藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養(yǎng)基及脫毒育苗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于植物組培脫毒育苗技術(shù)，具體是涉及一種以藍(lán)莓莖尖為外植體，干燥 結(jié)合冷凍脫毒組培育苗培養(yǎng)基以及脫毒育苗方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)莓原產(chǎn)北美，屬于杜鵲花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)為多年生落 葉或常綠灌木，果實富含花色苷等抗氧化物質(zhì)，具有改善視力、抗氧化、抗癌及延緩腦神經(jīng) 衰老等保健功能，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，同時也被譽(yù)為"衆(zhòng)果之王"。
[0003] 我國藍(lán)莓引種栽培研究始于20世紀(jì)末，近年來栽培面積正快速增加，但果農(nóng)對病 毒病害的發(fā)生發(fā)展缺乏認(rèn)知和防治經(jīng)驗，從而存在病毒病害快速傳播而后嚴(yán)重暴發(fā)的巨大 潛在危險。藍(lán)莓病毒病害常引起葉片褪綠、畸形、脫落、黃化或斑駁，花瓣變紅或枯萎，莖部 畸形彎曲、表皮形成紅色條紋或發(fā)生頂梢枯死，樹體矮化、減產(chǎn)或死亡等癥狀，嚴(yán)重時減產(chǎn)， 甚至絕產(chǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)10余種侵染藍(lán)莓的病毒，尤其以藍(lán)莓休克病毒(Blueberry shock virus,BIShV)、藍(lán)莓鞋帶病毒（Blueberry shoestring virus，BBSSV)、藍(lán)莓枯萎病毒 (Blueberry scorch virus，BLSCV)等危害為主。其中，藍(lán)莓休克病毒為目前危害藍(lán)莓最嚴(yán) 重的病毒之一。BIShV病毒可通過蜜蜂攜帶感染的花粉傳播，幾乎侵染所有的藍(lán)莓品種，并 表現(xiàn)相似的癥狀。據(jù)統(tǒng)計，BIShV侵染藍(lán)莓造成的損失可高達(dá)34%~90%。截止目前，還沒有 任何針對病毒病的有效藥物，只以預(yù)防為主，其中無病毒種苗培育為最關(guān)鍵的措施之一。 [0004]為避免病毒給生產(chǎn)帶來的巨大危害，實現(xiàn)藍(lán)莓的無病毒苗栽培是目前我國藍(lán)莓產(chǎn) 業(yè)快速發(fā)展的必經(jīng)之路。目前，無病毒苗主要通過熱處理脫毒法、莖尖脫毒法、花藥培養(yǎng)法、 微莖尖嫁接脫毒法、愈傷組織培養(yǎng)法和抗病毒劑法等生物技術(shù)方法獲取，其中熱處理結(jié)合 莖尖脫毒法運用最為廣泛，然而此法與新興的莖尖低溫結(jié)合超低溫脫毒法相比，仍存在操 作難度大、耗時長以及脫毒率偏低等明顯缺點。莖尖超低溫脫毒法是一種新型高效脫除植 物病毒的新技術(shù)，已在馬鈴薯、柑桔、葡萄、櫻桃、草莓、甘薯等植物上進(jìn)行研究并取得了一 定成果，被認(rèn)為是目前最有效脫除植物病毒的方法之一，冷凍脫毒法中分為快速冷凍法、慢 速冷凍法、分步冷凍法、干燥冷凍法等，其中快速冷凍法、慢速冷凍法需要昂貴精密的培養(yǎng) 箱，且對梯度溫度控制難度較大，干燥冷凍法僅需采用干燥器控制材料脫水速度和脫水程 度，操作簡便，周期短。
[0005] 經(jīng)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)藍(lán)莓組培苗脫毒方面的資料報道。因此，研發(fā)藍(lán)莓莖尖干燥 冷凍脫毒組培育苗技術(shù)，不但為藍(lán)莓，還為木本果樹組培脫毒育苗開劈了一條新途徑或借 鑒之路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對藍(lán)莓的經(jīng)濟(jì)價值越來越被人們認(rèn)識，發(fā)展藍(lán)莓生產(chǎn)的熱情高漲，依靠傳統(tǒng)的 扦插育苗和組培育苗，從數(shù)量和質(zhì)量上均無法滿足現(xiàn)實生產(chǎn)的需求，為此，本發(fā)明要解決的 技術(shù)問題是提供一種以藍(lán)莓莖尖為外植體，干燥冷凍組培脫毒育苗培養(yǎng)基及脫毒育苗方 法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)問題通過如下技術(shù)方案解決：
[0008] 本藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養(yǎng)基，包括不同誘導(dǎo)時期的五種培養(yǎng)基，各 種培養(yǎng)基的原料及其附加量分別是：
[0009] (1)超低溫預(yù)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+20ml · L-1甘油+136.8g · L-1蔗糖，PH5.2;
[0010] (2)超低溫培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+300ml · L-1 甘油+150ml · L-1 乙二醇+150ml · L-1 二 甲基亞楓即DMS0+136.8g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0011] (3)恢復(fù)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0.1mg · L-1玉米素即ZT+0.1mg · L-萘乙酸即ΝΑΑ+ O.lmg · L-1 赤霉素即GA3+8.0g · L-1 瓊脂粉+30g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0012] (4)芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0.5mg · L-hT+O.lmg · L-SAA+O.lmg · L-1GA3+ 8 · Og · L-1 瓊脂粉+30g · L-1 鹿糖，pH5 · 2;
[0013] (5)生根壯苗培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0.1mg · L-SAA+S.Og · L-1瓊脂粉+30g · L-1蔗糖， pH5.2〇
[0014] 用上述的培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗方法經(jīng)過下列步驟：
[0015] (1)藍(lán)莓莖尖干燥培養(yǎng):選取組培繼代培養(yǎng)40 ± 2d的藍(lán)莓無菌苗形態(tài)學(xué)上端長為 0.5~1.0cm的頂芽，置于無菌培養(yǎng)皿中，加蓋，但不密封，將該培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，于 室溫下干燥脫除鮮重重量10 %~30 %的水分；
[0016] (2)莖尖分離剝?nèi)〖俺蜏嘏囵B(yǎng):在體視顯微鏡下剝?nèi)〗?jīng)干燥脫水處理的頂芽莖 尖，莖尖長為1 .〇~1.5_，置于1.8ml冷凍管中，每管置10個莖尖，加入超低溫預(yù)培養(yǎng)基2~ 5ml，在0°C條件下處理10~70min，用無菌槍頭吸出超低溫預(yù)培養(yǎng)基，加入2ml超低溫培養(yǎng) 基，并將冷凍管置于〇°C冰水混合物中處理60min，將冷凍管放入自制紗布袋中，迅速投入液 氮中，保存60~120min后，從液氮中迅速取出冷凍管，立即進(jìn)行40°C水浴化凍處理0.2~ 1.5min，再送入0°C冰水混合物中處理10min;將莖尖用WPM培養(yǎng)基+410.4g · I/1蔗糖溶液清 洗3次，每次10min，取出莖尖置于無菌濾紙上以吸去殘留在莖尖表面的液體，待接種到恢復(fù) 培養(yǎng)基；
[0017] ⑶恢復(fù)培養(yǎng):為了減少培養(yǎng)過程中溫度和光照的抑制，將超低溫培養(yǎng)的莖尖接種 至恢復(fù)培養(yǎng)基中先在〇°C條件下暗培養(yǎng)5~7d(這更有利于藍(lán)莓莖尖離體材料恢復(fù)生長），再 轉(zhuǎn)移至光暗周期為光16h/暗8h的條件下培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2°C;
[0018] (4)病毒檢測：將以上通過干燥冷凍培養(yǎng)獲得的試管離體材料通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄 病毒檢測，經(jīng)檢測確認(rèn)不帶病毒，即為藍(lán)莓脫毒種苗；
[0019] (5)芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng):病毒檢測后確定脫毒的成活莖尖轉(zhuǎn)接至芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)增殖出不定芽;微電腦時控開關(guān)控制培養(yǎng)室每日光照時間，每日光暗周期為光16h/ 暗8h，光照強(qiáng)度為40~50ym 〇l m-2s-1，培養(yǎng)溫度為25 ± 2°C;
[0020] (6)生根培養(yǎng):將步驟(5)所述的不定芽在生根壯苗培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)30~ 45d，生根率達(dá)95%，光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度為30~40μπι 〇1 πΓ2。，培 養(yǎng)溫度為25±2°C。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 應(yīng)用本藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒法培育藍(lán)莓脫毒組培苗，操作簡便，無需昂貴 精密的儀器設(shè)備，成本低，周期短，同時，再生植株能較好地保持母本的優(yōu)良性狀，長勢強(qiáng)、 遺傳穩(wěn)定性好，苗木健壯、有良好的抗逆性。與常規(guī)莖尖脫毒相比，本方法還具有成活率高、 脫毒效率尚等顯者優(yōu)點。
[0023]以藍(lán)莓莖尖結(jié)合冷凍干燥脫除BIShV病毒為例，經(jīng)對比試驗，將脫毒芽增殖并進(jìn)行 RT-PCR病毒檢測，其成活率為78.3 %，脫毒率高達(dá)95.7 %。
【附圖說明】
[0024]附圖為藍(lán)莓脫毒種苗RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明下面結(jié)合實施例作進(jìn)一步詳述:本藍(lán)莓莖尖冷凍干燥組培脫毒方法，首先 是選取組培繼代培養(yǎng)40 ± 2d的藍(lán)莓無菌苗形態(tài)學(xué)上端長為0.5~1.0cm的頂芽，置于無菌培 養(yǎng)皿中，加蓋，但不密封，將該培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，于室溫下干燥脫除鮮重的10%~ 30 %水分后在體視顯微鏡下剝?nèi)￠L為1.0~1.5mm的頂芽莖尖，置于1.8ml冷凍管中，每管置 10個莖尖，加入超低溫預(yù)培養(yǎng)基2~5ml，在0°C條件下處理10~70min，用無菌槍頭吸出超低 溫預(yù)培養(yǎng)基，加入2ml超低溫培養(yǎng)基，并將冷凍管置于0°C冰水混合物中處理60min，將冷凍 管放入自制紗布袋中，迅速投入液氮中，保存60~120min后，從液氮中迅速取出冷凍管，立 即進(jìn)行40°C水浴化凍處理0.2~1.5min，再送入0°C冰水混合物中處理lOmin;將莖尖用WPM 培養(yǎng)基+410.4g · Γ1蔗糖溶液清洗3次，每次lOmin，取出莖尖置于無菌濾紙上以吸去殘留在 莖尖表面的液體，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)35d后進(jìn)行病毒檢測，將經(jīng)檢測確認(rèn)不帶病毒的 藍(lán)莓脫毒種苗進(jìn)行芽誘導(dǎo)增殖及生根培養(yǎng)。本實驗是在每組重復(fù)3次，每種基本培養(yǎng)基有20 個外植體的對比試驗得出的，經(jīng)該干燥冷凍方法脫毒的莖尖，成活率、脫毒率高，再生苗健 壯。
[0026] 本發(fā)明所公開的五種在特定階段配合應(yīng)用的培養(yǎng)基及各相關(guān)參數(shù)、條件如溫度、 凝固劑等也可用諸如葡萄糖、水晶洋菜等替代，培養(yǎng)基各原料的配比值也可分別采用本發(fā) 明最佳方案定值的接近值取代。
[0027] 下面給出的是本發(fā)明的最佳實施例。
[0028] 本藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養(yǎng)基，包括不同誘導(dǎo)時期的五種培養(yǎng)基，各 種培養(yǎng)基的原料及其附加量分別是：
[0029] (1)超低溫預(yù)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+20ml · L-1甘油+136.8g · L-1蔗糖，pH5.2;
[0030] (2)超低溫培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+300ml · L-1 甘油+150ml · L-1 乙二醇+150ml · L-1 二 甲基亞楓即DMS0+136.8g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0031] (3)恢復(fù)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0.1mg · L-1玉米素即ZT+O.lmg · L-萘乙酸即ΝΑΑ+ O.lmg · L-1 赤霉素即GA3+8.0g · L-1 瓊脂粉+30g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0032] (4)芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0.5mg · L-tT+O. lmg · L-SAA+O. lmg · L- 8 · Og · L-1 瓊脂粉+30g · L-1 鹿糖，pH5 · 2;
[0033] (5)生根壯苗培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+0· lmg · L-SAA+S.Og · L-1瓊脂粉+30g · L-1蔗糖， pH5.2〇
[0034] 應(yīng)用本藍(lán)莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養(yǎng)基進(jìn)行組培脫毒育苗方法，經(jīng)過下列 步驟：
[0035] (1)藍(lán)莓莖尖干燥培養(yǎng):選取組培繼代培養(yǎng)40 ± 2d的藍(lán)莓無菌苗形態(tài)學(xué)上端長為 0.5~1.0cm的頂芽，置于無菌培養(yǎng)皿中，加蓋，但不密封，將該培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，于 室