本發(fā)明涉及植物細胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種沙米愈傷組織及其誘導(dǎo)增殖方法。
背景技術(shù)：
：沙米，又稱沙蓬、登相子，是藜科一年生草本植物，廣泛分布于我國西北、華北和東北各省區(qū)的沙漠地區(qū)，以及河南、河北、山西和西藏的部分地區(qū)，蒙古、前蘇聯(lián)西伯利亞和中亞地區(qū)也有分布。沙米具有耐寒、耐寒、耐貧瘠、耐風蝕沙埋、喜沙質(zhì)土壤的基本特性。常見于流動沙丘或者半流動沙丘及河岸沙堤，為我國北部常見的沙生植物，是固定流動沙丘的先鋒鎮(zhèn)植物。沙米能夠起到防風固沙的作用；其種子含豐富的營養(yǎng)成分，是很好的功能食物；其植株也可作為牲畜飼料。因此，對于沙米的研究，具有重要的意義。已有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，其細胞被誘導(dǎo)改變原來的發(fā)育途徑，逐步逆轉(zhuǎn)其原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ呐咝约毎?，這個過程稱為脫分化。來自于植物各種器宮的外植體在離體培養(yǎng)條件下，細胞經(jīng)脫分化等一系列過程，改變了它們原有的特性而轉(zhuǎn)變形成一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團，即愈傷組織。理論上講，植物各器官和組織均有誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性。但是在實踐中，愈傷組織的誘導(dǎo)受外植體種類、培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件等多種因素的影響，能否成功地誘導(dǎo)出愈傷組織是研究者們面臨的一個重要問題。對于相關(guān)研究人員來說，不能成功地誘導(dǎo)出愈傷組織，就無法開展后續(xù)的針對植物細胞生理、代謝等相關(guān)研究工作。因此，成功誘導(dǎo)出愈傷組織是研究的基礎(chǔ)。然而，目前針對沙米，仍然沒有能夠高效誘導(dǎo)改植物愈傷組織的方法，因此，提出一種沙米愈傷組織的誘導(dǎo)方法，具有重要意義。因此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中尚未存在能夠有效誘導(dǎo)沙米愈傷組織的方法的問題。本發(fā)明提供的一種沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法，包括如下步驟：(1)剪取沙米無菌實生苗，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.2～0.5mg/L6-BA，2.0～4.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖，pH值為5.8～6.0；(2)取步驟(1)中的所述愈傷組織，接種于增殖培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的增殖培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.1mg/L6-BA，1.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖。進一步的，步驟(1)中，所述沙米無菌實生苗的獲取方法為：將沙米種子用次氯酸鈉溶液漂洗，用水沖洗，然后接種于1/2的MS培養(yǎng)基上進行育苗培養(yǎng)。進一步的，步驟(1)中，所述育苗培養(yǎng)溫度為20～25℃，所述育苗培養(yǎng)時間為1～2周。進一步的，步驟(1)中，所述次氯酸鈉溶液的濃度為1～5％，所述漂洗時間為10～15min，所述用水清洗的時間為1～2h。進一步的，所述沙米無菌實生苗的苗齡為10天。進一步的，步驟(1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.2mg/L6-BA，4.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖，pH值為5.8～6.0。進一步的，步驟(1)中，所述剪取沙米無菌實生苗，具體為剪取沙米無菌實生苗的莖或者葉。進一步的，步驟(1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為20～40天，優(yōu)選30天。進一步的，步驟(2)中，所述增殖培養(yǎng)的時間為20～40天，優(yōu)選30天。另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種沙米愈傷組織，以彌補現(xiàn)有技術(shù)中的不足。本發(fā)明提供了一種沙米愈傷組織，所述沙米愈傷組織按照所述沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法獲得。本發(fā)明提供的沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)步驟，通過對培養(yǎng)基中不同組分合理的選取、科學的配比，能夠以沙米的根、莖、葉等作為外植體，成功誘導(dǎo)出愈傷組織，且具有較高的誘導(dǎo)率。另外，本發(fā)明還提供了一種按照所述誘導(dǎo)增殖方法獲得的沙米愈傷組織，彌補了現(xiàn)有技術(shù)中尚未獲得穩(wěn)定的沙米愈傷組織的不足。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實施例1愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果；圖2為本發(fā)明實施例1愈傷組織增殖結(jié)果。具體實施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供了一種沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法，包括如下步驟：(1)剪取沙米無菌實生苗，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.2～0.5mg/L6-BA，2.0～4.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.8～6.0；(2)取步驟(1)中的愈傷組織，接種于增殖培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.1mg/L6-BA，1.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖。在一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L或者0.5mg/L。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2,4-D的濃度為2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、3.5mg/L或者4mg/L。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.8、5.9或者6.0。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，沙米無菌實生苗的獲取方法為：將沙米種子用次氯酸鈉溶液漂洗，用水沖洗，然后接種于1/2的MS培養(yǎng)基上進行育苗培養(yǎng)。在另一個優(yōu)選的實施方式中，次氯酸鈉溶液的濃度為1％、2％、3％、4％或者5％，次氯酸鈉溶液漂洗時間為10min、11min、12min、13min、14min或者15min。在另一個優(yōu)選的實施方式中，用水沖洗具體為用流動的水沖洗，并且最后用無菌水沖洗。在另一個優(yōu)選的實施方式中，育苗培養(yǎng)的溫度為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或者25℃。育苗時間為7、8、9、10、11、12、13或者14天。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，剪取沙米無菌實生苗，具體為剪取沙米無菌實生苗的根、莖或者葉。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或者40天。在另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(2)中，增殖培養(yǎng)的時間為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或者40天。其中，6-BA為6-芐氨基腺嘌呤，是一種細胞分裂素；2,4-D為2,4-二氯苯氧乙酸，是一種除草劑；MS培養(yǎng)基的組分及濃度如表1所示，1/2MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基稀釋一倍：表1MS培養(yǎng)基配方為了有助于更清楚的理解本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合具體實施例詳細介紹如下：如未明確指出，實施例中所用到的方法為常規(guī)方法，所用到的試劑購自于市場。實施例1(1)選取健康的沙米種子，將沙米種子置于三角瓶內(nèi)，加入濃度為3％的次氯酸鈉溶液，采用透氣瓶塞封住瓶口，置于搖床上振蕩漂洗15min后，置于流水下沖洗1h，然后用無菌水清洗2～3次，將種子接種于1/2MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，12天后獲取沙米無菌實生苗。培養(yǎng)間溫度25℃，普通熒光燈光照強度。剪取苗齡為10天的沙米無菌實生苗的莖，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.2mg/L6-BA，2.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。誘導(dǎo)時間為30天，誘導(dǎo)結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出，該方法成功誘導(dǎo)出了愈傷組織。(2)取步驟(1)中誘導(dǎo)形成的愈傷組織，切成小塊后轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行沙米愈傷組織的增殖培養(yǎng)，其中增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.1mg/L6-BA，1.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖。增值時間為30天。愈傷組織增殖結(jié)果如圖2所示。實施例2實施例2是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。實施例2與實施例1的不同之處在于，實施例2中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.3mg/L6-BA，3.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。實施例3實施例3是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。實施例3與實施例1的不同之處在于，實施例3中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.5mg/L6-BA，4.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。實施例4實施例4是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。實施例4與實施例1的不同之處在于，實施例4中的外植體為苗齡為10天的沙米無菌實生苗的葉。其余步驟與實施例1相同。實施例5實施例5是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。實施例5與實施例1的不同之處在于，實施例5中的外植體為苗齡為10天的沙米無菌實生苗的根。其余步驟與實施例1相同。為了有助于更好的體現(xiàn)本發(fā)明的有益效果，現(xiàn)結(jié)合對比例解釋如下：對比例1對比例1是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。對比例1與實施例1的不同之處在于，對比例1中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。對比例2對比例2是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。對比例2與實施例1的不同之處在于，對比例2中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充2.0mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。對比例3對比例3是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。對比例3與實施例1的不同之處在于，對比例3中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.2mg/L6-BA，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。對比例4對比例4是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。對比例4與實施例1的不同之處在于，對比例4中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充0.05mg/L6-BA，1mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。對比例5對比例5是在實施例1基礎(chǔ)上的改變，實施例1中提到的內(nèi)容，在本實施例中不再詳述。對比例5與實施例1的不同之處在于，對比例5中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基，補充1mg/L6-BA，10mg/L2,4-D，0.70％瓊脂以及2.0％蔗糖組成，pH值為5.9。其余步驟與實施例1相同。實施例1～5及對比例1～5的愈傷組織誘導(dǎo)率結(jié)果如表2所示，其中誘導(dǎo)率表示成功誘導(dǎo)出愈傷組織的樣本量與總樣本量的比值。表2實施例1～5及對比例1～5的誘導(dǎo)率6-BA含量(mg/L)2,4-D含量(mg/L)外植體誘導(dǎo)率(％)實施例10.22莖100實施例20.54莖100實施例30.33莖100實施例40.22葉70實施例50.22根50對比例100莖0對比例202莖0對比例30.20莖0對比例40.051莖20對比例5110莖10發(fā)明人，通過科學、合理的篩選，經(jīng)過大量實驗的驗證，確定了本發(fā)明中誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的組分和配比。由表2可知，本發(fā)明提供的沙米愈傷組織的誘導(dǎo)增殖方法能夠有效的誘導(dǎo)出沙米愈傷組織，具有較高的誘導(dǎo)率。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。當前第1頁1 2 3