專利名稱：：用于生產(chǎn)多肽的信號(hào)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)多肽的方法，包括使用相對(duì)于該多肽為外源的信號(hào)肽，含有編碼該信號(hào)肽和該多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸構(gòu)建體和含有所述核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：在真菌宿主細(xì)胞，特別是諸如曲霉屬(Aspergillus)的絲狀真菌細(xì)胞或諸如酵母屬(Saccharomyces)的酵母細(xì)胞中重組生產(chǎn)異源蛋白可提供更合適的載體用于以商品相應(yīng)量生產(chǎn)該蛋白。重組生產(chǎn)異源性蛋白一般通過(guò)構(gòu)建表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)，其中將編碼該蛋白的DNA置于從適合于該宿主細(xì)胞的調(diào)控基因切下的啟動(dòng)子表達(dá)控制下。將該表達(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。然后通過(guò)在表達(dá)盒所含的啟動(dòng)子正常發(fā)揮功能所必需的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)該異源蛋白的生產(chǎn)。改進(jìn)蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)一般需要獲得適合于控制蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的新調(diào)控序列。本發(fā)明的目的是使用信號(hào)肽序列提供在真菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的改進(jìn)方法。本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了生產(chǎn)分泌多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對(duì)于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次，使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘；和(b)從培養(yǎng)基中分離分泌的多肽。另外，本發(fā)明提供了含有與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中第一核苷酸序列相對(duì)于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為預(yù)雜交，雜交，和雜交后洗滌，其是在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中進(jìn)行，并在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘，其是在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下進(jìn)行。本發(fā)明還提供了含有所述核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的詳細(xì)描述定義術(shù)語(yǔ)“變異體”當(dāng)用于與另一多肽或核苷酸序列對(duì)照時(shí)在本發(fā)明的上下文中應(yīng)理解為與另一多肽相比包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的取代，缺失，和/或插入的多肽或核苷酸序列(即，它是與其比較的多肽/核苷酸序列的變異體)。具體地說(shuō)，該改變可以屬于次要性質(zhì)，例如不會(huì)明顯影響多肽活性的保守氨基酸取代或?qū)е卤Ｊ匕被崛〈暮塑账嵝蛄懈淖?；或者依賴于發(fā)生該改變的多肽大小，一般1到大約20個(gè)氨基酸的小缺失。保守取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的且參見(jiàn)，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork。最常見(jiàn)的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交換。本發(fā)明的方法本發(fā)明涉及生產(chǎn)分泌多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對(duì)于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次和使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘；和(b)從培養(yǎng)基中分離分泌的多肽。在本發(fā)明的方法中，真菌宿主細(xì)胞在有助于生產(chǎn)該多肽的培養(yǎng)基，即，在適合于使用本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)該多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，補(bǔ)料分批，或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)該細(xì)胞。培養(yǎng)可在包含碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基可從商品供應(yīng)商獲得或者可根據(jù)公開的配方(例如，參見(jiàn)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)品目錄)制備。使用對(duì)該多肽具有特異性的本領(lǐng)域已知的方法可檢測(cè)該多肽。該檢測(cè)方法可包括使用特異性抗體，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。在本發(fā)明的方法中，該真菌宿主細(xì)胞相對(duì)于含有與編碼該多肽的核苷酸序列可操作地相連的天然信號(hào)肽序列的真菌細(xì)胞在相同生產(chǎn)條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)具體地說(shuō)多至少大約25％，更具體地說(shuō)多至少大約50％，更具體地說(shuō)多至少大約75％，更具體地說(shuō)多至少大約100％，甚至更具體地說(shuō)多至少大約200％，最具體地說(shuō)多至少大約300％，且甚至最具體地說(shuō)多至少大約400％的多肽。所得的分泌多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從培養(yǎng)基中直接回收。例如，該多肽可通過(guò)包括，但不限于，離心，過(guò)濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)，或沉淀的常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收。該多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法純化，包括，但不限于，色譜法(例如，離子交換，親和，疏水，色譜聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，制備型等電聚焦)，差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE，或提取(參見(jiàn)，例如，ProteinPurification，J.-C.JansonandLarsRyden，editors，VCHPublishers，NewYork，1989)。信號(hào)肽本發(fā)明的第一核苷酸序列編碼本發(fā)明的信號(hào)肽。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”或“信號(hào)肽序列”在此定義為通常存在于新合成的分泌型或膜多肽N-末端的肽序列，它指導(dǎo)該多肽通過(guò)或者進(jìn)入該細(xì)胞的細(xì)胞膜(原核生物的質(zhì)膜和真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)。它通常在隨后被去掉。具體地說(shuō)，該信號(hào)肽能夠指導(dǎo)該多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。術(shù)語(yǔ)“可操作地相連”在此定義為這樣一種結(jié)構(gòu)，即其中調(diào)控序列，例如信號(hào)肽序列，相對(duì)于編碼序列放在合適的位置上，使得該調(diào)控序列指導(dǎo)生產(chǎn)由該編碼序列編碼的多肽。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在此定義為當(dāng)放在合適的調(diào)控序列控制下時(shí)翻譯成多肽的核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由位于閱讀框開始(5’端)的起始密碼子和位于閱讀框3’端的終止密碼子確定。編碼序列可包括，但不限于，基因組DNA，cDNA，RNA，半合成，合成，和重組核苷酸序列。本發(fā)明的多肽的編碼序列5’端可含有與編碼該多肽的成熟(或前體形式)的核苷酸序列片斷天然相連的編碼信號(hào)肽的天然核苷酸序列。在這種情況下本發(fā)明的信號(hào)肽可取代該天然信號(hào)肽。作為選擇，本發(fā)明的多肽可沒(méi)有天然信號(hào)肽。在本文中，術(shù)語(yǔ)“天然”試圖理解為天然存在。在本發(fā)明的方法中，該信號(hào)肽相對(duì)于編碼目的多肽的核苷酸序列是外源的，但是該信號(hào)肽序列或核苷酸序列相對(duì)于該真菌宿主細(xì)胞可以是天然的。在本文中，術(shù)語(yǔ)“外源”試圖理解為該信號(hào)肽相對(duì)于該多肽不是天然的，即，它來(lái)源于異于該多肽的另一基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一核苷酸序列編碼具有與SEQIDNO1有至少70％，具體地說(shuō)至少大約75％，更具體地說(shuō)至少大約80％，更具體地說(shuō)至少大約85％，甚至更具體地說(shuō)至少大約90％，最具體地說(shuō)至少大約95％，且甚至最具體地說(shuō)至少大約97％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽，它具有指導(dǎo)多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的能力(下文稱為“同源信號(hào)肽”)。在一個(gè)具體方面中，該同源信號(hào)肽具有與SEQIDNO1有5個(gè)氨基酸，具體地說(shuō)4個(gè)氨基酸，更具體地說(shuō)3個(gè)氨基酸，甚至更具體地說(shuō)2個(gè)氨基酸，且最具體地說(shuō)1個(gè)氨基酸的差別的氨基酸序列。為達(dá)到本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性或同一性程度可通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表(identitytable)和下列多序列對(duì)比參數(shù)缺口罰分(gappenalty)為10和缺口長(zhǎng)度罰分(gaplengthpenalty)為10來(lái)確定。逐對(duì)序列對(duì)比參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口(windows)＝5，且對(duì)角線(diagonals)＝5。具體地說(shuō)，第一核苷酸序列可編碼信號(hào)肽，其包含SEQIDNO1的氨基酸序列，或其等位變異體；或其具有指導(dǎo)該多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如，進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的片斷。在更具體的一個(gè)方面中，本發(fā)明的第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO1的氨基酸序列的信號(hào)肽。在另一具體的方面，第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的氨基酸序列或其片斷組成的信號(hào)肽，其中該信號(hào)肽片斷具有指導(dǎo)多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如，進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力。在另一更具體的方面中，本發(fā)明的核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的氨基酸序列組成的信號(hào)肽。本發(fā)明還包含這樣的第一核苷酸序列，它編碼具有SEQIDNO1的氨基酸序列的信號(hào)肽，且它由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于SEQIDNO2。本發(fā)明還涉及編碼具有指導(dǎo)多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如，進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的SEQIDNO1的片斷的SEQIDNO2的子序列或片斷。SEQIDNO2的子序列是SEQIDNO2包含的核酸序列，除了從5’和/或3’端刪除了一個(gè)或多個(gè)核苷酸。具體地說(shuō)，子序列含有至少30個(gè)核苷酸，例如至少35個(gè)核苷酸或至少40個(gè)核苷酸或至少45個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸或至少52個(gè)核苷酸或至少53個(gè)核苷酸。SEQIDNO1的片斷是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。具體地說(shuō)，一個(gè)片斷含有至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基或至少13個(gè)氨基酸殘基或至少14個(gè)氨基酸殘基或至少15個(gè)氨基酸殘基或至少16個(gè)氨基酸殘基或至少17個(gè)氨基酸殘基。具體地說(shuō)，如果第一和第二核苷酸序列在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該信號(hào)肽可含有SEQIDNO1的氨基酸殘基1-16，因?yàn)楸景l(fā)明的發(fā)明人觀察到在酵母中該信號(hào)肽在氨基酸殘基16和17之間被切割(在AA↓LP)，而如果該宿主細(xì)胞是絲狀真菌，該信號(hào)肽具體可包含SEQIDNO1的18個(gè)氨基酸殘基，因?yàn)楸景l(fā)明的發(fā)明人觀察到在米曲霉(Aspergillusoryzae)中該信號(hào)肽的切割發(fā)生在SEQIDNO1的氨基酸殘基18后。這表明在酵母和絲狀真菌之間，被識(shí)別為信號(hào)序列切割的切割位點(diǎn)的序列可能不同。等位基因變異體表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或多種任選形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，且可導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的信號(hào)肽中無(wú)改變)或者可編碼有氨基酸序列改變的信號(hào)肽。信號(hào)肽的等位基因變異體是由基因的等位基因變異體編碼的肽。在一個(gè)具體方面，第一核苷酸序列是HumicolainsolensDSM1800中所含的角質(zhì)酶(cutinase)基因的信號(hào)肽編碼序列(SEQIDNO1)。在第二個(gè)方面，編碼信號(hào)肽的本發(fā)明的第一核苷酸序列與SEQIDNO2具有至少大約70％的同源性程度，具體地說(shuō)至少大約75％，更具體地說(shuō)至少大約80％，更具體地說(shuō)至少大約85％，甚至更具體地說(shuō)至少大約90％的同源性，最具體地說(shuō)至少大約95％的同源性，且甚至最具體地說(shuō)至少大約97％的同源性，其編碼信號(hào)肽；或等位基因變異體和編碼具有指導(dǎo)多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如，進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的信號(hào)肽片斷的SEQIDNO2的子序列。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，兩個(gè)核酸序列之間的同源性程度可通過(guò)Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80726-730)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表和下列多序列對(duì)比參數(shù)缺口罰分為10且缺口長(zhǎng)度罰分為10來(lái)測(cè)定。逐對(duì)序列對(duì)比參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，且窗口＝20。在第三個(gè)方面，本發(fā)明的第一核苷酸序列編碼信號(hào)肽，其中所述的第一核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2，或其互補(bǔ)鏈的核苷酸雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，紐約冷泉港)。SEQIDNO2的核苷酸序列或其子序列，以及SEQIDNO1的氨基酸序列或其片斷可用于設(shè)計(jì)核酸探針以便根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼信號(hào)肽的DNA。具體地說(shuō)，該探針可用于按標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中的相應(yīng)基因。該探針可以比完整序列短很多，但可以具體地說(shuō)長(zhǎng)至少15，例如至少25，或更具體地說(shuō)至少35個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。一般可標(biāo)記該探針用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。本發(fā)明包含該探針。因此，可篩選從其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中與上述探針雜交且編碼信號(hào)肽的DNA。可通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離其它生物的基因組或其它DNA。文庫(kù)DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO2或其子序列同源的克隆或DNA，該載體材料可用于Southern印跡。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，雜交表示該核酸序列在本文定義的嚴(yán)格條件下與相應(yīng)于SEQIDNO2所示的核酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其子序列的標(biāo)記核酸探針雜交。使用X-射線膠片可檢測(cè)在這些條件下核酸探針與其雜交的分子。在一個(gè)具體的方面中，該核酸探針是編碼SEQIDNO1的信號(hào)肽，或其子序列的核苷酸序列。在另一具體的方面，該核酸探針是SEQIDNO2。在另一具體方面，該核酸探針是HumicolainsolensDSM1800所含的角質(zhì)酶基因的信號(hào)肽序列(WO96/13580中的SEQIDNO2)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸到大約60個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件定義為按照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方法，在低于根據(jù)Bolton和McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)的算法計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP和每ml0.2mg酵母RNA中進(jìn)行預(yù)雜交，雜交，和雜交后洗滌。對(duì)于長(zhǎng)度為大約15個(gè)核苷酸到大約60個(gè)核苷酸的短探針，該載體材料在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次并使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。在第四方面，第一核苷酸序列可編碼包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失，和/或插入的具有SEQIDNO1的氨基酸序列的信號(hào)肽的變異體。該變異體信號(hào)肽的氨基酸序列與SEQIDNO1的氨基酸序列區(qū)別可在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或用不同氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。具體地說(shuō)，氨基酸改變可以屬于次要性質(zhì)，例如不會(huì)明顯影響信號(hào)肽活性的保守氨基酸取代；或者一般1到大約5個(gè)氨基酸的小缺失。保守取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的且參見(jiàn)，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork。最常見(jiàn)的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交換。多肽本發(fā)明的第二核苷酸序列編碼本發(fā)明編碼的多肽。所述的多肽相對(duì)于生產(chǎn)它的真菌宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)“多肽”本文不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此，它包含肽，寡肽，和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在此定義為不是該真菌細(xì)胞天然的多肽，進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然多肽，或由于通過(guò)重組DNA技術(shù)改造編碼該多肽的基因而定量改變其表達(dá)的天然多肽。真菌細(xì)胞可含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼該多肽的核苷酸序列。具體地說(shuō)，該多肽可以是激素或激素變異體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，過(guò)敏原或報(bào)道分子。在一個(gè)具體方面，該多肽可以是來(lái)自Dermatophagoidespteronyssinus，Dermatophagoidesfarinae，Dermatophagoidessiboney，Dermatophagoidesmicroceaus，Blomiatropicalis和Euroglyphusmaynei的過(guò)敏原，或后來(lái)被修飾的一種所述生物的過(guò)敏原。更具體地說(shuō)，所述過(guò)敏原可以是Derp1，例如，來(lái)自Dermantophagoidespteronyssinus的Derp1(SEQIDNO3)。具體地說(shuō)，該多肽可以是SEQIDNO3中氨基酸19-320的序列。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，該多肽可以是SEQIDNO3的氨基酸19-320的多肽序列的變異體。更具體地說(shuō)，該變異體可以是S54X或N52X，其中“X”表示任何氨基酸，如所述的破壞Derp1的N-糖基化位點(diǎn)，具體地說(shuō)該變異體可以是S54N或N52Q。然而，Derp1的其它變異體是可預(yù)料得到的。在另一具體實(shí)施方案中，該多肽可以是酶，例如，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，或連接酶。在一個(gè)更具體的方面，該多肽可以是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，過(guò)氧化氫酶，纖維素酶，纖維二糖水解酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，內(nèi)切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，變位酶mutanase，氧化酶，果膠降解酶，過(guò)氧化物酶，磷脂酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，木聚糖酶，或β-木糖苷酶。有關(guān)纖維素酶的例子包括但不限于來(lái)自Mucorcicinellides，例如，M.cicinellidesIFO4554的纖維素酶(SEQIDNO4)。有關(guān)蛋白水解酶的例子包括但不限于半胱氨酸蛋白酶，例如，來(lái)自白車軸草(TrifoliumrepensL)的半胱氨酸蛋白酶5(SEQIDNO5)，特別是編碼成熟肽的SEQIDNO5的氨基酸109-327，或胰蛋白酶，例如來(lái)自尖孢鐮孢(Fusariumoxysporium)的胰蛋白酶(SEQIDNO7)。有關(guān)植酸酶的例子包括但不限于來(lái)自Peniophoralycii，例如，P.lyciiCBS686.96的植酸酶(SEQIDNO9)。編碼本發(fā)明的多肽的第二核苷酸序列可從任何原核生物，真核生物，或其它來(lái)源獲得。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本文與給定來(lái)源相聯(lián)系使用的術(shù)語(yǔ)“從...獲得”是指該多肽由該來(lái)源產(chǎn)生或者由插入了該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。用于分離或克隆編碼目的多肽的核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。通過(guò)例如，使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可實(shí)現(xiàn)從該基因組DNA克隆第二核苷酸序列。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplication，AcademicPress，NewYork?？寺》椒砂ㄇ谐龊头蛛x含有編碼該多肽的核苷酸序列的所需核苷酸片斷，將該片斷插入載體分子中，并將重組載體納入突變型真菌細(xì)胞中，其中可復(fù)制多個(gè)拷貝或克隆的該核苷酸序列。第二核苷酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成，合成來(lái)源，或其任意組合。在本發(fā)明的方法中，該多肽也可以是融合或雜合多肽，其中另一多肽融合在該多肽或其片斷的N-末端或C-末端。融合多肽通過(guò)將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到編碼本發(fā)明的多肽的第二核苷酸序列(或其部分)上來(lái)產(chǎn)生。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括，連接編碼這些多肽的編碼序列，使得它們共閱讀框且該融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控下。雜合多肽可包括從至少兩種不同多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種多肽對(duì)于突變型真菌細(xì)胞可以是異源的。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及含有與編碼本發(fā)明的多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼本發(fā)明的信號(hào)肽的第一核苷酸序列的核酸構(gòu)建體?！昂怂針?gòu)建體”在此定義為單鏈或雙鏈的核苷酸分子，它從天然存在的基因分離或者被修飾成含有以在天然情況下不存在的方式組合和并列的核酸片斷。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有編碼序列和表達(dá)該編碼序列所需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒同義。編碼多肽的第二核苷酸序列還可以用各種方法進(jìn)行操作以提供該多肽的表達(dá)。在該核苷酸序列插入載體前對(duì)其改造可能是期望的或必需的，取決于該表達(dá)載體。使用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明的方法中，該核酸構(gòu)建體包含一種或多種天然調(diào)控序列或者用對(duì)于該核酸構(gòu)建體的第一和/或第二核苷酸序列為外源的一種或多種調(diào)控序列取代一種或多種天然調(diào)控序列以提高編碼多肽的第二核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在此定義為包括表達(dá)第二核苷酸序列編碼的多肽必需或有利的所有元件。各調(diào)控序列相對(duì)于編碼該多肽的第二核苷酸序列可以是天然的或外源的。該調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，本發(fā)明的信號(hào)肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。在最少的情況下，該調(diào)控序列包括本發(fā)明的信號(hào)肽序列，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。調(diào)控序列備有接頭用于導(dǎo)入有利于將該調(diào)控序列與編碼該多肽的第二核苷酸序列連接的特定限制性位點(diǎn)。調(diào)控序列可以是被宿主細(xì)胞識(shí)別以表達(dá)該核苷酸序列的合適啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)該多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何序列，包括突變的，截短的和雜合的啟動(dòng)子，且可從與該宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的例子是從米曲霉TAKA淀粉酶，米赫毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米赫毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，F(xiàn)usariumvenenatum淀粉葡糖苷酶，尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)，Trichodermareesei纖維二糖水解酶I，Trichodermareesei纖維二糖水解酶II，Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶I，Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶II，Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶III，Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶IV，Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶V，Trichodermareesei木聚糖酶I，Trichodermareesei木聚糖酶II和Trichodermareeseiβ-木糖苷酶的基因獲得的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；或其突變型，截短型，和雜合型啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子包括但不限于從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)，釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)，釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)，釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)，和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的那些啟動(dòng)子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用的啟動(dòng)子參見(jiàn)Romanos等，1992，Yeast8423-488的描述。調(diào)控序列可以是被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的合適轉(zhuǎn)錄終止子序列。該終止子序列可操作地連接到編碼該多肽的核苷酸序列的3′端。在選定宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適終止子的例子包括但不限于從米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的那些終止子。用于酵母宿主細(xì)胞的合適終止子的例子包括但不限于從釀酒酵母烯醇化酶，釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)，和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的那些終止子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用的終止子參見(jiàn)Romanos等，1992，出處同上的描述。該調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，即對(duì)于宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區(qū)。該前導(dǎo)序列一般可操作地連接到編碼多肽的核苷酸序列的5′端。在選定宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)序列的例子包括但不限于從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得的那些前導(dǎo)序列。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)序列包括但不限于從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)，釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶，釀酒酵母α-因子，和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的那些前導(dǎo)序列。該調(diào)控序列也可以是多聚腺苷化序列，它與編碼多肽的核苷酸序列的3′端可操作地連接且轉(zhuǎn)錄時(shí)作為給轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號(hào)被宿主細(xì)胞識(shí)別。在選定宿主細(xì)胞中起作用的任何多聚腺苷化序列都可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適多聚腺苷化序列的例子包括但不限于從米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因獲得的那些多聚腺苷化序列。用于酵母宿主細(xì)胞的有用多聚腺苷化序列包括但不限于Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology155983-5990所述的那些序列。調(diào)控序列也可以是編碼位于多肽氨基末端的一個(gè)氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所得的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。多肽原一般無(wú)活性，而且通過(guò)從多肽原催化或自體催化切割前肽，多肽原可以轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚远嚯摹Ｇ半木幋a區(qū)的例子包括但不限于可從DermantophagoidespteronyssinusDerp1的基因，或者從Dermantophagoides獲得的其它基因，尖孢鐮孢胰蛋白酶，釀酒酵母α-因子，米赫毛霉天冬氨酸蛋白酶，和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO95/33836)的基因獲得的那些前肽。如果信號(hào)肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端，則該前肽區(qū)緊接著多肽的氨基末端且信號(hào)肽區(qū)緊接著該前肽區(qū)的氨基末端。如果存在前肽，則在一個(gè)實(shí)施方案中在前肽和成熟多肽之間可存在一個(gè)切割位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“切割位點(diǎn)”應(yīng)理解為被能夠在該位點(diǎn)切割該多肽的蛋白水解酶識(shí)別的氨基酸序列。該位點(diǎn)的例子包括kex-位點(diǎn)，特別是kex-II位點(diǎn)。也可能需要添加允許調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子是與化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)控化合物的存在反應(yīng)引起基因表達(dá)打開或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子，黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子，和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它例子是允許基因擴(kuò)增的那些序列。在真核系統(tǒng)中，它們包括在氨甲蝶呤存在時(shí)擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的核苷酸序列可與該調(diào)控序列可操作地相連。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。除了包含分別編碼本發(fā)明的信號(hào)肽和多肽的第一和第二核苷酸序列外，所述的表達(dá)載體可具體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。上述各種核苷酸和調(diào)控序列可連接起來(lái)以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，它可包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)以允許在該位點(diǎn)插入或取代該啟動(dòng)子和/或編碼該多肽的核苷酸序列。作為選擇，該核酸構(gòu)建體可插入合適的載體以表達(dá)由第二核苷酸序列編碼的多肽。在構(gòu)建的表達(dá)載體中，編碼本發(fā)明多肽的第二核苷酸序列位于該載體中以便所述的序列與本發(fā)明的信號(hào)肽序列和一個(gè)或多個(gè)合適的表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連。重組表達(dá)載體可以是可按常規(guī)進(jìn)行重組DNA操作且可導(dǎo)致該核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇一般依賴于載體與該載體所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。本發(fā)明的載體可具體含有允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易選擇的一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記。選擇標(biāo)記是其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性，重金屬抗性，營(yíng)養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)化等的基因。酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記包括，但不限于，ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)，argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)，bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD(硝酸鹽還原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)，sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)，trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。具體用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。該載體可以是自主復(fù)制型載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒，染色體外因子，微型染色體，或人工染色體。該載體可含有保證自我復(fù)制的任何工具。作為選擇，該載體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)基因組并與其整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用單個(gè)載體或質(zhì)粒或一起含有需要導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的載體可具體含有允許該載體穩(wěn)定整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組或該載體在細(xì)胞中不依賴于基因組自主復(fù)制的元件。為了整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，該載體可依靠編碼該多肽的第二核苷酸序列或該載體的任何其它元件來(lái)通過(guò)同源或非同源重組將該載體穩(wěn)定整合進(jìn)基因組的。作為選擇，該載體可含有指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的額外核苷酸序列。該額外核苷酸序列可使得該載體能夠在染色體的精確位置整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，該整合元件應(yīng)具體包含與相應(yīng)靶序列高度同源的足夠數(shù)量的核苷酸，例如100至1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400到1,500個(gè)堿基對(duì)，且最優(yōu)選800到1,500個(gè)堿基對(duì)以提高同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。在另一方面，該載體可通過(guò)非同源重組整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。對(duì)于自主復(fù)制，該載體可進(jìn)一步包含使得該載體在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制因子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制因子”本文定義為使得質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的例子是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起點(diǎn)可以是具有突變使其在宿主細(xì)胞中起作用的能力具有溫度敏感性的復(fù)制起點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，Ehrlich，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751433)。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的例子是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene9861-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和含有該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可根據(jù)WO00/24883公開的方法完成?？蓪⒊^(guò)1拷貝的編碼多肽的核苷酸序列插入宿主細(xì)胞中以增加該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。核苷酸序列拷貝數(shù)的增加可以這樣實(shí)現(xiàn)將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組；或者通過(guò)將該核苷酸序列與可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因包含在一起，通過(guò)在合適的選擇劑存下下培養(yǎng)細(xì)胞，可以選擇含有擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因，從而也就含有增加拷貝的該核苷酸序列的細(xì)胞，。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，出處同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明涉及在真菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的方法和含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。將含有與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼本發(fā)明的信號(hào)肽的第一核苷酸序列的載體導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞使得該載體如前所述作為染色體整合體或者作為自我復(fù)制型染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包含由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上依賴于編碼該多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是用于本發(fā)明方法的任何真菌細(xì)胞。本文使用的“真菌”包括子囊菌門(Acomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(由Hawksworth等定義，參見(jiàn)，AinsworthandBisby′sDictionaryofTheFungi，第8版，1995，CABInternational，UniversityPress，Cambridge，UK)以及卵菌門(Oomycota)(參見(jiàn)Hawksworth等，1995，出處同上，第171頁(yè))或所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出處同上)。在一個(gè)具體方面，該真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文使用的“酵母”包括包括產(chǎn)子囊(ascosporogenous)酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子(basidiosporogenous)酵母和屬于不完全真菌(FungiImperfecti)的酵母(芽生菌綱Blastomycetes)。由于酵母的分類在今后可能改變，為了本發(fā)明的目的，酵母將定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，andDavenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在一個(gè)更具體的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬(Candida)，漢遜氏酵母屬(Hansenula)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia屬細(xì)胞。在一個(gè)最具體的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母例如S.cerevisiaeYNG318、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾第酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)或Yarrowialipolytica細(xì)胞。在另一具體方面，該真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門(定義參見(jiàn)Hawksworth等，1995，出處同上)的所有絲狀類型。絲狀真菌的特征在于菌絲壁由幾丁質(zhì)，纖維素，葡聚糖，殼聚糖，甘露聚糖，和其它復(fù)合多糖組成。無(wú)性生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)且碳代謝是專性需氧的。相反，諸如釀酒酵母的酵母無(wú)性生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體出芽，且碳代謝可以是發(fā)酵性的。在一個(gè)更具體的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是，但不限于是，支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬，鐮孢屬(Fusarium)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，毛霉屬(Mucor)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，脈孢菌屬(Neurospora)，青霉屬，Thielavia，Tolypocladium，或木霉屬(Trichoderma)。在甚至更具體的一個(gè)方面，該絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在一個(gè)更具體的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporium)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖孢鐮孢、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusariumvenenatum細(xì)胞。在另一個(gè)更具體的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、Magnaporthegrisea、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichodermakoningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉(Trichodermaviride)細(xì)胞。在一個(gè)最具體的方面，該Fusariumvenenatum細(xì)胞是FusariumvenenatumA3/5，它最初作為FusariumgraminearumATCC20334保藏，且最近由Yoder和Christianson，1998，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology2362-80和O′Donnell等，1998，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology2357-67重新分類為Fusariumvenenatum；以及Fusariumvenenatum的分類學(xué)等同物，不管它們目前已知為何種名。在另一具體方面，該Fusariumvenenatum細(xì)胞是如WO97/26330中公開的FusariumvenenatumA3/5或FusariumvenenatumATCC20334的形態(tài)學(xué)突變體。在另一最具體的方面，該木霉屬細(xì)胞是TrichodermareeseiATCC56765，TrichodermareeseiATCC13631，TrichodermareeseiCBS526.94，TrichodermareeseiCBS529.94，TrichodermalongibrachiatumCBS528.94，TrichodermalongibrachiatumATCC2106，TrichodermalongibrachiatumCBS592.94，綠色木霉NRRL3652，綠色木霉CBS517.94，或綠色木霉NIBHFERM/BP447。真菌細(xì)胞可以通過(guò)包含原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法轉(zhuǎn)化，方式本身是已知的。用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化Trichodermareesei宿主細(xì)胞的合適方法在Penttila等，1987，Gene61155-164，和Gruber等，1990，CurrGenet.18(1)71-6中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78147-156和WO96/00787描述。酵母可使用Becker和Guarente，InAbelson，J.N.andSimon，M.I.，editors，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsinEnzymology，Volume194，第182-187頁(yè)，AcademicPress，Inc.，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153163；和Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751920所述的方法轉(zhuǎn)化。材料和方法菌株和質(zhì)粒菌株大腸桿菌DH12S(可從GibcoBRL獲得)用于酵母質(zhì)粒拯救。釀酒酵母YNG318MATaDpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his4-539在J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)中描述。質(zhì)粒所有酵母表達(dá)載體都是從WO00/10038所述的pJC039構(gòu)建的，在TPI啟動(dòng)子控制下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體?；駾erp1來(lái)自DermatophagoidespteronyssinusNCBI登錄號(hào)P08176，氨基酸序列在SEQIDNO3中顯示。來(lái)自白車軸草(TrifoliumrepensL)的半胱氨酸蛋白酶基因是以EMBLAY192363登錄的序列。α-因子(酵母接合所需的信息素)基因是來(lái)自Invitrogen的商業(yè)上可獲得的pPICZαA載體中的序列。來(lái)自尖孢鐮孢的胰蛋白酶基因是以EMBLS63827登錄的序列，其cDNA序列在SEQIDNO6中顯示。來(lái)自Peniophoralycii菌株CBS686.96的植酸酶基因是以EMBLPLY310696登錄的序列且其cDNA序列在SEQIDNO8中顯示。引物對(duì)于卷枝毛霉(Mucorcircinellides)纖維素酶的表達(dá)對(duì)于cDNA克隆MCE-BC1F(44mer)5’-CAACTGGTGATCACCACCATGAAGTTCACCGTTGCTATTACTTC-3’MCE-NruR(39mer)5’-TCTCGAGCTCGCGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCGAG-3’對(duì)于酵母載體構(gòu)建M61F(50mer)5’-CCAGCTTCCGCAAACAAAGTCGCCAACATGAAGTTCACCGTTGCTATTAC-3’M61CutisigF(50mer)5’-CGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCGCCGCTTCTTGCAGCTCTGTCTATG-3’C-termR61R(49mer)5’-TAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCG-3’對(duì)于白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)α-信號(hào)-MunI(49mer)5’-ATAAACGACGGGACCCGGGGATCCAATTGATGAGATTCCCATCAATTTT-3’α-信號(hào)-CysProR(42mer)5’-GCCCACGATGGAGAAATCGCGAGCTTCAGCTTCTCTTTTCTC-3’α-信號(hào)-CysProF(42mer)5’-GAAAAAAGAGAAGCTGAAGCTCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3’Spe-CysProR(50mer)5’-ACTAATTACATGATGCGGCCCACTAGTTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3’Cuti-Sig-CysPro(50mer)5’-GCACCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3’CysProC-term(50mer)5’-TAATTACATGATGCGGCCCGCGGCCGCTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3’對(duì)于鐮孢胰蛋白酶的表達(dá)酵母-F(43mer)5’-ACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTCAAGTTCGCTTCC-3’酵母-R(43mer)5’-AACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAAGCATAGGTGTC-3’cuti-pre(45mer)5’-CGTTCCTGAACTTGTTGCCCGGGTTGGTGGCACTTCTGCCAGCGC-3’TP2-KexF(32mer)5’-GTTCCTGAACTTGTTCGGCGGGTTGGTGGCAC-3’TP2-KexR(32mer)5’-GTGCCACCAACCCGCCGAACAAGTTCAGGAAC-3’Cuti-preF(29mer)5’-GTTGCTGCTCTCCCCGTTGGTGGCACTTC-3’Cuti-preR(29mer)5’-GAAGTGCCACCAACGGGGAGAGCAGCAAC-3’CUTIpre-TPproF(42mer)5’-TCCTCAGGAGATCCCCAACATTGTTGGTGGCACTTCTGCCAG-3’CUTIpre-TPproR(40mer)5’-GTTGGGGATCTCCTGAGGAGCGGGGAGAGCAGCAACAAGG-3’對(duì)于隔孢伏革菌(Peniophora)植酸酶的表達(dá)PP1F(50mer)5’-AAACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTTTCTTCGGCATTCGCACC-3’PPR(50mer)5’-ACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGACTATTCCGACGGAACAAAGCCGC-3’PP2F(50mer)5’-CCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCAGCTACCTATCCCCGCACAAAAC-3’培養(yǎng)基和底物RS-2540g/L大豆粉，40g/L葡萄糖，10g/LKH2PO4，0.25g/LMgSO4，0.01g/LFeSO4，2.5g/LNH4NO3；pH6YPD20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物10X基礎(chǔ)溶液66.8g/l酵母氮堿基無(wú)(w/o)氨基酸(DIFCO)，100g/l琥珀酸鹽和60g/lNaOH。SC-葡萄糖(或SC-培養(yǎng)基)100ml/l20％葡萄糖(即，2％的終濃度＝2g/100ml)，4ml/l5％蘇氨酸，10ml/l1％色氨酸，25ml/l20％酪蛋白氨基酸和100ml/l10X基礎(chǔ)溶液。該溶液使用0.20微米孔徑的濾膜滅菌。瓊脂和H2O(大約761ml)一起高壓滅菌，并將單獨(dú)滅菌的SC-葡萄糖溶液加入瓊脂溶液中。PEG/LiAc溶液50ml40％PEG4000(高壓滅菌)和1ml5M醋酸鋰(高壓滅菌)。方法酵母轉(zhuǎn)化該方法在實(shí)施例2-5中使用。為了轉(zhuǎn)化酵母，使用體內(nèi)重組機(jī)制，其中如果載體序列和PCR片斷都具有相同的側(cè)翼區(qū)，則酵母可能通過(guò)該機(jī)制體內(nèi)重組載體序列和PCR片斷以產(chǎn)生表達(dá)載體。通過(guò)將0.5微升載體(EcoRI-NotI消化)與1微升PCR片斷混合制備DNA混合物。釀酒酵母YNG318感受態(tài)細(xì)胞在冰上融解。將100微升該細(xì)胞與該DNA混合物和10微升載體DNA(Clontech)在12ml聚丙烯試管(Falcon2059)中混合。向其中加入0.6mlPEG/LiAc溶液并輕輕混合，然后在30℃和200rpm下溫育30分鐘。隨后在42℃溫育30分鐘(熱休克)，之后轉(zhuǎn)移進(jìn)eppendorf管并離心5秒。去掉上清并分散在3mlYPD中。然后將該細(xì)胞懸液以200rpm在30℃下溫育45分鐘，之后傾倒在SC-葡萄糖平板上。PCR反應(yīng)除非另有說(shuō)明，在下列條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)包含38.9微升H2O，5微升10×反應(yīng)緩沖液，1微升KlenTaqLA(Clontech)，4微升10mMdNTPs，0.3微升×2100pmol/微升的引物和0.5微升模板DNA且在下列條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的98℃下10秒和68℃下90秒，和最后在68℃下10分鐘。夾心ELISA免疫平板(NuncMaxisorb；Nunc-Nalgene)在4℃下用合適劑量的多克隆兔抗Derp1抗體包被過(guò)夜。然后用含0.05％Tween20的0.15M磷酸鹽緩沖液(PBS)(PBST)徹底洗滌平板，并用含2％脫脂奶粉的PBS在室溫下封閉剩下的結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)。以合適劑量或劑量范圍加入樣品，它可以是純化的，半純化的重組1型螨多肽變異體過(guò)敏原或含有目的蛋白的粗制培養(yǎng)液。然后用0.15MPBST徹底洗滌平板，之后通過(guò)用生物素標(biāo)記的單克隆抗Derp1抗體(INDOOR)在室溫下溫育1小時(shí)檢測(cè)該過(guò)敏原。然后在0.15MPBST中再次洗滌平板，之后與鏈霉抗生物素蛋白辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Kierkegaard&Perry)在室溫下結(jié)合1小時(shí)。重復(fù)洗滌步驟，然后平板通過(guò)加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化氫(TMBPlus，Kem-En-Tec)顯色，之后通過(guò)加入0.2MH2SO4終止反應(yīng)。在450nm下的光密度(OD)反映了與免疫球蛋白結(jié)合的過(guò)敏原，然后可檢測(cè)且也可通過(guò)與從ELISA中包含的已知濃度劑量范圍的天然Derp1(可從Indoorbiotechnologies，NA-DP1獲得)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定結(jié)合的過(guò)敏原的量。其它方法通過(guò)電穿孔(BIO-RADGenePulser)進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化以拯救酵母質(zhì)粒。DNA質(zhì)粒用Qiagen質(zhì)粒試劑盒制備。DNA片斷通過(guò)Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收。PCR用PTC-200DNAEngine進(jìn)行。ABIPRISMTM310遺傳分析儀用于所有DNA序列的測(cè)定。酵母總DNA通過(guò)在Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790中所述的Robzyk和Kassir’s方法提取。酶測(cè)定法半胱氨酸蛋白酶測(cè)定法96孔微量滴定板測(cè)定法向各孔中加入下列成份10微升0.5M醋酸鈉緩沖液(pH5)，10微升2MNaCl(含有700微升巰基乙醇/100ml)，45微升D.W.(蒸餾水)和10微升酶樣品。然后平板在室溫下溫育5-10分鐘(用于肽酶的成熟)，之后加入25微升40μM的Z-Phe-Arg-MCA(0.1％DMSO)。最后，在熒光計(jì)中測(cè)量460nm下MCA(4-甲基-香豆酸酰-7-酰胺)的發(fā)射。胰蛋白酶測(cè)定法(鐮孢胰蛋白酶的PNA測(cè)定法)底物將50mgNα-苯甲?；?DL-精氨酸-對(duì)-N-硝酰苯胺(Nitroanilide)(BAPNA，SigmaB-4875)溶于1mlDMSO且保存在-20℃。該溶液在即將使用前在測(cè)定緩沖液中稀釋100倍。測(cè)定緩沖液50mM硼酸鹽-NaOH(pH10.5)+2mMCaCl2方法將20微升樣品和200微升測(cè)定緩沖液在96-孔微量滴定盤中混合并在405nm下測(cè)量DeltaOD/min5分鐘。植酸酶測(cè)定法將10微升稀釋的酶樣品(在0.1M乙酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5中稀釋)加入250微升含5mM植酸鈉(Sigma)的0.1M乙酸鈉，0.01％Tween20，pH5.5(溶解植酸鈉后調(diào)節(jié)的pH；預(yù)熱底物)中并在37℃下溫育30分鐘。通過(guò)加入250微升10％TCA終止反應(yīng)并通過(guò)加入500微升將7.3gFeSO4溶于100ml鉬酸鹽試劑(2.5g(NH4)6Mo7O24.4H2O溶于8mlH2SO4中稀釋至250ml)所得的溶液來(lái)測(cè)量游離磷酸鹽。在96孔微量滴定板中測(cè)量200微升樣品在750nm下的吸光度。包含底物和酶空白對(duì)照。也包含磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-2mM磷酸鹽)。1U等于在給定條件下釋放1微摩爾磷酸鹽/分鐘的酶量。實(shí)施例實(shí)施例1在釀酒酵母中表達(dá)Derp1來(lái)自Dermantophagoidespteronyssinus的Derp1半胱氨酸蛋白酶(其氨基酸序列在SEQIDNO3中描述)編碼基因位于載體pSteD212中，該載體來(lái)自酵母表達(dá)載體pYES2.0(Invitrogen，Kofod等，1994J.Biol.Chem.26929182-29189和Christgau等，1994，Biochem.Mol.Biol.Int.33917-925)。該質(zhì)粒在大腸桿菌和釀酒酵母中都復(fù)制。在釀酒酵母中從該質(zhì)粒表達(dá)Derp1。重組體Derp1以Derp1前肽表達(dá)且具有破壞成熟序列內(nèi)唯一N-糖基化基序的突變S54N或N52Q。為了在酵母中分泌，通過(guò)將兩個(gè)不同的信號(hào)肽導(dǎo)入編碼pro-Derp1基因的上游檢測(cè)了它們的表達(dá)效率。通過(guò)克隆DNA片斷制備含有信號(hào)肽的表達(dá)構(gòu)建體(Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，冷泉港，1989)。一個(gè)信號(hào)肽是具有氨基酸序列MKIVLAIASLLALSAVYA的天然存在的DermantophagoidespteronyssinusDerp1信號(hào)肽且另一信號(hào)肽來(lái)自Humiculainsolens角質(zhì)酶并具有氨基酸序列MKFFTTILSTASLVAALP(SEQIDNO1)。具有塵螨(dustmite)Derp1信號(hào)肽的酵母菌株和構(gòu)建體稱為pre-pro-Derp1且具有角質(zhì)酶信號(hào)肽的酵母菌株和構(gòu)建體稱為cuti-pro-Derp1。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母。為了篩選表達(dá)Derp1的酵母轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化溶液涂布在SC-瓊脂板上用于在30℃形成菌落3天。將菌落接種在50ml無(wú)菌塑料管中，每管含有10mLSC培養(yǎng)基。試管在含有100mlSC培養(yǎng)基的500ml有擋板的錐形瓶中30℃，250rpm發(fā)酵4天。發(fā)酵培養(yǎng)液用于夾心ELISA實(shí)驗(yàn)以測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度。通過(guò)上面方法部分所述的夾心ELISA測(cè)定pre-proDerp1S54N和pre-proDerp1N52Q轉(zhuǎn)化子中Derp1的表達(dá)水平為相同的水平±8％?？赏茢嗑哂衟re-pro-Derp1的兩個(gè)菌株的表達(dá)水平不依賴于使用兩個(gè)突變S54N和N52Q中的哪一個(gè)。在另一實(shí)驗(yàn)中，4.5Lpre-pro-Derp1(N52Q)和cuti-pro-Derp1(S54N)的培養(yǎng)液發(fā)酵4天，發(fā)酵期間每天取樣并通過(guò)上述夾心ELISA測(cè)量Derp1的量以追蹤表達(dá)水平。cuti-pro-Derp1和pre-pro-Derp1表達(dá)產(chǎn)量之間的比率顯示如下。發(fā)酵的每天中cuti-pro-Derp1比pre-pro-Derp1多表達(dá)6-10倍的Derp1，表明pro-Derp1前面的角質(zhì)酶信號(hào)肽與使用天然塵螨Derp1信號(hào)肽比較增加了pro-Derp1蛋白的表達(dá)水平。實(shí)施例2在釀酒酵母中表達(dá)卷枝毛霉的纖維素酶卷枝毛霉IFO4554在含有RS-25+0.5％乳糖培養(yǎng)基的搖瓶中30℃下培養(yǎng)1天。收集菌絲體并用于mRNA制備，隨后將該mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用MCE-BC1F和MCE-NruR引物對(duì)和下列PCR條件通過(guò)PCR從該cDNA擴(kuò)增大約1kb的片斷94℃下2分鐘；35個(gè)循環(huán)的94℃下1分鐘，45℃下1分鐘和72℃下2.5分鐘；最后在72℃下8分鐘。將擴(kuò)增的片斷克隆進(jìn)T-載體(Novagene)。用引物對(duì)M61F和C-末端R61R，和M61CutisigF和C-末端R61R再擴(kuò)增T-載體中的片斷(毛霉纖維素酶基因)，其中前一引物對(duì)用于含原始信號(hào)序列(毛霉纖維素酶基因的信號(hào)序列)的構(gòu)建體，且后一引物對(duì)用于構(gòu)建含有H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)序列(SEQIDNO2)和毛霉纖維素酶基因的核酸序列。通過(guò)將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，和PvuII與XbaI分別消化的pJC039載體一起導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中轉(zhuǎn)化酵母。所得的轉(zhuǎn)化子在含有YPD培養(yǎng)基的24孔平板中在30℃和180rpm下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)物上清上樣到含有0.2％CMC(羧甲基纖維素)，pH8.5的瓊脂板的孔中。在下表中列出了圍繞含有酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清的孔的暈環(huán)大小，該酵母細(xì)胞表達(dá)含H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽或含毛霉纖維素酶基因信號(hào)肽的毛霉纖維素酶。由于該纖維素酶能夠降解CMC從而產(chǎn)生暈環(huán)，因此暈環(huán)的大小相關(guān)于放入特定孔中的培養(yǎng)上清中存在的纖維素酶的量。因此，大暈環(huán)表明纖維素酶的含量高而小暈環(huán)表明纖維素酶的含量低。該結(jié)果表明用H.insolens角質(zhì)酶基因的信號(hào)肽序列表達(dá)時(shí)毛霉纖維素酶在酵母中的表達(dá)水平比用其自身信號(hào)肽序列(毛霉纖維素酶基因)表達(dá)時(shí)高得多。實(shí)施例3在釀酒酵母中表達(dá)白車軸草半胱氨酸蛋白酶為了構(gòu)建含有α-因子信號(hào)肽和白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)載體，用引物對(duì)α-信號(hào)-MunI和α-信號(hào)-CysProR再次擴(kuò)增編碼α-因子信號(hào)肽的DNA片斷。用引物對(duì)，α-信號(hào)-CysProF和Spe-CysProR并使用EMBLAY192363序列作為模板再次擴(kuò)增編碼白車軸草半胱氨酸蛋白酶前體成熟區(qū)的基因。通過(guò)將這兩個(gè)PCR片斷與用HindIII和XbaI消化的pJC039載體混合在一起并導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中轉(zhuǎn)化酵母。為了構(gòu)建包含H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽和白車軸草半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)載體，用引物對(duì)Cuti-Sig-CysPro和CysProC-term再次擴(kuò)增編碼白車軸草半胱氨酸蛋白酶前體成熟區(qū)的基因。通過(guò)將獲得的PCR片斷與用HindIII和XbaI消化的pJC039載體混合并導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中轉(zhuǎn)化酵母。獲得的轉(zhuǎn)化子在含1mlYPD的24孔平板中27℃下培養(yǎng)3天，然后按方法部分所述檢測(cè)上清的半胱氨酸蛋白酶活性。半胱氨酸蛋白酶活性的測(cè)量值在下表中顯示。結(jié)果表明當(dāng)用H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽表達(dá)時(shí)白車軸草半胱氨酸蛋白酶在酵母中的表達(dá)水平比用α-因子信號(hào)肽高10倍。實(shí)施例4在釀酒酵母中表達(dá)鐮孢胰蛋白酶用引物對(duì)酵母-F和酵母-R，以及cuti-pre和酵母-R使用EMBLS63827序列作為模板再次擴(kuò)增鐮孢胰蛋白酶基因，即SEQIDNO6所示的cDNA序列。酵母-F/酵母-R引物對(duì)用于構(gòu)建包含編碼胰蛋白酶基因信號(hào)肽、前肽區(qū)(pro-region)和成熟部分的核酸序列的序列，而cuti-pre/酵母-R引物對(duì)用于構(gòu)建包含H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽和前肽區(qū)和鐮孢成熟胰蛋白酶基因的核酸序列。將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039載體一起導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中轉(zhuǎn)化酵母。獲得的轉(zhuǎn)化子(pTM-TP1和pTM-TP2)在含有YPD培養(yǎng)基的24孔平板中在30℃，180rpm下培養(yǎng)3天。pTM-TP1鐮孢胰蛋白酶信號(hào)+鐮孢胰蛋白酶前肽+成熟胰蛋白酶pTM-TP2H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)+H.insolens角質(zhì)酶前肽+成熟胰蛋白酶按上文方法部分所述測(cè)量胰蛋白酶活性。即使加入NeutraseTM(作為成熟酶)在兩種培養(yǎng)物上清中都沒(méi)有觀察到活性。然而，用pTM-TP2通過(guò)Western印跡檢測(cè)到胰蛋白酶的前體形式(角質(zhì)酶前肽+成熟胰蛋白酶)。因此，制備下列構(gòu)建體pTM-TP2-KexH.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽+H.insolens角質(zhì)酶前肽區(qū)+KexII位點(diǎn)+成熟鐮孢胰蛋白酶pTM-TP2w/oproH.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽+成熟鐮孢胰蛋白酶pTM-TP2TPproH.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽+鐮孢胰蛋白酶前肽區(qū)+鐮孢成熟胰蛋白酶各引物對(duì)，TP2-KexF和R，Cuti-preF和R以及CUTIpre-TPproF和R，分別通過(guò)將它們與用EagI消化的pTM-TP2載體混合并將該混合物導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中用于制備pTM-TP2-Kex，pTM-TP2w/opro和pTM-TP2Tppro。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有YPD培養(yǎng)基的24孔平板中在30℃，180rpm下培養(yǎng)3天。其中“-”是指在Western印跡中檢測(cè)不到活性或無(wú)結(jié)合帶，“+”是指可檢測(cè)到胰蛋白酶活性，“前體形式”是指可檢測(cè)到胰蛋白酶的前體形式，“N.T.”是指“沒(méi)有檢測(cè)”且對(duì)于pTM-TP2w/opro是指可檢測(cè)到比成熟酶更大的蛋白質(zhì)，然而該構(gòu)建體設(shè)計(jì)成不包含前肽區(qū)，因此它不是前體形式。當(dāng)向上清中加入Neutrase時(shí)(終濃度0.5AU/ml)用pTM-TP2TPpro載體檢測(cè)到胰蛋白酶活性。結(jié)果表明鐮孢胰蛋白酶自身信號(hào)肽在酵母中不能有效工作以表達(dá)胰蛋白酶，而H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽則可以。鐮孢胰蛋白酶的前肽區(qū)(也稱為前肽序列)(7個(gè)氨基酸)似乎對(duì)于該胰蛋白酶的正確折疊和活化是必需的。實(shí)施例5在釀酒酵母中表達(dá)隔孢伏革菌植酸酶用引物對(duì)(PP1F和PPR，PP2F和PPR)使用EMBLPLY310696序列作為模板擴(kuò)增隔孢伏革菌的植酸酶基因，即，SEQIDNO8所示的cDNA序列。PP1F/PPR引物對(duì)用于構(gòu)建編碼隔孢伏革菌植酸酶基因信號(hào)肽和隔孢伏革菌植酸酶成熟蛋白的核酸序列，而PP2F/PPR引物對(duì)用于構(gòu)建編碼H.insolens角質(zhì)酶基因信號(hào)肽和成熟隔孢伏革菌植酸酶蛋白的核酸序列。通過(guò)將所得的PCR片斷與用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039載體一起導(dǎo)入釀酒酵母YNG318中轉(zhuǎn)化酵母。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有YPD培養(yǎng)基的24孔平板和500ml搖瓶中在30℃，180rpm下培養(yǎng)3天。pTMPP1構(gòu)建體包含隔孢伏革菌植酸酶的原有信號(hào)肽序列，而pTMPP2構(gòu)建體包含H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽序列。按方法部分所述測(cè)量在24孔平板或搖瓶中培養(yǎng)的包含pTMPP1或pTMPP2構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物上清中的植酸酶活性。結(jié)果如下所示。結(jié)果表明包含pTMPP2構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子比包含pTMPP1構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子表達(dá)更高的植酸酶活性，表明H.insolens信號(hào)肽與植酸酶自身信號(hào)肽相比增加在酵母中的植酸酶表達(dá)。實(shí)施例6在米曲霉中表達(dá)隔孢伏革菌的植酸酶使用實(shí)施例5所述的包含具有其自身信號(hào)肽序列的植酸酶基因和具有H.insolens角質(zhì)酶信號(hào)肽序列的植酸酶基因的構(gòu)建體來(lái)構(gòu)建曲霉屬的表達(dá)載體并按Lassen等，(2001)，AppliedandEnvironmentalMicorbiology，67，4701-4707中所述轉(zhuǎn)化曲霉。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體，分離49個(gè)菌株，純化并通過(guò)在搖瓶中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子按上文方法部分所述測(cè)量植酸酶的產(chǎn)量。當(dāng)比較來(lái)自兩組構(gòu)建體的表達(dá)最高水平植酸酶的菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)包含具有角質(zhì)酶信號(hào)肽的構(gòu)建體的菌株比包含植酸酶信號(hào)肽的菌株表達(dá)的植酸酶多大約1.4倍。同樣，當(dāng)比較每組中表達(dá)最大量植酸酶的5個(gè)菌株的植酸酶平均表達(dá)量時(shí)，包含具有角質(zhì)酶信號(hào)肽的構(gòu)建體的菌株比包含具有植酸酶信號(hào)肽的構(gòu)建體的菌株表達(dá)的植酸酶多大約1.3倍。序列表<110>諾維信公司(NovozymesA/S)<120>用于生產(chǎn)多肽的信號(hào)肽<130>10656<160>9<170>PatentInversion3.2<210>1<211>18<212>PRT<213>Humicolainsolens<400>1MetLysPhePheThrThrIleLeuSerThrAlaSerLeuValAlaAla151015LeuPro<210>2<211>54<212>DNA<213>Humicolainsolens<400>2atgaagttcttcaccaccatcctcagcaccgccagccttgttgctgctctcccc54<210>3<211>320<212>PRT<213>Dermatophagoidespteronyssinus<220><221>SIGNAL<222>(1)..(18)<220><221>PROPEP<222>(19)..(98)<220><221>mat_peptide<222>(99)..(320)<400>3MetLysIleValLeuAlaIleAlaSerLeuLeuAlaLeuSerAlaVal-95-90-85TyrAlaArgProSerSerIleLysThrPheGluGluTyrLysLysAla-80-75-70PheAsnLysSerTyrAlaThrPheGluAspGluGluAlaAlaArgLys-65-60-55AsnPheLeuGluSerValLysTyrValGlnSerAsnGlyGlyAlaIle-50-45-40-35AsnHisLeuSerAspLeuSerLeuAspGluPheLysAsnArgPheLeu-30-25-20MetSerAlaGluAlaPheGluHisLeuLysThrGlnPheAspLeuAsn-15-10-5AlaGluThrAsnAlaCysSerIleAsnGlyAsnAlaProAlaGluIle-11510AspLeuArgGlnMetArgThrValThrProIleArgMetGlnGlyGly15202530CysGlySerCysTrpAlaPheSerGlyValAlaAlaThrGluSerAla354045TyrLeuAlaTyrArgAsnGlnSerLeuAspLeuAlaGluGlnGluLeu505560ValAspCysAlaSerGlnHisGlyCysHisGlyAspThrIleProArg657075GlyIleGluTyrIleGlnHisAsnGlyValValGlnGluSerTyrTyr808590ArgTyrValAlaArgGluGlnSerCysArgArgProAsnAlaGlnArg95100105110PheGlyIleSerAsnTyrCysGlnIleTyrProProAsnValAsnLys115120125IleArgGluAlaLeuAlaGlnThrHisSerAlaIleAlaValIleIle130135140GlyIleLysAspLeuAspAlaPheArgHisTyrAspGlyArgThrIle145150155IleGlnArgAspAsnGlyTyrGlnProAsnTyrHisAlaValAsnIle160165170ValGlyTyrSerAsnAlaGlnGlyValAspTyrTrpIleValArgAsn175180185190SerTrpAspThrAsnTrpGlyAspAsnGlyTyrGlyTyrPheAlaAla195200205AsnIleAspLeuMetMetIleGluGluTyrProTyrValValIleLeu210215220<210>4<211>316<212>PRT<213>卷枝毛霉(Mucorcircinellides)<220><221>mat_peptide<222>(1)..(316)<400>4AlaSerCysSerSerValTyrGlyGlnCysGlyGlyIleGlyTrpSer151015GlyProThrCysCysGlnSerGlySerThrCysValAlaGlnGluGly202530AsnLysTyrTyrSerGlnCysLeuProGlySerHisSerAsnAsnAla354045GlyAsnAlaSerSerThrLysLysThrSerThrLysSerSerThrThr505560ThrAlaLysAlaThrAlaThrValThrThrLysThrValThrLysThr65707580ThrThrLysThrThrThrLysThrSerThrThrAlaA1aAlaSerThr859095SerThrSerSerSerAlaGlyTyrLysValIleSerGlyGlyLysSer100105110GlySerGlySerThrThrArgTyrTrpAspCysCysLysAlaSerCys115120125SetTrpProGlyLysAlaSerValThrGlyProValAspThrCysAla130135140SerAsnGlyIleSerLeuLeuAspAlaAsnAlaGlnSerGlyCysAsn145150155160GlyGlyAsnGlyPheMetCysAsnAsnAsnGlnProTrpAlaValAsn165170175AspGluLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaAlaSerIleAlaGlySerAsn180185190GluAlaGlyTrpCysCysGlyCysTyrGluLeuThrPheThrSetGly195200205AlaAlaSerGlyLysLysMetValValGlnValThrAsnThrGlyGly210215220AspLeuGlySerAsnHisPheAspLeuGlnMetProGlyGlyGlyVal225230235240GlyIlePheAsnGlyCysAlaAlaGlnTrpGlyAlaProAsnAspGly245250255TrpGlyAlaArgTyrGlyGlyValSerSerValSerAspCysAlaSer260265270LeuProSerAlaLeuGlnAlaGlyCysLysTrpArgPheAsnTrpPhe275280285LysAsnSerAspAsnProThrMetThrPheLysGluValThrCysPro290295300AlaGluLeuThrThrArgSerGlyCysGluArgLys305310315<210>5<211>327<212>PRT<213>白車軸草(TrifoliumrepensL)<220><221>mat_peptide<222>(109)..(327)<400>5ArgAspPheSerIleValGlyTyrSerSerGluAspLeuLysSerMet-105-100-95AspLysLeuIleGluLeuPheGluSerTrpMetSerArgHisGlyLys-90-85-80IleTyrGluThrIleGluGluLysLeuLeuArgPheGluValPheLys-75-70-65AspAsnLeuLysHisIleAspAspArgAsnLysValValSerAsnTyr-60-55-50-45TrpLeuGlyLeuAsnGluPheAlaAspLeuSerHisGlnGluPheLys-40-35-30AsnLysTyrLeuGlyLeuLysValAspLeuSerGlnArgArgGluSer-25-20-15SerAsnGluGluGluPheThrTyrArgAspValAspLeuProLysSer-10-5-11ValAspTrpArgLysLysGlyAlaValThrProValLysAsnGlnGly5101520GlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerThrValAlaAlaValGluGly253035IleAsnGlnIleValThrGlyAsnLeuThrSerLeuSerGluGlnGlu404550LeuIleAspCysAspThrThrTyrAsnAsnGlyCysAsnGlyGlyLeu556065MetAspTyrAlaPheSerPheIleValGlnAsnGlyGlyLeuHisLys707580GluAspAspTyrProTyrIleMetGluGluSerThrCysGluMetLys859095100LysGluGluThrGlnValValThrIleAsnGlyTyrHisAspValPro105110115GlnAsnAsnGluGlnSerLeuLeuLysAlaLeuAlaAsnGlnProLeu120125130SerValAlaIleGluAlaSerSerArgAspPheGlnPheTyrSerGly135140145GlyValPheAspGlyHisCysGlySerAspLeuAspHisGlyValSer150155160AlaValGlyTyrGlyThrSerLysAsnLeuAspTyrIleIleValLys165170175180AsnSerTrpGlyAlaLysTrpGlyGluLysGlyPheIleArgMetLys185190195ArgAsnIleGlyLysProGluGlyIleCysGlyLeuTyrLysMetAla200205210SerTyrProThrLysLysLys215<210>6<211>998<212>DNA<213>尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)<220><221>CDS<222>(58)..(804)<400>6atcatcaaccactcttcactcttcaactctcctctcttggatatctatctcttcacc57atggtcaagttcgcttccgtcgttgcacttgttgctcccctggctgct105MetValLysPheAlaSerValValAlaLeuValAlaProLeuAlaAla151015gccgctcctcaggagatccccaacattgttggtggcacttctgccagc153AlaAlaProGlnGluIleProAsnIleValGlyGlyThrSerAlaSer202530gctggcgactttcccttcatcgtgagcattagccgcaacggtggcccc201AlaGlyAspPheProPheIleValSerIleSerArgAsnGlyGlyPro354045tggtgtggaggttctctcctcaacgccaacaccgtcttgactgctgcc249TrpCysGlyGlySerLeuLeuAsnAlaAsnThrValLeuThrAlaAla505560cactgcgtttccggatacgctcagagcggtttccagattcgtgctggc297HisCysValSerGlyTyrAlaGlnSerGlyPheGlnIleArgAlaGly65707580agtctgtctcgcacttctggtggtattacctcctcgctttcctccgtc345SerLeuSerArgThrSerGlyGlyIleThrSerSerLeuSerSerVal859095agagttcaccctagctacagcggaaacaacaacgatcttgctattctg393ArgValHisProSerTyrSerGlyAsnAsnAsnAspLeuAlaIleLeu100105110aagctctctacttccatcccctccggcggaaacatcggctatgctcgc441LysLeuSerThrSerIleProSerGlyGlyAsnIleGlyTyrAlaArg115120125ctggctgcttccggctctgaccctgtcgctggatcttctgccactgtt489LeuAlaAlaSerGlySerAspProValAlaGlySerSerAlaThrVal130135140gctggctggggcgctacctctgagggcggcagctctactcccgtcaac537AlaGlyTrpGlyAlaThrSerGluGlyGlySerSerThrProValAsn145150155160cttctgaaggttactgtccctatcgtctctcgtgctacctgccgagct585LeuLeuLysValThrValProIleValSerArgAlaThrCysArgAla165170175cagtacggcacctccgccatcaccaaccagatgttctgtgctggtgtt633GlnTyrGlyThrSerAlaIleThrAsnGlnMetPheCysAlaGlyVal180185190tcttccggtggcaaggactcttgccagggtgacagcggcggccccatc681SerSerGlyGlyLysAspSerCysGlnGlyAspSerGlyGlyProIle195200205gtcgacagctccaacactcttatcggtgctgtctcttgggg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luGlyCysThrValThrGln20253035ValAsnLeuIleGlnArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAla404550ArgSerArgGlnValAlaAlaValAlaLysIleGlnMetAlaArgPro556065PheThrAspProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPhe707580GlyValAlaAspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGlnSerHisGlnThr859095GlyThrAspMetTyrThrArgTyrSerThrLeuPheGluGlyGlyAsp100105110115ValProPheValArgAlaAlaGlyAspGlnArgValValAspSerSer120125130ThrAsnTrpThrAlaGlyPheGlyAspAlaSerGlyGluThrValLeu135140145ProThrLeuGlnValValLeuGlnGluGluGlyAsnCysThrLeuCys150155160AsnAsnMetCysProAsnGluValAspGlyAspGluSerThrThrTrp165170175LeuGlyValPheAlaProAsnIleThrAlaArgLeuAsnAlaAlaAla180185190195ProSerAlaAsnLeuSerAspSerAspAlaLeuThrLeuMetAspMet200205210CysProPheAspThrLeuSerSerGlyAsnAlaSerProPheCysAsp215220225LeuPheThrAlaGluGluTyrValSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeu230235240AspLysTyrTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGln245250255GlyValGlyTyrValAsnGluLeuLeuAlaArgLeuThrGlyGlnAla260265270275ValArgAspGluThrGlnThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAla280285290ThrPheProLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsn295300305ThrMetValProIlePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrAla310315320LeuAspProLeuLysProAspGluAsnArgLeuTrpValAspSerLys325330335LeuValProPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSer340345350355GlyLysGluAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGlnProLeu360365370GluPheCysGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheVal375380385GluSerGlnThrTyrAlaArgGluAsnGlyGlnGlyAspPheAlaLys390395400CysGlyPheValProSerGlu405410權(quán)利要求1.生產(chǎn)分泌多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對(duì)于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP和每ml0.2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次并使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘；和(b)從培養(yǎng)基中分離分泌的多肽。2.權(quán)利要求1的方法，其中第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO1的氨基酸序列的信號(hào)肽。3.權(quán)利要求1的方法，其中第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的氨基酸序列組成的信號(hào)肽，或其保留指導(dǎo)該多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜例如進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的肽片斷。4.權(quán)利要求1的方法，其中第一核苷酸序列由SEQIDNO2，或其編碼保留指導(dǎo)該多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜，例如，進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的信號(hào)肽的子序列組成。5.根據(jù)任一前面權(quán)利要求的方法，其中第二核苷酸序列編碼對(duì)該真菌宿主細(xì)胞為天然的多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中第二核苷酸序列編碼對(duì)該真菌宿主細(xì)胞為異源的多肽。7.根據(jù)任一前面權(quán)利要求的方法，其中該真菌宿主細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的第二核苷酸序列。8.根據(jù)任一前面權(quán)利要求的方法，其中第二核苷酸序列編碼激素或激素變異體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，過(guò)敏原或報(bào)道分子。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該酶是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，或連接酶。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，過(guò)氧化氫酶，纖維素酶，纖維二糖水解酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，內(nèi)切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，mutanase，氧化酶，果膠降解酶，過(guò)氧化物酶，磷脂酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，木聚糖酶，或β-木糖苷酶。11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中第二核苷酸序列編碼過(guò)敏原，例如，來(lái)自Dermantophagoidespteronyssinus的Derp1，特別是SEQIDNO3中氨基酸19-320或其變異體。12.根據(jù)任一前面權(quán)利要求的方法，其中該真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞，例如曲霉屬細(xì)胞，例如米曲霉。13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中該真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，例如酵母屬細(xì)胞，例如，釀酒酵母。14.核酸構(gòu)建體，包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地相連的編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相對(duì)于第二核苷酸序列是外源的，且第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次并使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。15.根據(jù)權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體，其中第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO1的氨基酸序列的信號(hào)肽。16.根據(jù)權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO1的氨基酸序列組成的信號(hào)肽，或其保留指導(dǎo)該多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜例如進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的肽片斷。17.根據(jù)權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體，其中第一核苷酸序列由SEQIDNO2，或其編碼保留指導(dǎo)該多肽進(jìn)入或通過(guò)細(xì)胞膜例如進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的能力的信號(hào)肽的子序列組成。18.含有權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。19.含有權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求18的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。20.信號(hào)肽用于生產(chǎn)多肽的用途，其中該信號(hào)肽由第一核苷酸序列編碼且多肽由相對(duì)于第一核苷酸序列是外源的第二核苷酸序列編碼，且第一核苷酸序列的3′端緊接著第二核苷酸序列的上游，且其中第一核苷酸序列選自如下組成的組中(i)編碼具有與SEQIDNO1有至少70％同一性的氨基酸序列的信號(hào)肽的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO2的核苷酸，或其互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃的0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗滌15分鐘一次并使用6XSSC洗滌兩次各15分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及包括使用信號(hào)肽生產(chǎn)多肽的方法，涉及含有編碼信號(hào)肽的第一核苷酸序列和相對(duì)于第一核苷酸序列是外源的編碼多肽的第二核苷酸序列。另外，還涉及含有所述核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N15/81GK1969041SQ200580019572公開日2007年5月23日申請(qǐng)日期2005年6月14日優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日發(fā)明者松井知子,亨麗埃特·德拉伯格,斯特芬·丹尼爾森申請(qǐng)人:諾維信公司