專利名稱：一種具殺線蟲活性的木霉屬真菌及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術領域，具體涉及一種殺線蟲真菌及其制備方法與應用。
背景技術：
植物寄生線蟲是一類重要的病原微生物，分布廣、種類多，全世界已報道的植物線蟲有200多屬5000余種，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴重為害(馮志新，2001)。據(jù)估計全球每年由植物寄生線蟲所造成的作物損失達780億美元(Barker et al，1998)。就現(xiàn)今危害最為嚴重的線蟲種類——根結線蟲而言，其有著廣泛的寄主，且為世界性分布，每年可給全球作物總產(chǎn)量造成10%以上的損失(Whitehead，1998)。植物線蟲具有隱蔽性、多寄主性、頑固性、易傳播的特點，其種群增長迅速，給防治上帶來了諸多的困難。自從20世紀40年代化學技術的革命后，化學殺蟲劑被廣泛用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)，并在害蟲防治中占居重要地位，與此同時，由于人們長期過分依賴化學農(nóng)藥，且缺乏生態(tài)意識，造成了嚴重的環(huán)境污染。殺線蟲劑多為高毒力高殘留化學農(nóng)藥，這些藥物對人畜不安全，對環(huán)境污染嚴重，并易使線蟲產(chǎn)生抗藥性，對有益生物殺傷力強。隨著人們環(huán)保意識的增強，對健康食品要求的日益增高，以往用于植物線蟲防治的高毒農(nóng)藥多以法律的形式給予了禁用，人們將研究重點轉(zhuǎn)向了生物防治。生物防治具有對人畜安全，對環(huán)境友好等優(yōu)點，因此，生物防治方法在植物線蟲病害的防治地位尤顯重要。目前木霉是多種植物病害包括根結線蟲病的重要生防菌，綠木霉是重要的生防木霉之一，研究開發(fā)綠木霉對防治植物寄生線蟲具有重要意義。目前關于綠木霉的相關技術報道有限，市場上無來源于木霉菌尤其是綠木霉菌的用于防治線蟲的商品生防制劑，尚屬技術空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有技術的不足，提供一株新的具有殺線蟲功能的綠木霉真菌。本發(fā)明的另一個目的是提供所述綠木霉的分離方法。本發(fā)明的另一個目的是提供所述綠木霉的制備方法。本發(fā)明還有一個目的是提供所述綠木霉的應用。本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)本發(fā)明提供一株具殺線蟲活性的綠木霉，本申請人從廣東省深圳灣紅樹林根際土樣中分離得到一株對線蟲具有很好毒殺作用的綠木霉(Hypocrea virens H22，縮寫為 H. virens H22)，菌株于2011年9月2日保存于中國湖北武漢市武昌珞珈山中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO =M 2011303。所述綠木霉菌株的分離方法為在CMA平板上撒l.Og 土樣，接入約1000條南方根結線蟲二齡幼蟲，25°C培養(yǎng)3天(d)后，鏡檢并用針挑取死蟲體上及其周圍單個的真菌分生孢子于含硫酸鏈霉素50ppm的CMA平板上，純化獲得真菌；所述CMA培養(yǎng)基為20g玉米粉， 15g瓊脂粉，IOOOml水。所述綠木霉(H. virens H22)的菌株形態(tài)特征為在PDA上初期為白色，中期顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，有發(fā)達的氣生菌絲，后期產(chǎn)生大量的分數(shù)孢子梗及分生孢子，分生孢子梗對生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝頂端為小梗，瓶狀，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多個分生孢子粘聚成球形的孢子頭。本發(fā)明進一步對綠木霉進行分子鑒定，擴增靶標序列為ITS區(qū)，ITS序列如表SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明同時提供了所述綠木霉(Hypocrea virens H22)的制備方法，包括固體培
養(yǎng)基培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)方法。所述固體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) :200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g 瓊脂粉，IOOOml水；培養(yǎng)方法為將綠木霉(H. virens H22)菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基上，用封口膜封口后于25 下培養(yǎng)2 3天。所述液體培養(yǎng)基配方為CMA培養(yǎng)液，配方為玉米粉20g，蒸餾水1000mL。培養(yǎng)方法為在每個500mL三角瓶裝200mL CMA培養(yǎng)液，121 °C下濕熱滅菌20min，冷卻后每瓶接入5片活化后的綠木霉菌圓片，在180rmp27°C下暗培養(yǎng)8d后，在4°C條件下12000rmp離心IOmin
得上清液。上清液可保存于4°C冰箱中待用。本發(fā)明提供了所述綠木霉(H. virens H22)的應用，根據(jù)其對線蟲的顯著活性，提供其在殺滅植物寄生線蟲方面的應用，并具體提供了殺線蟲藥劑試驗結果。根據(jù)所述應用，本發(fā)明進一步提供了所述綠木霉(H. virens H22)在制備植物寄生線蟲生防制劑方面的應用。優(yōu)選地，利用綠木霉(H. virensH22)的幼嫩孢子；優(yōu)選的劑量范圍是3X107 3X109個孢子/kg 土壤。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一株新的綠木霉(H. virens H22)菌株，具有良好的殺線蟲活性，可應用于制備殺線蟲活性制劑，填補了本技術領域的技術不足，并進一步提供了所述綠木霉 (H. virens H22)的分離和培養(yǎng)方法及應用，為生物防治線蟲提供重要的技術基礎。


圖1固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對全齒復活線蟲的作用；圖2固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對松材線蟲的作用；圖3固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對爪哇根結線蟲的作用；圖4固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對南方根結線蟲的作用；圖5綠木霉(H. virens H22)對南方根結線蟲卵孵化的抑制率；圖6綠木霉(H. virens H22)液體培養(yǎng)液對南方根結線蟲的作用；圖7綠木霉(H. virens H22)對南方根結線蟲的效果的情況(防治效果)；圖8綠木霉(H. virens H22)不同的施菌量對番茄伸長生長的影響情況；圖9綠木霉(H. virens H22)不同的施菌量對番茄生物量的影響情況。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑原料均為常規(guī)市購產(chǎn)品。實施例1綠木霉(H. virens H22)的分離和鑒定培養(yǎng)基配方為CMA培養(yǎng)基20g玉米粉，15g瓊脂粉，IOOOml水。在培養(yǎng)基上撒1. Og 土樣(取自廣東省深圳灣紅樹林根際)，接入約1000條南方根結線蟲二齡幼蟲(J2)，25°C培養(yǎng)3d后，鏡檢并用針挑取死蟲體上及其周圍單個的真菌分生孢子于含硫酸鏈霉素50ppm的CMA平板上，純化獲得真菌。所述綠木霉(Hypocrea virens H22)的菌株形態(tài)特征為在PDA上初期為白色，中期顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，有發(fā)達的氣生菌絲，后期產(chǎn)生大量的分數(shù)孢子梗及分生孢子，分生孢子梗對生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝頂端為小梗，瓶狀，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多個分生孢子粘聚成球形的孢子頭。本發(fā)明進一步對綠木霉進行了分子鑒定，擴增靶標序列為ITS區(qū)，通過以下實驗步驟獲得ITS序列如表SEQ ID NO 1所示。(1)基因組DNA的提取(a)用解剖刀刮取PDA平板上27°C培養(yǎng)3d的菌絲在液氮中研磨成粉狀；將菌絲粉迅速放入1. 5mL的液氮預冷離心管中，每管0. 3g ；(b)用 500 μ L DNA抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl, 750mM NaCl, 40Mm EDTA)懸浮步驟(a)離心管中的菌絲粉，并加入50μ L 20%十二烷基硫酸鈉(SDQ輕輕混合，37°C處理 Ihr ；(c)加入 75 μ L 的 5Μ NaCl 禾口 65 μ L CTAB 溶液(0. 75Μ NaCl 含 10% CTAB)，65°C 水浴20min ；(d)加入步驟(c)管中液體等體積的酚-氯仿-異戊醇05 24 1，體積比) 抽提，5000g離心lOmin，取上清；(e)重復步驟d ；(f)加 2 μ L RNase (10mg/mL) 37°C處理 30min ；(g)加入與步驟(f)管中液體等體積的異丙醇混勻，5000g，離心IOmin沉淀DNA ；(h)用0. 5mL體積比濃度為70%的酒精洗滌沉淀，離心2min，倒掉酒精，風干；(i)加入 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新懸浮 DNA ；(j)每個管中的樣取ZyLJarkerfOOO (Takara，日本)取5yL，用的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。(2) ITS 區(qū)的 PCR 擴增以菌株的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITSl和ITS4擴增ITS區(qū)的片段。所述ITSl和ITS4的核苷酸序列如下ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘；ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘；反應體系模板1 μ L ;10X 緩沖液2. 5 μ L ；4XdNTP 0. 5 μ L ；引物 ITSll μ L ；引物 ITS41 μ L ；酶0. 25 μ L ；水18. 75 μ L。以不加模板為陰性對照。反應程序94°C5min ；94°C 30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C2min ；4°C 00。PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到PMD-18T載體，然后轉(zhuǎn)化克隆，送交上海博尚生物技術有限公司測序。(3)序列分析序列分析的結果通過國際互聯(lián)網(wǎng)進行序列同源性檢索，檢索主程序采用BLASTN， 即核酸序列對核酸序列數(shù)據(jù)庫的檢索，序列分析采用DNAMar軟件進行。比對結果發(fā)現(xiàn)與該菌同源性最高的均為綠木霉(HQ608079，JF439516，⑶111539， HQ229950和HQ229948)真菌，同源性均超過99%，進一步表明本發(fā)明所述菌為綠木霉菌。實施例2綠木霉(H. virens H22)的固體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)200g馬鈴薯，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，IOOOmL水；在每個90mm的培養(yǎng)皿中倒入約占培養(yǎng)皿高度1/3厚的PDA培養(yǎng)基，將綠木霉 (H. virens H22)菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基上，用封口膜封口后于25 下培養(yǎng)2 3 天。將菌種保存于4°C冰箱中待用，或直接配備孢子培養(yǎng)液使用。實施例3綠木霉(H. virens H22)的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為CMA培養(yǎng)液玉米粉20g，蒸餾水1000mL。每個500mL三角瓶裝200mL CMA培養(yǎng)液，121°C下濕熱滅菌20min，冷卻后每瓶接入5片活化后的綠木霉菌圓片，在180rmp 27°C下暗培養(yǎng)8d后，在4°C條件下12000rmp離心IOmin得上清液，上清液保存于4°C冰箱中待用。實施例4綠木霉(H. virens H22)殺線蟲活性試驗1、制備試驗用線蟲(1)制備全齒復活線蟲(Panagrellus redivivus)將全齒復活線蟲(來自中國科學院微生物研究所，也可以采用本領域?qū)嶒炇沂褂玫耐惥€蟲)接種于燕麥片培養(yǎng)基(組成10g燕麥片，30ml水)上，25°C下培養(yǎng)6天左右， 置于4°C冰箱備用。使用前將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)加入無菌水， 瞬時離心，棄上清，重復3次得到潔凈供試線蟲。(2)制備豐公材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在倒入1/3厚PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接入擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)(華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室保存，也可以采用本領域?qū)嶒炇沂褂玫耐惥€蟲)，25°C培養(yǎng) 4 7天。待菌絲鋪滿培養(yǎng)皿后，接種松材線蟲，25°C培養(yǎng)5 8天。用無菌水將線蟲沖洗， 制成含量為2條/ μ 1的線蟲懸浮液。(3)制備爪哇根結線蟲(Meloidogyne javanica)卵及二齡幼蟲取爪哇根結線蟲(本實施例采用的爪哇根結線蟲采自云南昆明，單卵塊純化后保存于華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室，也可以采用本領域?qū)嶒炇沂褂玫耐惥€蟲)的單卵塊接種至預先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或馬鈴薯植株上，約45d后，將根拔起用自來水洗凈，于解剖鏡下挑取根上卵塊，其中卵塊放入帶蓋的IOmL離心管中，加入5mL 0. 5% NaClO,用力振蕩3min，迅速通過雙層篩，上層篩孔徑為250 μ m,下層篩孔徑為38 μ m， 然后用無菌水收集沖洗下層篩中的卵粒；剩余1/2的卵塊置于雙層網(wǎng)篩(鐵絲網(wǎng)和濾紙) 上，網(wǎng)篩浸于加有滅菌水的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25°C孵化3天收集已孵化的二齡幼蟲。
(4)制備南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)卵及二齡幼蟲南方根結線蟲采自廣東廣州，單卵塊純化后保存于華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室，卵及二齡幼蟲的獲得方法同爪哇根結線蟲(Meloidogynejavanica)卵及二齡幼蟲的制備方法。2、試驗方法(1)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對全齒復活線蟲(Pnanagrellus redivivus)的生測試驗參照實施例2，將綠木霉(H. virens H22)用PDA平板活化生長3d后，用直徑為5mm 的打孔器在菌落邊緣打取生長一致的菌絲塊，接種到直徑為90mm含約20ml PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，27. 5°C下，12h光照-1 黑暗交替培養(yǎng)2d，在每皿菌落邊緣加入無菌水配制的全齒復活線蟲液10 μ 1 (約200條蟲)，然后在27. 5°C的恒溫箱中培養(yǎng)，分別于接蟲后Mh、 48h和7 在倒置顯微鏡下觀察記錄死亡線蟲數(shù)和線蟲總數(shù)。在PDA培養(yǎng)基平板上接入相當數(shù)量的線蟲做為對照。每個處理3個重復。根據(jù)以下公式計算線蟲的死亡率和校正死亡率，三個重復求平均
死亡率(％) =χ·
Y Μ觀察的線蟲總數(shù)
校正死亡率(%)=處理組線蟲死亡率—對照組線蟲死亡率χ· 1乂 7 牛1—對照組線蟲死亡率蟲液密度的確定收集活躍的全齒復活線蟲(P. redivivus)，用0. 次氯酸鈉溶液消毒3min，用無菌水漂洗3次GOOOrpm/min離心3min，吸走上清液，再加入無菌水漂洗)，然后再4000rpm/min離心^iin收集線蟲于玻璃廣口瓶中，吸取IOul顯微鏡下觀察，計數(shù)三次。計算蟲的實際數(shù)量密度后，測量實際總體積數(shù)，再用滅菌水進行稀釋至20000條/
mLo(2)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對松材線蟲的生測試驗生測試驗方法同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對全齒復活線蟲 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式驗。(3)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對爪哇根結線蟲的生測試驗生測試驗方法同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對全齒復活線蟲 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式驗。(4)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對南方根結線蟲的生測試驗生測試驗方法同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠木霉(H. virens H22)對全齒復活線蟲 (Pnanagrellus redivivus)白勺生IlJi式驗。(5)綠木霉(H. virens H22)對南方根結線蟲卵孵化的抑制試驗參照實施例3，在直徑為9cm的玉米粉培養(yǎng)基平板上接入Iml綠木霉(H. virens H22)液體培養(yǎng)上清液，均勻涂布于平板上，再接入約200粒南方根結線蟲卵粒，放于25°C培養(yǎng)箱種培養(yǎng)5 7d后，檢查卵的孵化率。對照平板中加入Iml無菌水和卵粒。每個處理3 次重復。根據(jù)以下公式計算線蟲卵孵化的抑制率和校正抑制率，三個重復求平均
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權利要求
1.一種具殺線蟲活性的木霉屬真菌綠木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2 日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO :M 2011303。
2.根據(jù)權利要求1所述具殺線蟲活性的木霉屬真菌綠木霉H22菌株，其特征在于具有如表SEQ ID NO 1所示ITS序列。
3.—種權利要求1具殺線蟲活性的木霉屬真菌綠木霉的制備方法，其特征在于是將所述真菌的菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到；所述PDA培養(yǎng)基組成為200g馬鈴薯、 20g葡萄糖、20g瓊脂粉和IOOOml水。
4.一種權利要求1所述具殺線蟲活性的木霉屬真菌綠木霉的制備方法，其特征是在于將所述真菌的圓片接種于液體培養(yǎng)液培養(yǎng)暗培養(yǎng)后離心得上清液；所述液體培養(yǎng)液為CMA 培養(yǎng)液組成為玉米粉20g，蒸餾水1000mL。
5.一種權利要求1所述具殺線蟲活性的木霉屬真菌綠木霉的應用，其特征在于應用于防治植物寄生線蟲。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于應用于殺滅固著性內(nèi)寄生線蟲或遷移性內(nèi)寄生線蟲。
7.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于采用所述真菌的幼嫩孢子制備植物寄生線蟲生防制劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于是所述植物寄生線蟲生防制劑的劑量范圍是3X107 3X109個孢子/kg 土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具殺線蟲活性的木霉屬真菌及其制備方法與應用。所述具殺線蟲活性的木霉屬真菌為綠木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011303。本發(fā)明提供了所述食線蟲真菌的制備方法，包括液體培養(yǎng)法或固體培養(yǎng)法。本發(fā)明菌株對線蟲具有良好的殺線蟲活性，可應用于制備植物寄生線蟲生防制劑，具有較好的應用前景。
文檔編號A01N63/04GK102399703SQ20111037661
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者卓侃, 唐照磊, 廖金鈴 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學