專利名稱：桑黃活性多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定向發(fā)酵獲得桑黃活性多糖的方法，特別是一種通過培養(yǎng)基成分優(yōu)化配置，利用桑黃菌絲體定向合成水溶性桑黃活性多糖的方法。
背景技術(shù)：
桑黃，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)、多孔菌科、木層孔菌屬，是火木層孔菌(P. igniarius)，鮑氏針層孔菌，裂蹄針層孔菌(P. Iinteus)的俗稱，又稱桑臣、桑耳、胡孫目艮、桑黃菇。桑黃主要活性成分為桑黃多糖，桑黃活性多糖干粉逐漸或已經(jīng)走向國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)。在桑黃的藥用價(jià)值被廣泛揭示以及市場(chǎng)前景看好的同時(shí)，桑黃的產(chǎn)量已經(jīng)成為抑制桑黃應(yīng)用的主要限制因素。由于其菌物特征的特殊性和復(fù)雜性以 及受生存條件的制約，在自然界中其很難形成子實(shí)體，往往需要多年才能形成可用子實(shí)體。而且室內(nèi)培養(yǎng)條件苛刻，人工栽培及其困難，且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)3-4年。而且，由于桑黃價(jià)格昂貴及供不應(yīng)求，必然導(dǎo)致人們對(duì)桑黃菌的無序采集，目前存在的問題是天然桑黃資源匱乏，面臨枯竭，不僅難以滿足市場(chǎng)需要，而且有些地方的某些種質(zhì)資源幾近滅絕。所以利用生物工程進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和人工栽培的研究非常重要。因此，深層液體培養(yǎng)技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)桑黃菌絲體以及其活性多糖物質(zhì)是滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)桑黃相關(guān)產(chǎn)品需求的有效途徑之一。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)桑黃的研究多集中于深層液體發(fā)酵條件優(yōu)化、多糖分離純化技術(shù)、多糖分子結(jié)構(gòu)解析、抗癌、免疫活性機(jī)理等方面。敖宗華等人公開了大規(guī)?；后w深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提物及多糖(專利號(hào)為200410013869. 6),其以大規(guī)模液體發(fā)酵制取桑黃多糖,此外,鄒祥等人公開了一種用于桑黃菌液體培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖的方法(專利號(hào)為200810070224)以及《中國(guó)野生桑黃蘑菇菌株的分離培養(yǎng)方法》(專利號(hào)為200710018319)，這些對(duì)促進(jìn)桑黃多糖產(chǎn)品的開發(fā)有重要的意義。但是，調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前幾乎所有技術(shù)文獻(xiàn)，只關(guān)注桑黃培養(yǎng)的目的是獲得高的多糖含量以及菌絲體，但在生產(chǎn)階段，其多糖活性幾乎無從考慮，這就嚴(yán)重影響著此類產(chǎn)品的質(zhì)量和使用效果。由于復(fù)合碳氮源或這些復(fù)雜培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，批次之間存在成分上的差異，往往造成桑黃菌液體培養(yǎng)生產(chǎn)菌絲體產(chǎn)量和多糖分子量不穩(wěn)定，同時(shí)也給桑黃多糖的下游提取分離帶來困難。目前，從現(xiàn)有文獻(xiàn)分析，就菌種制備而言，為了保證桑黃菌株的旺盛生長(zhǎng)，許多技術(shù)提到要加入桑樹枝或樹葉，或者豐富的維生素或氨基酸。這些措施雖然可以滿足菌株的活化和生長(zhǎng)，但是，從工業(yè)生產(chǎn)的角度而言，如果以此方法制備菌種，由于桑樹枝等農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，而且其所含營(yíng)養(yǎng)成分受自然條件影響大，必然對(duì)建立規(guī)?；姆€(wěn)定工藝不利?，F(xiàn)有技術(shù)中也有這樣的文獻(xiàn)記載，其培養(yǎng)方法是采用PDA培養(yǎng)基來進(jìn)行種子液甚至生產(chǎn)發(fā)酵液培養(yǎng)，而這種及其復(fù)雜的培養(yǎng)基配方是不利于產(chǎn)品的分離純化，也不能滿足現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)要求的需要。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有有關(guān)針對(duì)桑黃水溶性胞外活性多糖和高活性菌絲體培養(yǎng)的工藝和技術(shù)的文獻(xiàn)和專利報(bào)道，雖然有很多文獻(xiàn)報(bào)道了其所具有的活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
現(xiàn)有生產(chǎn)或發(fā)酵合成桑黃菌絲體或多糖的方法中，多以獲得高含量的菌絲體和多糖為主要目的。雖然，這些技術(shù)體系所獲得的菌絲體和多糖也證明有一定的抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、提高免疫力等功能，但是這些功能試驗(yàn)多是以體內(nèi)動(dòng)物或體外培養(yǎng)細(xì)胞試驗(yàn)而證明多糖功能的，而且對(duì)多糖的功能驗(yàn)證是滯后于生產(chǎn)過程的。而且，從多糖含量分析測(cè)定而言，多使用苯酚硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，而此種檢測(cè)體系無法排除培養(yǎng)基中諸如葡萄糖、蔗糖等還原性多糖成分或含有相應(yīng)和硫酸-苯酚試劑發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)物質(zhì)的影響，因此對(duì)生產(chǎn)過程所獲得的多糖的準(zhǔn)確定量難以完成，常常導(dǎo)致雖含有高濃度多糖，但卻無相應(yīng)功能的假象，嚴(yán)重影響了桑黃菌絲體以及多糖產(chǎn)品的使用效果和市場(chǎng)推廣。如果忽視或有意忽略液體發(fā)酵過程中獲得多糖和菌絲體活性的檢測(cè)，是難以保證規(guī)模化生產(chǎn)此類產(chǎn)品的質(zhì)量的。而且，還應(yīng)注意到，多糖屬于一類次級(jí)代謝物，而此類物質(zhì)的合成在自然界中自有其特定的規(guī)律和條件。最近研究已經(jīng)證明，真菌合成三大類次級(jí)代謝物的基因簇在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，往往處于沉默狀態(tài)。如果僅僅是滿足獲得高含量菌絲體或多糖，不考慮其所含活性物質(zhì)的多少或具體活性的高低，必然難以保證此類物質(zhì)生產(chǎn) 的有效性和實(shí)際使用過程中的效果。研究還證實(shí)在stress response條件下,液體培養(yǎng)桑黃或其他真菌獲得具有活性的多糖和菌絲體是和自然條件下的培養(yǎng)條件具有很大差異的，參與這些物質(zhì)和菌絲體形成基因的表達(dá)和翻譯的條件是有很大不同的。具體針對(duì)合成活性多糖而言，自然界中，真菌活性多糖的合成是在相對(duì)溫和、并且相對(duì)平衡的狀態(tài)下合成的，一般要獲得相應(yīng)產(chǎn)物和菌絲的時(shí)間很長(zhǎng)，過程復(fù)雜，受自然條件影響大，獲得相應(yīng)產(chǎn)品是要經(jīng)過大自然多種條件的洗禮才能完成；在深層液體培養(yǎng)條件下，菌絲細(xì)胞在氧氣充足、營(yíng)養(yǎng)相對(duì)豐富等體外條件下，細(xì)胞合成活性多糖的基因表達(dá)和翻譯的條件和桑黃菌在自然條件下相比有很大改變。在這些變化的基因中，針對(duì)于合成活性多糖，變化很明顯的就是好氧環(huán)境的改變，而此改變使得細(xì)胞在此條件下會(huì)產(chǎn)生大量的自由基；而細(xì)胞要在體外這種特殊條件下，能夠正常生長(zhǎng)并合成功能性多糖，據(jù)推測(cè)可能就要首先清除體內(nèi)的這些自由基，典型的清除自由基的體內(nèi)酶包括SOD (超氧化物歧化酶)要參與這一過程。而此類酶系要參與這些過程，需要一些特殊的條件,如這類酶需要Fe、Cu等離子和酶分子的活性中心相結(jié)合，從而激活這些酶的活性，或者其他的特殊的活性維護(hù)條件，以保證菌絲細(xì)胞的存活和進(jìn)一步的合成活性產(chǎn)物。而且研究還表明，從自然界分離得到的真菌，如果在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，細(xì)胞是處于一種Stress response狀態(tài)下，因此，細(xì)胞要發(fā)揮其正常的生理功能，就需要克服細(xì)胞處于不利環(huán)境下的各種障礙，以完成菌絲生長(zhǎng)和合成多糖的生理活動(dòng)。但是，由于一般人工條件下很難滿足細(xì)胞的相應(yīng)生理活動(dòng)的需要，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢、合成功能化合物能力下降或消失。定向發(fā)酵是基于菌株代謝自然規(guī)律，為了生產(chǎn)合成目的產(chǎn)物而采取一定措施如添加特殊抑制劑、弱化或強(qiáng)化相關(guān)基因的表達(dá)，而完成在特定條件下合成特定目的產(chǎn)物的生理活動(dòng)?；谡婢?xì)胞在非自然或人工培養(yǎng)條件下面臨著諸多因素的脅迫，而目前最受關(guān)注的就是氧化脅迫，這種外在的和自然界真菌所處環(huán)境不一樣的條件導(dǎo)致真菌細(xì)胞不能發(fā)揮相應(yīng)的功能。目前的技術(shù)體系，多采用天然或半合成培養(yǎng)基成分，但由于忽略或沒有注意到真菌細(xì)胞在非自然條件下的“氧化脅迫”狀態(tài)對(duì)其生長(zhǎng)和合成多糖的影響。經(jīng)調(diào)研，目前所報(bào)道或申請(qǐng)專利的技術(shù)體系，在利用桑黃菌株獲得菌絲體產(chǎn)品或多糖產(chǎn)品時(shí)，大多只以獲得高比例的菌絲體或高濃度的多糖為主要或唯一目的，而沒有注意到真菌在非自然條件下所受環(huán)境的巨大差異對(duì)其合成活性多糖的影響。總結(jié)而言，現(xiàn)有的這些制備方法主要存在有以下幾個(gè)問題I、現(xiàn)有的桑黃液體培養(yǎng)方法中采用的發(fā)酵培養(yǎng)基多采用天然農(nóng)副產(chǎn)品如土豆汁、糖蜜、黃豆餅粉、玉米漿、或者復(fù)雜的氨基酸組合、植物提取物等為碳氮源，由于復(fù)合碳氮源或這些復(fù)雜培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，批次之間存在成分上的差異，往往造成桑黃菌液體培養(yǎng)桑黃多糖分子量不穩(wěn)定，給桑黃多糖的下游提取分離帶來困難，而且該種方法對(duì)桑黃多糖的制取產(chǎn)率仍然偏低，不能滿足現(xiàn)有市場(chǎng)對(duì)桑黃的需求。2、目前大多數(shù)的技術(shù)文獻(xiàn)，關(guān)注桑黃培養(yǎng)的目的是獲得較高的桑黃多糖含量，對(duì)多糖活性幾乎無從考慮，嚴(yán)重影響到此類產(chǎn)品的質(zhì)量和使用 效果。3、為了保證桑黃菌株的旺盛生長(zhǎng)，許多技術(shù)提到要加入桑樹枝或樹葉，或者豐富的維生素或氨基酸，這些措施雖然可以滿足菌株的活化和生長(zhǎng)，但是，從工業(yè)生產(chǎn)的角度而言，如果以此方法制備菌種，由于桑樹枝等農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，而且其所含營(yíng)養(yǎng)成分受自然條件影響大，必然對(duì)建立規(guī)?；姆€(wěn)定工藝不利，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。4、現(xiàn)有技術(shù)中在利用桑黃菌株獲得菌絲體產(chǎn)品或多糖產(chǎn)品時(shí)，大多只以獲得高濃度的多糖為主要目的，而沒有注意到真菌在非自然條件下所受環(huán)境的巨大差異對(duì)其合成活性多糖的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決目前桑黃活性多糖合成技術(shù)中所存在的問題，提供了一種桑黃多糖產(chǎn)率高、適于工業(yè)化生產(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的桑黃活性多糖的制備方法。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是本發(fā)明的桑黃活性多糖的制備方法包含有以下的步驟I)菌種活化在改良PDA培養(yǎng)基中接種桑黃菌絲體，25 30°C，有氧避光培養(yǎng)至桑黃菌絲體長(zhǎng)滿斜面；上述的IL改良PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯180 200g、葡萄糖10 20g、瓊脂20g、抗氧化劑0. 5 6g，余量為水，改良PDA培養(yǎng)基的pH為6. 5 ;2) 一級(jí)種子液培養(yǎng)按照每50ml的種子液培養(yǎng)基中接入3塊Icm2的斜面菌種的量，將活化后的斜面菌種接入裝有種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，25 30°C，搖床培養(yǎng)120 240小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150 180r/min ；上述的IL種子液培養(yǎng)基中馬鈴薯200 260g、葡萄糖5 30g、KH2P04lg、MgSO40. 5g、抗氧化劑I 6g、CaCl2 0. I 2g、FeSO4 0. 05 0. 35g，余量為水，種子液培養(yǎng)基的PH 為 6. 5 ;3) 二級(jí)種子液培養(yǎng)將步驟2)所得的菌種按照菌種與種子液培養(yǎng)基的體積比為I :10 15的量接入裝有種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，25 30°C搖床培養(yǎng)120小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，得擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種；4)定向發(fā)酵
將步驟3)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入裝有定向發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，菌種與定向發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為I :10 15，保持罐溫28 29°C，罐壓0. 5 0. 7kPa，攪拌速率300 400rpm,通氣量為I :0. 5 0. 7v/v. m,發(fā)酵180 220小時(shí)，得到發(fā)酵液；上述的IL定向發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽粉5 20g、葡萄糖15 100g、FeSO4O. I 0. 6g、抗氧化劑I 6g、天門冬氨酸0. 5 8g、MgS04 lg、KH2P04 I 2g、復(fù)合維生素0. 001 0. 05g、吐溫80 I 10g，余量為水，定向發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5 ;5)提取桑黃活性多糖將步驟4)得到的發(fā)酵液打到減壓濃縮器中，濃縮至濃縮液的體積為原發(fā)酵液體積的0. I 0. 25倍，轉(zhuǎn)移到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，壓濾清液濃縮，加入乙醇至乙醇在濃縮清液中的體積濃度達(dá)到60% 80%，低溫醇析10 20小時(shí)，取沉淀物 用去離子水溶解，噴霧干燥，得到桑黃活性多糖。上述步驟4)的定向發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽粉8 15g、葡萄糖20 100g、FeS040.2 0. 5g、抗氧化劑I 6g、天門冬氨酸0. 5 8g、MgSO4 Ig、KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. 001 0. 05g、吐溫801 10g，余量為水，定向發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5。上述步驟I)的改良PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯185 195g、葡萄糖13 18g、瓊脂20g、抗氧化劑Hg，余量為水。上述步驟2)中的種子液培養(yǎng)基中馬鈴薯22(T240g、葡萄糖l(T20g、KH2PO4 lg、MgSO4 0. 5g、抗氧化劑2 5g、CaCl2 0. I lg、FeSO4 0. I 0. 25g，余量為水，種子液的PH為
6.50上述抗氧化劑是維生素C或維生素P或蘆丁。上述步驟I)所述桑黃菌絲體的名稱為桑黃P0988 (Phellinus sp. P0988)，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012080，保藏日期是2012年3月14日。本發(fā)明主要在桑黃活性多糖的制備方法中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑、天門冬氨酸、維生素等化學(xué)因子對(duì)桑黃菌絲體的生長(zhǎng)有顯著的影響并優(yōu)化了配方和工藝條件，大大提高了桑黃活性多糖的產(chǎn)率和多糖活性，另外，在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑，克服或緩解了非自然條件下真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和合成活性多糖的脅迫條件，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，適用于工業(yè)化應(yīng)用，為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明的影響多糖含量因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)pareto圖。圖2為本發(fā)明的影響總抗氧化活性因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)pareto圖。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合附圖和試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的桑黃活性多糖的制備方法進(jìn)行進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例I本實(shí)施例的桑黃活性多糖的制備方法包括以下步驟步驟I :菌種活化
取出I塊Icm2的桑黃菌絲體接入配制好的20ml的改良PDA培養(yǎng)基中，28°C，有氧避光培養(yǎng)240小時(shí)至桑黃菌絲體長(zhǎng)滿斜面后取出，4°C冰箱中保存；上述的改良PDA培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯190g，葡萄糖15g，瓊脂20g，維生素PL 5g，水添加至1L，培養(yǎng)基的pH值為6. 5。步驟2 :—級(jí)種子液培養(yǎng)取3塊步驟I中Icm2大小的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有50ml種子液培養(yǎng)基的250ml容量的三角瓶中，28°C，轉(zhuǎn)速為150 180r/min，144小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以此作為一級(jí)種子
液培養(yǎng)。種子液培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯230g，葡萄糖15g、KH 2PO4 lg、MgSO4 0. 5g、維生素P 3g、CaCl2 0.5g、FeSO4 0. 25g，加水至1L，種子液培養(yǎng)基的pH值為6. 5，顏色為墨黑色。步驟3 :二級(jí)種子液培養(yǎng)取步驟2所培養(yǎng)的菌種8. 3ml接入裝有IOOml種子液培養(yǎng)基的容量為300ml的三角瓶中進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種與種子液培養(yǎng)基中的體積比為I :12，28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 180r/min,培養(yǎng)120小時(shí)后接入三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至直徑為0. 5_2mm的菌絲球長(zhǎng)滿三角瓶，即培養(yǎng)液中長(zhǎng)滿大小、分布比較均勻的菌絲球。步驟4:定向發(fā)酵將0. 58L步驟3中擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入裝有7L定向發(fā)酵培養(yǎng)基的容積為IOL的發(fā)酵罐中，菌種與定向發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為I :12，保持罐溫28°C，罐壓0. 5-0. 7kPa，攪拌速率350rpm，通氣量I :0. 5-0. 7v/v. m，發(fā)酵198小時(shí)。上述的定向發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽粉llg、葡萄糖60g、FeSO4O. 25g、維生素P2. 5g、天門冬氨酸3. 3g、MgSO4Ig' KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. 025g、吐溫80 4g，加水定容至1L，該培養(yǎng)基的pH為6. 5。 依照GB/T15672-2009，對(duì)本步驟發(fā)酵后的發(fā)酵液中桑黃活性多糖的含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果中桑黃活性多糖的含量為7. 998g/L，桑黃活性多糖的總抗氧化活性為2. QBOmmoI /g步驟5:桑黃活性多糖提取對(duì)步驟4)所得到的發(fā)酵液打到減壓濃縮器中，濃縮至濃縮液的體積為原發(fā)酵液的0. 14倍，轉(zhuǎn)移到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，得清液，清液濃縮，加入適量乙醇，使乙醇在濃縮清液中的體積濃度達(dá)到70%，低溫醇析15小時(shí)，取沉淀用去離子水溶解，噴霧干燥即得到桑黃活性多糖。取上述制取的粗桑黃活性多糖用總抗氧化活性試劑盒(ABTS法)測(cè)定其活性，檢測(cè)粗桑黃活性多糖的產(chǎn)率為54%，其總抗氧化活性為2. 532mmol/g。上述的桑黃菌絲體名稱為桑黃P0988 (Phellinus sp. P0988)，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏編號(hào)CCTCC NO M2012080，其是作為獲得桑黃高活性多糖的生產(chǎn)菌株，保藏日期2012年3月14日。該桑黃菌絲體是在野外采集桑黃子實(shí)體，利用孢子彈射法培養(yǎng)獲得。上述的孢子彈射法具體是由以下步驟實(shí)現(xiàn)A、選擇個(gè)體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)的八九分成熟的桑黃子實(shí)體，切去大部分，菌柄用無菌水沖洗數(shù)遍后再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。B、在接種箱或無菌室內(nèi)，把桑黃子實(shí)體的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面；上端小孔用棉花塞住，培養(yǎng)皿放在一個(gè)鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12 20小時(shí)，菌褶上的孢子就會(huì)散落在培養(yǎng)皿內(nèi)，形成一層粉末狀孢子印，用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種，待孢子萌發(fā)，生成菌落時(shí)，選孢子萌發(fā)早、長(zhǎng)勢(shì)好的菌落進(jìn)行試管培養(yǎng)，試管培養(yǎng)溫度為28 °C,靜置避光培養(yǎng)。實(shí)施例2在上述實(shí)施例I的步驟I中，改良PDA培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯185g、葡萄糖13g、瓊脂20g、維生素P lg，加水定容為1L。本步驟中其他的步驟與實(shí)施例I相同。其他的步驟與實(shí)施例I相同。 實(shí)施例3在上述實(shí)施例I的步驟I中，改良PDA培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯195g、葡萄糖18g、瓊脂20g、維生素P 2g，加水定容為1L。本步驟中其他的步驟與實(shí)施例I相同。其他的步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例4在上述實(shí)施例I的步驟I中，改良PDA培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯180g、葡萄糖10g、瓊脂20g、維生素PO. 5g，加水定容為1L。本步驟中其他的步驟與實(shí)施例I相同。其他的步驟與實(shí)施例I相同。實(shí)施例5在上述實(shí)施例I 3的步驟I中，改良PDA培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、維生素P6g，加水定容為1L。本步驟中其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例6在上述實(shí)施例I 5的步驟2中，所涉及的種子液培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯220g、葡萄糖 10g、KH2PO4 lg、MgSO4 0. 5g、維生素 P 2g、CaCl2 0. lg、FeSO4O. lg，加水定容至 1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例7在上述實(shí)施例I 5的步驟2中，所涉及的種子液培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯240g、葡萄糖 20g、KH2PO4 lg、MgS04 0.5g、維生素 P 5g、CaCl2 lg、FeSO4O. 25g，加水定容至 1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例8在上述實(shí)施例I 5的步驟2中，所涉及的種子液培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g、葡萄糖 5g、KH2P04 lg> MgSO4 0. 5g、維生素 Pig、CaCl2 0. lg> FeSO4 0. 05g,加水定容至 1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例9在上述實(shí)施例I 5的步驟2中，所涉及的種子液培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯260g、葡萄糖 30g、KH2PO4 lg、MgS04 0. 5g、維生素 P6g、CaCl2 2g、FeS04 0. 35g，加水定容至 1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例10
在上述的實(shí)施例I 9的步驟4中，所涉及的定向發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽粉8g、葡萄糖20g、FeSO4 0. 2g、維生素Pig、天門冬氨酸0. 5g、MgSO4 lg、KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. OOlg、吐溫80 lg，加水定容至1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例11在上述的實(shí)施例I 9的步驟4中，所涉及的定向發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽粉15g、葡萄糖100g、FeSO4 0. 5g、維生素P6g、天門冬氨酸8g、MgSO4 Ig、KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. 05g、吐80 10g，加水定容至1L。
其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例12在上述的實(shí)施例I 9的步驟4中，所涉及的定向發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽粉5g、葡萄糖15g、FeS04 0. lg、維生素Pig、天門冬氨酸0. 5g、MgS04lg、KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. 001g、吐溫80 lg，加水定容至1L。其他的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例13在上述的實(shí)施例I 9的步驟4中，所涉及的定向發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽粉20g、葡萄糖100g、FeSO4 0. 6g、維生素P 6g、天門冬氨酸8g、MgSO4 lg、KH2P04 2g、復(fù)合維生素0. 05g、吐溫8010g，加水定容至1L。實(shí)施例14在上述的實(shí)施例I 13中，培養(yǎng)基中所用的維生素P用等質(zhì)量的維生素C或蘆丁替換，其它的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例15上述實(shí)施例I 14中的桑黃活性多糖的制備方法包括以下步驟在步驟I中，桑黃菌絲體接入改良PDA培養(yǎng)基中，在25°C有氧避光培養(yǎng)；本步驟中的其他步驟與對(duì)應(yīng)實(shí)施例相同。在步驟2中，取3塊步驟I中Icm2大小的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有50ml種子液培養(yǎng)基的250ml容量的三角瓶中，25°C，轉(zhuǎn)速150 180r/min，搖床培養(yǎng)180小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，本步驟中其他的步驟與對(duì)應(yīng)實(shí)施例相同。在步驟3中，將IOml步驟2所培養(yǎng)的菌種接入裝有IOOml種子液培養(yǎng)基的容量為500ml的三角瓶中進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種與種子液培養(yǎng)基中的體積比為I :10，25°C搖床培養(yǎng)，本步驟中其他的步驟與對(duì)應(yīng)實(shí)施例相同。在步驟4中將0. 7L步驟3中擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入裝有7L定向發(fā)酵培養(yǎng)基的容積為10L的發(fā)酵罐中，菌種與定向發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為I :10，保持罐溫28°C，罐壓0. 5 0. 7kPa，攪拌速率300 400rpm,通氣量I :0. 5 0. 7v/v. m,發(fā)酵220小時(shí)，本步驟中其他的步驟與對(duì)應(yīng)實(shí)施例相同。其他的步驟與對(duì)應(yīng)實(shí)施例相同，制得桑黃活性多糖，產(chǎn)率為54%。實(shí)施例16在上述實(shí)施例f 14中的桑黃活性多糖的制備方法包括以下步驟在步驟I中，桑黃菌絲體接入改良PDA培養(yǎng)基中，在30°C有氧避光培養(yǎng)；本步驟中的其他操作與實(shí)施例I相同。在步驟2中，取3塊步驟I中Icm2大小的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有50ml種子液培養(yǎng)基的250ml容量的三角瓶中，30°C，轉(zhuǎn)速150 180r/min，120小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，本步驟中其他的步驟與實(shí)施例I相同。在步驟3中，將6. 7ml步驟2所培養(yǎng)的菌種接入裝有IOOml種子液培養(yǎng)基的容量為500ml的三角瓶中進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種與種子液培養(yǎng)基中的體積比為I :15，30°C培養(yǎng)，本步驟中其他的步驟與實(shí)施例I相同。在步驟4中將0. 47L步驟3中擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入裝有7L定向發(fā)酵培養(yǎng)基的容積為IOL的發(fā)酵罐中，菌種與定向發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為I :15，保持罐溫29°C，罐壓0. 5
0.7kPa,攪拌速率300 400rpm,通氣量I :0. 5 0. 7v/v. m,發(fā)酵180小時(shí)，本步驟中其他的步驟與實(shí)施例相同。
其他的步驟與實(shí)施例I相同。為了確定本發(fā)明中定向發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)工藝條件以及最佳配比，還進(jìn)行了以下試驗(yàn)，具體如下I、因子篩選實(shí)驗(yàn)根據(jù)桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)條件，確定出對(duì)桑黃生長(zhǎng)及活性多糖產(chǎn)生可能有影響的因子，PB實(shí)驗(yàn)對(duì)其主要因子進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果如下表I全面因子篩選結(jié)果
麥芽粉維生棄P J醚亞鐵黼鈣E甘銪吐￡80天門冬S酸L總抗氧化g性(iiol/g)多I!含羞(g/L)
權(quán)利要求
1.一種桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于所述方法包含有以下的步驟 1)菌種活化 在改良PDA培養(yǎng)基中接種桑黃菌絲體，25 30°C，有氧避光培養(yǎng)至桑黃菌絲體長(zhǎng)滿斜面； 上述的IL改良PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯180 200g、葡萄糖10 20g、瓊脂20g、抗氧化劑O. 5 6g，余量為水，改良PDA培養(yǎng)基的pH為6. 5 ; 2)一級(jí)種子液培養(yǎng) 按照每50ml的種子液培養(yǎng)基中接入3塊Icm2的斜面菌種的量，將活化后的斜面菌種接入裝有種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，25 30°C，搖床培養(yǎng)120 240小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150 180r/min ； 上述的IL種子液培養(yǎng)基中馬鈴薯200 260g、葡萄糖5 30g、KH2P04lg、MgS04 O. 5g、抗氧化劑I 6g、CaCl2 O. I 2g、FeSO4 O. 05 O. 35g，余量為水，種子液培養(yǎng)基的pH為6.5 ； 3)二級(jí)種子液培養(yǎng) 將步驟2)所得的菌種按照菌種與種子液培養(yǎng)基的體積比為I :10 15的量接入裝有種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，25 30°C搖床培養(yǎng)120小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種； 4)定向發(fā)酵 將步驟3)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入裝有定向發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，菌種與定向發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為I :10 15，保持罐溫28 29°C，罐壓O. 5-0. 7kPa，攪拌速率300 400rpm,通氣量為I :0· 5 O. 7v/v. m,發(fā)酵180 220小時(shí)，得到發(fā)酵液； 上述的IL定向發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽粉5 20g、葡萄糖15 100g、FeSO4O. I O. 6g、抗氧化劑I 6g、天門冬氨酸O. 5 8g、MgSO4 Ig、KH2PO4 I 2g、復(fù)合維生素O. 001 O.05g、吐溫801 10g，余量為水，定向發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5 ; 5)提取桑黃活性多糖 將步驟4)得到的發(fā)酵液打到減壓濃縮器中，濃縮至濃縮液的體積為原發(fā)酵液體積的O.I O. 25倍，轉(zhuǎn)移到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，壓濾清液濃縮，加入乙醇至乙醇在濃縮清液中的體積濃度達(dá)到60% 80%，低溫醇析10 20小時(shí)，取沉淀物用去離子水溶解，噴霧干燥，得到桑黃活性多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于所述步驟4)的定向發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽粉8 15g、葡萄糖20 100g、FeSO4 0. 2 0. 5g、抗氧化劑I 6g、天門冬氨酸0. 5 8g、MgSO4 lg、KH2PO4 lg、復(fù)合維生素0. 001 0. 05g、吐溫801 IOg,余量為水，定向發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于所述步驟I)的改良PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯185 195g、葡萄糖13 18g、瓊脂20g、抗氧化劑l 2g，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的種子液培養(yǎng)基中馬鈴薯22(T240g、葡萄糖l(T20g、KH2PO4 lg、MgSO4O. 5g、抗氧化劑2 5g、CaCl2 0. I lg、FeSO4 0. Γθ. 25g，余量為水，種子液培養(yǎng)基為6. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于所述抗氧化劑是維生素C或維生素P或蘆丁。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的桑黃活性多糖的制備方法，其特征在于步驟I)所述桑黃菌絲體的名稱為Phellinus sp. P0988，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2012080，保藏日期是 2012 年 3 月 14 日。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種桑黃活性多糖的制備方法，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑、天門冬氨酸、維生素等化學(xué)因子對(duì)桑黃菌絲體的生長(zhǎng)有顯著的影響并優(yōu)化了配方和工藝條件，大大提高了桑黃活性多糖的產(chǎn)率和多糖活性，另外，在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑，克服或緩解了非自然條件下真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和合成活性多糖的脅迫條件，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，適用于工業(yè)化應(yīng)用，為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102766663SQ20121024552
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者劉陶, 崔浪軍, 張紅, 李峻志, 王喆之, 鄭鵬, 陳勇, 韓葵葵, 馬小魁 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)