本發(fā)明涉及電化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)藥物性耳聾基因1555g的電化學(xué)傳感器的制備。

背景技術(shù)：

1、世界衛(wèi)生組織(who)2021年的報(bào)告指出，全球有約4.3億聾人，到2050年，這一數(shù)字估計(jì)將增加到7.1億。耳聾通常由遺傳和環(huán)境因素引起，其中約50％歸因于遺傳因素。線粒體dna突變與氨基糖苷類藥物引起的耳聾和非綜合征性耳聾密切相關(guān)，其中1555a>g突變是最常見的突變。目前，有效的治療措施對(duì)氨基糖甙類藥物致聾仍顯不足。因此，預(yù)防氨基糖苷類藥物引起的耳聾至關(guān)重要。

2、目前，耳聾基因檢測(cè)技術(shù)包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)、拷貝數(shù)變異測(cè)序(cnv-seq)、全外顯子組測(cè)序(wes)、高通量測(cè)序(ngs)、多重連接依賴探針擴(kuò)增(mlpa)、反向斑點(diǎn)印跡(rdb)等新技術(shù)，變性高效液相色譜(dhplc)、微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)、高分辨率熔解(hrm)和桑格測(cè)序。但這些技術(shù)存在環(huán)境要求高、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、設(shè)備較為昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以在基層醫(yī)院和社區(qū)診所推廣。

3、金納米粒子(aunps)在電化學(xué)領(lǐng)域有許多優(yōu)勢(shì)，例如金納米粒子具有較強(qiáng)的催化活性、良好的生物相容性和較高的電子轉(zhuǎn)移率。常用的制備方法是化學(xué)還原法，但需要額外引入還原劑。而電化學(xué)還原法不需要使用還原劑，且產(chǎn)物無(wú)污染。

4、目前，已有大量電化學(xué)傳感器采用絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行電化學(xué)法檢測(cè)。該電極可批量生產(chǎn)且成本低，該方法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備便攜，為藥物性耳聾基因1555g檢測(cè)提供了一種新方法。

5、因此，本申請(qǐng)?zhí)岢鲆环N金納米顆粒修飾的絲網(wǎng)印刷電極制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供檢測(cè)藥物性耳聾基因1555g的電化學(xué)傳感器的制備方法。

2、本發(fā)明的電化學(xué)法檢測(cè)原理為：電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)源于dna結(jié)合到傳感器表面時(shí)，帶負(fù)電荷的dna會(huì)阻礙fe[(cn)6]3-/4-向電極表面的擴(kuò)散，電流減小。采用差分脈沖伏安法(dpv)方法在含有0.1mol/l?kcl的fe[(cn)6]3-/4-溶液中進(jìn)行檢測(cè)以獲得電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。隨著目標(biāo)dna片段的濃度增加，電流差值(δi)逐漸增大，根據(jù)目標(biāo)dna濃度的對(duì)數(shù)和δi呈線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)1555g基因的電化學(xué)法檢測(cè)。δi計(jì)算方法如下所示：

3、δi＝i1-i0

4、(i0表示沒(méi)有目標(biāo)dna時(shí)的電流響應(yīng)值，i1表示存在目標(biāo)dna時(shí)的電流響應(yīng)值)利用dpv記錄電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的氧化峰電流，其電流差值與濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。據(jù)此，可實(shí)現(xiàn)藥物性耳聾基因1555g的定量分析。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

6、一種高靈敏的藥物性耳聾基因1555g的電化學(xué)法檢測(cè)，其特征在于，包括如下具體步驟：

7、(1)電極預(yù)處理：

8、直接用超純水沖洗作為電極的預(yù)處理方法；

9、(2)絲網(wǎng)印刷碳電極(spce)的修飾：

10、將haucl4溶液滴到預(yù)處理后的spce表面，在一定電位下進(jìn)行恒電位沉積。沉積完成后棄去工作區(qū)域液體，超純水輕緩洗滌，室溫干燥，記為aunps/spce；

11、(3)捕獲探針(cp)修飾：

12、首先用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tcep)處理捕獲探針dna?1h，處理后稀釋溶液至相應(yīng)濃度，將捕獲探針(cp)滴涂于spce的工作電極上，在適宜溫度下孵育一定時(shí)間；然后，采用超純水沖洗掉電極表面未結(jié)合的探針?lè)肿?，室溫干燥；將dna探針固定在aunps/spce表面，記為cp/aunps/spce；

13、(4)加入目標(biāo)dna：

14、加入不同濃度1555g?dna在適宜溫度下孵育雜交一定時(shí)間，然后用超純水沖洗電極，除去未雜交的序列，記為1555g?dna/cp/aunps/spce。

15、電化學(xué)法檢測(cè)步驟包括：

16、將電極置于含有0.1mol/l?kcl的fe[(cn)6]3-/4-溶液中采用dpv法檢測(cè)以獲得電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。隨著目標(biāo)dna片段濃度增加，電流差值(δi)逐漸增大，根據(jù)目標(biāo)dna濃度的對(duì)數(shù)與δi呈線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)1555g基因的電化學(xué)法檢測(cè)。

17、作為優(yōu)選，所述haucl4溶液濃度為0.25～1.5mm。

18、作為優(yōu)選，所述haucl4溶液沉積時(shí)間為1～6min。

19、作為優(yōu)選，所述捕獲探針?lè)跤龝r(shí)間為10～60min。

20、作為優(yōu)選，所述捕獲探針濃度為1.0～5.0μm。

21、作為優(yōu)選，所述dna雜交時(shí)間為10～60min。

22、作為優(yōu)選，所述dna雜交溫度為4～37℃。

23、本發(fā)明的上述技術(shù)方案至少包括以下有益效果：

24、(1)本發(fā)明所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)使用絲網(wǎng)印刷碳電極配合電化學(xué)工作站對(duì)藥物性耳聾1555g基因進(jìn)行定量測(cè)定，檢測(cè)儀器操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。

25、(2)本發(fā)明所述的電化學(xué)檢測(cè)方法中所用的spce，制作成本低廉，制作過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，可實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。spce為一次性使用，既避免了采用傳統(tǒng)柱電極需進(jìn)行單調(diào)沉悶的打磨拋光，又避免了因電極的重復(fù)使用而造成的實(shí)驗(yàn)交叉污染問(wèn)題。

26、(3)本發(fā)明所述的電化學(xué)檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、無(wú)污染，可實(shí)現(xiàn)微型化檢測(cè)，利于臨床推廣應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了一種電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物性耳聾1555a>g基因分型和定量分析檢測(cè)，有助于藥物性耳聾的早期檢測(cè)和臨床診斷，對(duì)存在1555a>g基因突變的敏感人群禁用氨基糖苷類抗生素，對(duì)于預(yù)防藥物性耳聾，減輕家庭和國(guó)家醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種電化學(xué)傳感器的制備，其特征在于，步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其中，所述絲網(wǎng)印刷碳電極包括——印制電極的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)基片、pet基片上印制的外部絕緣層和基片上一端的導(dǎo)線接口，其特征在于所述的基片上還印制有三個(gè)電極，分別為碳工作電極、ag/agcl參比電極和碳對(duì)電極，三個(gè)電極形成一個(gè)圓形工作區(qū)域，各電極通過(guò)絕緣膜下印制的導(dǎo)線與接口相連。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的haucl4溶液，其特征在于：haucl4溶液的濃度為0.25～15mm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉積電位，其特征在于：沉積電位為-1.0～+1.0v。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的tcep，其特征在于：tcep的濃度為0.1～5.0m。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于：捕獲探針稀釋后的濃度為1.0～50μm。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)法檢測(cè)，其特征在于，步驟5中所述dpv參數(shù)設(shè)置為：檢測(cè)電壓設(shè)置為-0.1～0.4v，脈沖幅度50mv，脈沖寬度0.2s，脈沖周期0.5s；dpv檢測(cè)均在室溫(25.0±1.0℃)下進(jìn)行。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種簡(jiǎn)便快速的藥物性耳聾基因1555G檢測(cè)方法。本發(fā)明采用金納米粒子修飾絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)制備AuNPs/SPCE，并將DNA探針(CP)固定在AuNPs/SPCE表面上,記為CP/AuNPs/SPCE，加入不同濃度target?DNA孵育，在適宜溫度下進(jìn)行雜交反應(yīng)，用超純水沖洗反應(yīng)后的電極，除去未雜交的序列，記為Target?DNA/CP/AuNPs/SPCE。采用差分脈沖伏安法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)電化學(xué)響應(yīng)所得峰電流強(qiáng)度差值與target?DNA濃度間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)target?DNA的快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測(cè)。所述方法為藥物性耳聾基因1555G檢測(cè)提供了一種新方法。

技術(shù)研發(fā)人員：張曉清,張金珠,丁敏,魏雪,閔從毓
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15