlapt），加入bsa溶液，靜置；

9、（2）分別加入不同濃度的ldl溶液和rgo-mos2-pt?nps-apt識別探針溶液，孵育，構(gòu)建ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器；

10、（3）加入顯色試劑tmb和h2o2溶液，并加入磷酸緩沖鹽溶液（pbs），穩(wěn)定反應環(huán)境的ph；將混合溶液，進行顯色反應；然后用紫外-可見光譜法記錄吸光度變化；

11、（4）使用智能手機內(nèi)部的led閃光燈照亮樣品，拍攝圖像；分析紅、綠、藍顏色強度值（rgb）。小程序來自微信“取色器pro”，appid為wx4ca7c174b8197070，備案號：湘icp備2023009588號-3x。

12、步驟3：ldl工作曲線的繪制

13、（1）將不同濃度的ldl溶液加入到ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器中，孵育；使用紫外-可見分光光度計檢測吸光度變化，以ldl濃度作為橫坐標，繪制工作曲線，計算出最低檢測限；

14、（2）使用小程序拍攝圖片后讀取rgb數(shù)值，計算亮度；以ldl濃度作為橫坐標、溶液顏色亮度作為縱坐標，繪制工作曲線，計算出最低檢測限。

15、步驟4：實際樣品中l(wèi)dl的檢測

16、（1）將樣品加入到步驟2中的ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器，在一定溫度下孵育反應一段時間，采用紫外-可見分光光度計進行掃描，記錄652?nm處的吸光度；

17、（2）根據(jù)步驟3所得到的ldl的工作曲線和小程序，同時計算樣品中l(wèi)dl的濃度。

18、進一步，所述步驟1中g(shù)o與aa的質(zhì)量比為1：10；

19、進一步，所述步驟1中rgo與mos2溶液體積比為1：1；

20、進一步，所述步驟1中na2ptcl6的濃度為20?mmol；

21、進一步，所述步驟1中rgo-mos2-pt?nps溶液濃度為1.0?mg/ml，rgo-mos2-pt?nps溶液和ldlapt溶液的體積比為1：1；

22、進一步，所述步驟2中l(wèi)dlapt濃度為2.0?mg/ml，bsa溶液濃度為1%；

23、進一步，所述步驟2中所加入tmb溶液的濃度為50?mm，h2o2溶液的濃度為50?mm；

24、進一步，所述步驟2中所加入pbs的ph為4.5；

25、進一步，所述步驟3和步驟4中紫外-可見分光光度計掃描的波長范圍在500-800nm；

26、優(yōu)選，所述步驟1中所述ldlapt的dna序列為5′-c6-nh2-acctcgattttatattatttcgcttaccaacaactgcaga-3′，最佳濃度為4.0?μm；

27、優(yōu)選，所述步驟1中最佳孵育溫度為25℃；

28、優(yōu)選，所述步驟2中顯色反應的最佳溫度為25℃，最佳反應時間為10?min；

29、優(yōu)選，所述步驟2、步驟3和步驟4中孵育最佳溫度為25℃，最佳孵育時間為40?min；

30、其中，步驟1提供了一種具有良好過氧化物酶活性的rgo-mos2-pt?nps納米材料，并與ldl適配體ldlapt連接，為步驟2提供了rgo-mos2-pt?nps-apt識別探針。步驟2中提供了未修飾的ldlapt作為捕獲探針，選定顯色劑，構(gòu)建了ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器檢測體系。步驟3是步驟2的進一步延伸，當ldl蛋白加入ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器時，捕獲探針ldlapt、識別探針rgo-mos2-pt?nps-apt分別與ldl進行特異性識別而結(jié)合，從而形成適配體-蛋白-適配體夾心型ldlapt/ldl/rgo-mos2-pt?nps-apt復合物結(jié)構(gòu)。利用納米酶的優(yōu)良催化性質(zhì)，催化h2o2分解，產(chǎn)生·oh，進而催化tmb的氧化，將無色tmb氧化為藍色的oxtmb，步驟3的ldl的工作曲線為步驟4的實際樣本中l(wèi)dl濃度的測定提供計算依據(jù)?？梢姴襟E1-4相互支撐，共同作用，才能利用ldlapt和rgo-mos2-pt?nps-apt構(gòu)成的夾心“三明治型”結(jié)構(gòu)建立檢測ldl的rgo-mos2-pt?nps-apt比色型生物傳感器，提高檢測限。

31、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

32、1、利用pt的催化性質(zhì)、石墨烯的高比表面積以及快速電子特性和mos2的優(yōu)異催化性能，制備出具有特殊形貌和理化性質(zhì)的rgo-mos2-pt?nps納米材料。

33、2、使用能夠與ldl高度特異性結(jié)合的ldlapt，與rgo-mos2-pt?nps納米材料連接，設(shè)計合成rgo-mos2-ptnps-apt識別探針，實現(xiàn)對ldl的檢測，檢測限為2.034?μg/ml。