本發(fā)明屬于生物芯片，具體涉及一種目視化檢測(cè)呼吸道病毒的抗原芯片、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、病毒性肺炎作為全球范圍內(nèi)高發(fā)病率和死亡率的主要病癥，其病原體的多樣性和復(fù)雜性給臨床診斷和疾病控制帶來了巨大挑戰(zhàn)。從流感病毒、呼吸道合胞病毒到副流感病毒、人偏肺病毒、人類腺病毒以及人冠狀病毒等，這些病毒性病原體不僅種類繁多，而且同種病原體還存在不同的亞型，使得病毒性肺炎的臨床表現(xiàn)多樣且難以與細(xì)菌感染相區(qū)分，這些病毒在臨床表現(xiàn)上初期大多呈現(xiàn)為輕微的呼吸道感染癥狀，與細(xì)菌感染難以區(qū)分，給早期準(zhǔn)確診斷帶來了困難。在流行病學(xué)調(diào)查中，病毒感染者往往難以確定是否因接觸其他動(dòng)物從而感染動(dòng)物源病毒，如禽流感、豬流感等，這些病毒通常具有更高的侵襲性和致死率。此外，病毒病原體的快速變異和跨物種傳播能力也增加了疫情防控的難度。

2、傳統(tǒng)的呼吸道病毒檢測(cè)方法包括組織細(xì)胞培養(yǎng)法、血清學(xué)和直接檢測(cè)法（包括電鏡法）、間接或直接免疫熒光抗體法（ifa/dfa）、免疫測(cè)定（eia）、酶活性測(cè)定（神經(jīng)氨酸酶測(cè)定）以及核酸擴(kuò)增法（pcr）等，雖然這些方法在病毒性疾病診斷中曾起著十分重要的作用，但都存在一定的局限性。核酸測(cè)序（pcr技術(shù)）雖然適用于早期診斷，但存在檢測(cè)周期長、可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果以及每次只能檢測(cè)一種微生物的缺點(diǎn)。免疫層析技術(shù)雖然檢測(cè)速度快、操作簡便，結(jié)果觀察直接，但準(zhǔn)確性較差，且每種試紙條只能針對(duì)單一種類的病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，無法滿足臨床對(duì)多種病原體同時(shí)檢測(cè)的需求。因此，研發(fā)一種靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低廉的目視化檢測(cè)呼吸道病毒的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于臨床診斷和傳染病控制具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有呼吸道病毒檢測(cè)方法存在的檢測(cè)速度慢、操作復(fù)雜、結(jié)果不直觀、成本高等問題，亟需一種靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低廉的目視化檢測(cè)呼吸道病毒的方法，本發(fā)明旨在于提供一種目視化檢測(cè)呼吸道病毒的抗原芯片、試劑盒及應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供一種目視化呼吸道病毒的抗原芯片，所述抗原芯片由載體和固定在載體上的捕捉抗體組成，所述載體與捕捉抗體通過共價(jià)偶聯(lián)或非特異性吸附固定，形成抗體陣列，用于特異性捕捉待測(cè)抗原；檢測(cè)時(shí)，待測(cè)病毒抗原與含標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，形成抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，待測(cè)病毒抗原與抗原芯片上的捕捉抗體特異性結(jié)合，含標(biāo)記抗體與顯色液反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，判斷待測(cè)病毒抗原的存在與否及其濃度；

4、所述捕捉抗體為待測(cè)病毒抗原的單克隆抗體1；

5、所述含標(biāo)記抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測(cè)病毒抗原的單克隆抗體2；

6、所述單克隆抗體2與單克隆抗體1可特異性識(shí)別待測(cè)病毒抗原的不同區(qū)域。

7、所述待測(cè)病毒抗原為新冠病毒、甲流病毒、乙流病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒中任意一種的表面抗原。

8、進(jìn)一步地，所述待測(cè)病毒抗原為甲流病毒或呼吸道合胞病毒的表面抗原。

9、所述載體為硝酸纖維素膜或環(huán)氧化玻片。

10、進(jìn)一步地，所述載體為硝酸纖維素膜。

11、所述捕捉抗體通過共價(jià)偶聯(lián)蛋白修飾方法固定在環(huán)氧化玻片載體上；

12、所述捕捉抗體通過非特異性吸附固定在硝酸纖維素膜載體上。

13、進(jìn)一步地，所述固定包括：將所述捕獲抗體稀釋后點(diǎn)樣于環(huán)氧化玻片或硝酸纖維素膜載體上，40%～60%濕度過夜后，于36~38℃烘箱固定20～40min，利用抗體氨基酸殘基上的氨基，在偏堿性條件下，與環(huán)氧基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，以n-c鍵形式共價(jià)偶聯(lián)到環(huán)氧化基團(tuán)上。

14、所述的抗原芯片還包括：陽性對(duì)照，和/或陰性對(duì)照。

15、所述顯色液為dab顯色液或tmb顯色液。

16、上述的目視化檢測(cè)病毒的抗原芯片在制備檢測(cè)呼吸道病毒試劑盒中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明提供一種檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒，所述試劑盒含上述的目視化檢測(cè)病毒的抗原芯片。

18、本發(fā)明提供一種體外非診斷性地檢測(cè)呼吸道病毒的方法，包括：（1）將含待測(cè)病毒抗原的樣品加入含標(biāo)記抗體的緩沖液中，形成抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物；（2）將含有抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的反應(yīng)體系加到上述目視化檢測(cè)病毒的抗原芯片含捕捉抗體的檢測(cè)點(diǎn)上，待測(cè)病毒抗原與捕捉抗體結(jié)合，從而將抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物固定在檢測(cè)點(diǎn)上；（3）向芯片的檢測(cè)點(diǎn)加入顯色液顯色，根據(jù)顯色深淺和位置確定樣品中待測(cè)病毒抗原的存在與否及其濃度。

19、進(jìn)一步地，所述含待測(cè)甲流病毒抗原的樣品的濃度為0.025mg/ml~1?mg/ml，所述捕捉抗體的濃度為0.125mg/ml~0.0313mg/ml；所述標(biāo)記抗體濃度≥0.1mg/ml。

20、進(jìn)一步地，所述呼吸道合胞病毒抗原的樣品的濃度為0.025?mg/ml~1?mg/ml；所述捕捉抗體濃度為0.25mg/ml~0.0313mg/ml，所述標(biāo)記抗體濃度≥0.1mg/ml。

21、進(jìn)一步地，加入顯色液顯色條件為：常溫1～3min。

22、所述方法還包括設(shè)置陽性對(duì)照和/或陰性對(duì)照，以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、本發(fā)明提供的目視化檢測(cè)呼吸道病毒的抗原芯片，具有高特異性、高靈敏度、目視化檢測(cè)、簡化檢測(cè)流程和提高檢測(cè)通量等顯著優(yōu)點(diǎn)，單克隆抗體1和單克隆抗體2分別特異性識(shí)別待測(cè)病毒抗原的不同區(qū)域，這種雙重特異性識(shí)別機(jī)制有效降低了非特異性結(jié)合的可能性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；hrp標(biāo)記抗體與顯色液反應(yīng)后產(chǎn)生的顏色變化明顯，易于觀察，減少了人為誤差，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，hrp標(biāo)記抗體具有信號(hào)放大的作用，使得即使微量的待測(cè)病毒抗原也能被準(zhǔn)確檢測(cè)出來，抗原芯片上的捕捉抗體以高密度陣列形式固定，增加了抗原與抗體的接觸機(jī)會(huì)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度；該芯片上的捕捉抗體可以根據(jù)需求進(jìn)行更換或添加，因此目視化檢測(cè)病毒抗原芯片可以靈活擴(kuò)展應(yīng)用于不同種類的病毒檢測(cè)，為臨床診斷和治療提供了更多的選擇和可能性。

25、本發(fā)明提供的試劑盒，包含目視化檢測(cè)病毒的抗原芯片，為呼吸道病毒的檢測(cè)提供了一種完整的解決方案，該試劑盒具有操作簡便、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，能夠顯著提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性；拓展性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測(cè)，將不同種類的病毒抗體固定到載體上，搭配對(duì)應(yīng)的hrp標(biāo)記抗體，能夠輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類病毒抗原的檢測(cè)；組成成分簡單，檢測(cè)操作便捷。

26、本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，通過預(yù)先將捕捉抗體固定在載體上形成抗體陣列，使得檢測(cè)過程更加快速。在樣本加入后，病毒抗原能夠迅速與捕捉抗體結(jié)合，減少了傳統(tǒng)方法中繁瑣的樣本處理步驟，目視化檢測(cè)方式使得結(jié)果判斷更加迅速，無需等待長時(shí)間的儀器分析或復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理，大幅縮短了檢測(cè)時(shí)間，操作簡便，適合現(xiàn)場快速篩查，抗原芯片可以重復(fù)使用，降低了檢測(cè)成本；與傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)相比，對(duì)檢測(cè)樣本需求量少，檢測(cè)速度更快，僅需將待檢測(cè)樣本與hrp標(biāo)記抗體混合后與檢測(cè)芯片反應(yīng)1h后用顯色液進(jìn)行顯色便可得到針對(duì)多種病毒抗原存在情況的檢測(cè)，一次檢測(cè)獲得信息量更豐富，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，為臨床診斷和治療提供了更多有價(jià)值的信息；與免疫層析方法相比，靈敏度和準(zhǔn)確度更高，更容易滿足定量需求，使得本發(fā)明在病毒抗原檢測(cè)中具有更高的應(yīng)用價(jià)值和準(zhǔn)確性，檢測(cè)方法可以靈活應(yīng)用于不同種類的病毒檢測(cè)，只需更換或添加相應(yīng)的捕捉抗體即可；檢測(cè)結(jié)果直觀清晰，顯色后根據(jù)對(duì)應(yīng)檢測(cè)點(diǎn)是否有棕褐色出現(xiàn)即可判斷檢測(cè)樣本中是否存在對(duì)應(yīng)病毒抗原，不需要機(jī)器判讀，對(duì)檢測(cè)場所，檢測(cè)人員要求低，為臨床診斷和治療提供了更多的選擇和可能性，滿足了不同病毒檢測(cè)的需求，這種方法有望成為未來呼吸道病毒檢測(cè)的主流技術(shù)，為臨床診斷和治療提供有力支持。