本發(fā)明屬于生物組織學(xué)，具體涉及一種運(yùn)用蛋白標(biāo)記物進(jìn)行組織學(xué)染色的方法及在區(qū)分篩分子和伴胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、竹類植物屬于禾本科剛竹屬植物。維管組織散在分布在基本組織中。竹類植物韌皮部與其他植物一樣，由篩分子和伴胞構(gòu)成。伴胞與篩管是由同一母細(xì)胞分裂而來(lái)，二者相伴而生，長(zhǎng)度相等或伴胞較篩管稍短。篩管和伴胞的細(xì)胞壁均無(wú)木質(zhì)化加厚。另外，伴胞具有豐富的原生質(zhì)。

2、對(duì)于發(fā)育早期和中期的筍芽來(lái)說(shuō)，多種管狀細(xì)胞均處于分化狀態(tài)，特定成分和特化結(jié)構(gòu)正在形成。此時(shí)，僅僅通過(guò)細(xì)胞的大小和形態(tài)難以將它們準(zhǔn)確地區(qū)別開(kāi)來(lái)。同時(shí)，篩管和伴胞的細(xì)胞壁均無(wú)木質(zhì)化加厚。難以通過(guò)常規(guī)的組織學(xué)染色方法，例如番紅固綠等，區(qū)分韌皮部的篩分子和伴胞。

3、雖然借助透視電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱透射鏡）能夠觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞器、胞質(zhì)和胞核等，為分辨組織發(fā)育和細(xì)胞類型提供較多的信息；但是相較于常規(guī)石蠟包埋的樣本來(lái)說(shuō)，透射電鏡樣本用時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣，操作難度大，試劑費(fèi)高，難以廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種運(yùn)用蛋白標(biāo)記物進(jìn)行組織學(xué)染色的方法及在區(qū)分篩分子和伴胞中的應(yīng)用，可通過(guò)組織學(xué)染色的方法僅染色伴胞，從而滿足電子顯微鏡下的輕松分辨。

2、本發(fā)明提供了抗體在分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞中的應(yīng)用，所述抗體為利用甲基化的組蛋白生成的抗體。

3、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，所述甲基化的組蛋白包括對(duì)組蛋白h3進(jìn)行甲基化。

4、本發(fā)明還提供了一種分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞的方法，包括以下步驟：（1）將目標(biāo)植物的部分組織取下后制備組織切片；

5、（2）將組織切片浸入edta抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原，然后滅活內(nèi)源性酶后進(jìn)行封閉；

6、（3）向封閉后的組織切片中依次進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育，所述一抗為由甲基化的組蛋白生成的抗體；所述二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔igg（servicebio，gb23303，稀釋比為1:200）；

7、（4）向步驟（3）孵育后的組織切片中滴加顯色劑進(jìn)行顯色，水洗后再利用蘇木素復(fù)染，水洗返藍(lán)；

8、（5）將返藍(lán)的組織切片進(jìn)行脫水、透明和封片后進(jìn)行顯微鏡觀察，染色的管狀細(xì)胞為伴胞，未染色的細(xì)胞為篩分子。

9、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（1）所述目標(biāo)植物包括剛竹屬植物。

10、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（3）所述一抗包括anti-h3k27me3抗體。

11、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，進(jìn)行所述一抗孵育時(shí)，稀釋比為1:50~200，在4℃環(huán)境中孵育8~12h。

12、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（3）所述二抗孵育前，還包括復(fù)溫至37℃后，用pbs沖洗，然后滴加所述二抗；

13、所述二抗孵育的溫度為37℃，時(shí)間為30min。

14、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（4）所述顯色劑包括dab，所述dab的工作液濃度為0.05%（w/v），室溫（25℃）孵育1~15min。

15、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（5）所述脫水包括利用梯度濃度的酒精溶液進(jìn)行脫水。

16、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，步驟（5）所述透明包括置于二甲苯溶液中浸泡10min。

17、本發(fā)明還提供了上述方法在確定韌皮部管狀分子的細(xì)胞類型和/或發(fā)育階段評(píng)估中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明還提供了上述方法在檢測(cè)h3k27me3在植物組織中的定位、數(shù)量和分布中的應(yīng)用。

19、有益效果：本發(fā)明公開(kāi)了一種分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞的方法，利用表觀蛋白標(biāo)記物，采用組織學(xué)染色的方法，可在特定結(jié)構(gòu)如篩分子的細(xì)胞核消亡之前，利用細(xì)胞是否著色分辨韌皮部的兩種共生的管狀分子：篩分子和伴胞；同時(shí)，還能根據(jù)著色的位置和深淺程度分辨出甲基化組蛋白與伴胞互作的具體位置，以及評(píng)估伴胞的發(fā)育程度，靈敏度高，精準(zhǔn)度高。

20、本發(fā)明實(shí)施例中，利用組蛋白h3賴氨酸27三甲基化（h3k27me3）抗體進(jìn)行組織學(xué)染色，以組織切片為樣本，根據(jù)染色情況，在光學(xué)顯微鏡下即可特異性分辨韌皮部管狀分子的細(xì)胞類型，如伴胞可基于抗體h3k27me3在組織中的表達(dá)的數(shù)量而表現(xiàn)出染色，如呈棕色、黃棕色或棕褐色，但篩分子則沒(méi)有明顯染色。同時(shí)，還能利用本發(fā)明所述方法，借助電子顯微鏡通過(guò)檢測(cè)組織或細(xì)胞中h3k27me3蛋白的表達(dá)情況，確定細(xì)胞類型、發(fā)育階段評(píng)估，以及檢測(cè)h3k27me3在組織中的定位、數(shù)量和分布。本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)單易行，成本低，檢測(cè)靈敏度高、精準(zhǔn)度高。

技術(shù)特征：

1.抗體在分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗體為利用甲基化的組蛋白生成的抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述甲基化的組蛋白包括對(duì)組蛋白h3進(jìn)行甲基化。

3.一種分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）將目標(biāo)植物的部分組織取下制備組織切片；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟（1）所述目標(biāo)植物包括剛竹屬植物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟（3）所述一抗包括h3k27me3抗體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，進(jìn)行所述一抗孵育時(shí)，稀釋比為1:50~200，在4℃環(huán)境中孵育8~12h。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟（3）所述二抗孵育前，還包括復(fù)溫至37℃后，用pbs沖洗，然后滴加所述二抗；

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟（4）所述顯色劑包括dab，所述dab的工作液濃度為0.05%（w/v），所述顯色劑的室溫孵育1~15min。

9.權(quán)利要求3~8任一項(xiàng)所述方法在確定韌皮部管狀分子的細(xì)胞類型和/或發(fā)育階段評(píng)估中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求3~8任一項(xiàng)所述方法在檢測(cè)h3k27me3在植物組織中的定位、數(shù)量和/或分布中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種運(yùn)用蛋白標(biāo)記物進(jìn)行組織學(xué)染色的方法及在區(qū)分篩分子和伴胞中的應(yīng)用，屬于生物組織學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了一種分辨植物韌皮部篩分子和伴胞早期管狀細(xì)胞的方法，利用表觀蛋白標(biāo)記物，采用組織學(xué)染色的方法，可在特定結(jié)構(gòu)如篩分子的細(xì)胞核消亡之前，利用細(xì)胞是否著色分辨韌皮部的兩種共生的管狀分子：篩分子和伴胞；同時(shí)，還能根據(jù)著色的位置和深淺程度分辨出甲基化組蛋白與伴胞互作的具體位置，以及評(píng)估伴胞的發(fā)育程度，靈敏度高，精準(zhǔn)度高。

技術(shù)研發(fā)人員：李英
受保護(hù)的技術(shù)使用者：國(guó)際竹藤中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15