本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種提高小麥幼胚出芽率的方法及其培養(yǎng)基配方。

背景技術(shù)：

小麥是最后一個轉(zhuǎn)化成功的重要禾谷類糧食作物，一方面由于小麥屬于六倍體作物，遺傳背景復(fù)雜，基因組相對較大(約17Gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麥遺傳轉(zhuǎn)化過程中DNA導(dǎo)入頻率低且轉(zhuǎn)化后再生能力不高，有較強的基因型依賴性。自1992年成功獲得第一例轉(zhuǎn)基因小麥以來，人們嘗試利用多種轉(zhuǎn)化方法和多種外植體轉(zhuǎn)化小麥，轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌、基因槍、花粉管通道、超聲波法、離子束注入法、激光微束穿刺法和PEG法等，外植體包括幼胚、成熟胚、花藥愈傷組織和幼穗等，在降低轉(zhuǎn)化的基因型依賴性、提高轉(zhuǎn)化效率等方面取得了一定的進展，但普遍存在的問題是轉(zhuǎn)化效率仍然很低，難以實現(xiàn)規(guī)?；?/p>

本發(fā)明對提高小麥幼胚出芽率的方法進行了探索，并建立了高效的小麥幼胚培育體系，為后續(xù)小麥功能基因組學(xué)的研究和小麥分子育種，具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種提高小麥幼胚胚性愈傷產(chǎn)生率的培養(yǎng)基配方和組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的提高小麥幼胚胚性愈傷產(chǎn)生率的方法，在預(yù)培養(yǎng)階段，可以有效的提高幼胚產(chǎn)生胚性愈傷的效率，本發(fā)明提供了一種小麥幼胚胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSV4，可以提高小麥幼胚胚性愈傷的誘導(dǎo)率，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有終濃度為0.027mM的甘氨酸，0.1～2.57mM的谷氨酰胺，50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba。

在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，還包含MS大量元素、微量元素、鐵鹽和B5的維生素。

更具體的，本發(fā)明提供了一種小麥幼胚胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成組分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26～30μM，H₃BO₃ 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，F(xiàn)eSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3～30μM，鹽酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。

本發(fā)明還提供了一種上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：按上述配方將各組分添加到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在高溫滅菌完冷卻后，再加入Dicamba 2mg/L。更具體的，其中所述的高溫滅菌的一般條件是121℃，20min。

本發(fā)明還提供了一種提高小麥幼胚胚性愈傷率的組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

a)采集小麥授粉后的小麥幼胚；

b)將小麥幼胚在含有終濃度為0.027mM的甘氨酸、0.1～2.57mM的谷氨酰胺、50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行預(yù)培養(yǎng)。

其中所述的小麥幼胚為小麥授粉后12-16天、直徑為0.8-1.5mm的幼胚。在小麥授粉12-16天后，將小麥穗子上的未成熟種子放入滅菌三角瓶中加入75％乙醇搖洗1min，滅菌水洗三次；加入1％硝酸銀，放入搖床中170rpm震蕩15min，最后用滅菌水沖洗3-4次。再采集未成熟種子中的幼胚。

更具體地，在預(yù)培養(yǎng)階段，是將幼胚盾片向上的接種于培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)的時間是6-8天。發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在小麥幼胚轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)階段，將幼胚接種于培養(yǎng)基上時可以有不同的放置方向，盾片向上或盾片向下，發(fā)明人通過對幼胚不同放置方向產(chǎn)生胚性愈傷的效率進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盾片向上產(chǎn)生胚性愈傷的比例為22％，而盾片向下產(chǎn)生胚性愈傷的比例為0，尤其說明在小麥幼胚轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)階段，將盾片向上放置在培養(yǎng)基上，可以有效的提高胚性愈傷的產(chǎn)生效率，從而提高小麥轉(zhuǎn)化的效率。

本發(fā)明所提供的組織培養(yǎng)方法，適用于所有小麥品種，所述小麥品種包括但不限于揚麥158、中國春、濟麥22、京冬18、川農(nóng)16、寧春4號、科農(nóng)199和CB037。

更具體地，在上述組織培養(yǎng)方法中，其中所述的MSV4誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成成分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26～30μM，H₃BO₃ 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，F(xiàn)eSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3～30μM，鹽酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。將三個小麥品種(科農(nóng)199、CB037、揚麥158)用MSV4培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)6-8天的幼胚的出芽率分別是57.4％、81.7％和44.1％。

本發(fā)明使用現(xiàn)有技術(shù)中公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSV5進行幼胚培育，溶劑為水，MSV5的組成成分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26μM，H₃BO₃ 81μM，KI 4.5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，F(xiàn)eSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3μM，鹽酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天門冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，滅菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。以上各濃度均為相應(yīng)物質(zhì)在所述MSV5培養(yǎng)基中的終濃度。本發(fā)明將三個小麥品種(科農(nóng)199、CB037、揚麥158)用MSV5培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)6-8天的幼胚的出芽率分別是19.6％、25.4％和19.6％。說明本發(fā)明所提供的MSV4培養(yǎng)基可以更好的提高小麥幼胚的胚性愈傷率，從而提高小麥幼胚培育的出芽率。

綜合而言，本發(fā)明通過提供一種MSV4培養(yǎng)基，使小麥幼胚的胚性愈傷產(chǎn)生率明顯提高，這對于利用基因工程途徑和細胞工程途徑改良優(yōu)良小麥品種具有重要意義。

附圖說明

圖1是不同培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)時間的比較。A、B是小麥品種科農(nóng)199，C、D是小麥品種CB037，E、F是小麥品種揚麥158。A、C、E是培養(yǎng)基MSV4上預(yù)培養(yǎng)6-8天，B、D、F是MSV5培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用化學(xué)試劑均購自SIGMA公司，小麥材料CB037從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

實施例1.培養(yǎng)基的準備

本發(fā)明中用到的培養(yǎng)基配方如下所示。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSV4：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 30μM，H₃BO₃ 100μM，KI 5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，F(xiàn)eSO₄ 100μM，Na₂-EDTA100μM，煙酸8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素30μM，鹽酸吡哆醇4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.2mM，水解酪蛋白250mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L，121℃，20min，滅菌后加入Dicamba3mg/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSV5：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26μM，H₃BO₃ 81μM，KI 4.5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，F(xiàn)eSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3μM，鹽酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天門冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，滅菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。

實施例2.幼胚的預(yù)培養(yǎng)

采集小麥授粉后12-16天、直徑為0.8-1.5mm的小麥幼胚進行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的目的是使幼胚在激素作用下脫分化產(chǎn)生愈傷，所產(chǎn)生的愈傷可以作為基因槍轟擊的真正受體。幼胚脫分化所產(chǎn)生的愈傷又分為胚性愈傷和非胚性愈傷，只有胚性愈傷才能夠在激素作用下再分化成完整植株，因此高的胚性愈傷產(chǎn)生率是高轉(zhuǎn)化效率的基礎(chǔ)。

具體地，在小麥授粉12-16天后，將小麥穗子上的未成熟種子放入滅菌三角瓶中加入75％乙醇搖洗1min，滅菌水洗三次；加入1％硝酸銀，放入搖床中170rpm震蕩15min，最后用滅菌水沖洗3-4次。再采集未成熟種子中的幼胚。幼胚接種于培養(yǎng)基上時可以有不同的放置方向(盾片向上和盾片向下)，發(fā)明人對幼胚不同放置方向產(chǎn)生胚性愈傷的效率進行了比較，結(jié)果如表1所示，盾片向上產(chǎn)生胚性愈傷的比例為22％，而盾片向下產(chǎn)生胚性愈傷的比例為0，因此，在后續(xù)實驗中發(fā)明人都采取幼胚盾片向上的方式進行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件具體可為：

表1.幼胚預(yù)培養(yǎng)時不同放置方向出愈率比較

幼胚預(yù)培養(yǎng)時采用不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)時間所產(chǎn)生的胚性愈傷再分化比例即出芽率也有所不同。本發(fā)明中，出芽率高的愈傷證明胚性愈傷的比例也高。發(fā)明人在三個小麥品種(科農(nóng)199、CB037、揚麥158)中，就兩種培養(yǎng)基和兩個培養(yǎng)時間進行了對比，結(jié)果如表2和圖1所示，用MSV4培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)6-8天的幼胚的出芽率遠高于用MSV5培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2天的幼胚的出芽率。說明本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以有效的提高小麥幼胚產(chǎn)生胚性愈傷的比率。

表2.不同培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)時間的比較