專利名稱：一種抑制內(nèi)源靶基因的同時(shí)能表達(dá)外源基因的多功能慢病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體地說(shuō)是涉及到一種能通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)shRNA抑制細(xì)胞內(nèi)源功能缺陷型或者野生型靶基因，而同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)導(dǎo)入的功能野生型或者突變型外源基因替代內(nèi)源基因，使細(xì)胞性狀發(fā)生相應(yīng)改變從而確認(rèn)該基因功能的多功能慢病毒載體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
在人類基因組測(cè)序項(xiàng)目完成之后，對(duì)用來(lái)研究基因組功能的工具的開(kāi)發(fā)提出了新的挑戰(zhàn)，小干擾RNA(SiRNA)已經(jīng)被證明是快速且有力的研究基因功能的一種技術(shù)。但是， 由于siRNA通過(guò)電轉(zhuǎn)或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，不斷的降解以及隨著細(xì)胞分裂而減少，很難維持對(duì)靶基因的穩(wěn)定抑制，此外，有些細(xì)胞系和原代細(xì)胞不易轉(zhuǎn)染。為了克服這個(gè)難點(diǎn)， 人們開(kāi)發(fā)了一些可以把小莖環(huán)RNA(shRNA)表達(dá)框?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中，以慢病毒載體最具潛力，因?yàn)樗芨腥窘^大部分不同類型的細(xì)胞，包括為非分裂期的原代細(xì)胞，并且能將DNA整合到細(xì)胞基因組中穩(wěn)定表達(dá)。盡管設(shè)計(jì)siRNA有多種原則以及運(yùn)算法則，但是要設(shè)計(jì)非常特異的siRNA仍然很困難。大量證據(jù)顯示，siRNA介導(dǎo)的基因沉默最普遍的問(wèn)題就是脫靶效應(yīng)。在許多研究中， 幾十甚至幾百個(gè)基因會(huì)被siRNA的正義鏈或者反義鏈非特異的干擾，更有些siRNAs能誘導(dǎo)干擾素的應(yīng)答。相比siRNA，shRNA中間具有莖環(huán)序列，可形成3’端2個(gè)堿基突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)，shRNA以Dicer酶依賴或者非依賴的方式被切割成siRNAs，參與RNA干擾機(jī)制， 然而脫靶效應(yīng)也隨之產(chǎn)生。此外，shRNA還可以作為微小RNA(miRNA)的類似物，引起大范圍的脫靶效應(yīng)，這些都會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生并且對(duì)表型作出錯(cuò)誤的結(jié)論。為了鑒定siRNA的脫靶效應(yīng)，人們采用了多種策略，例如設(shè)計(jì)多個(gè)siRNA來(lái)作用mRNA上不同的位點(diǎn)，又或者通過(guò)表達(dá)能抗RNAi的靶基因異構(gòu)體來(lái)證明表型的恢復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決siRNA和shRNA在應(yīng)用上的三個(gè)主要的技術(shù)難點(diǎn)確保特異的RNA干擾， 高效的shRNA轉(zhuǎn)染，以及穩(wěn)定的shRNA表達(dá)，我們發(fā)明了一種多功能慢病毒載體，它能在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)抑制和恢復(fù)表達(dá)靶基因，對(duì)比研究細(xì)胞表型的改變到恢復(fù)原狀，可以確定 RNA干擾的特異性，從而使得基礎(chǔ)研究者更能精確的闡述靶基因在信號(hào)通路的地位，以及一些未知功能，并且該載體還可用來(lái)抑制內(nèi)源功能缺陷型靶基因而高效導(dǎo)入并穩(wěn)定表達(dá)外源功能野生型靶基因，為基因治療提供一種非常有力的工具。本發(fā)明旨在確保特異的RNA干擾，高效的shRNA轉(zhuǎn)染，以及穩(wěn)定的shRNA表達(dá)，而提供一種多功能慢病毒載體，從而使得基礎(chǔ)研究者根據(jù)RNA干擾數(shù)據(jù)更能精確的闡述靶基因的功能，并且該載體還可用來(lái)消除內(nèi)源功能缺陷型靶基因而穩(wěn)定高效的導(dǎo)入外源功能野生型靶基因，為基因治療提供一種非常有力的工具。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明改進(jìn)了傳統(tǒng)單一功能的慢病毒，該多功能慢病毒載體是以 pBluescript(+)為骨架，由 5’LTR-hU6-MCSl-UbiC-MCS2-Tag-IRES-Puro-WPRE_3’LTRU3 Δ構(gòu)成的特征序列。本發(fā)明由如下方法獲得以質(zhì)粒FUGW(購(gòu)自addgene，美國(guó))為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物pl/p2，p3/p4，序列分別為pi :5，-GGTGCTAGCTAGAATTAACCAAACTGGATC,p2 :5， -CGCGTTGACATTGATTATTG,p3 :5， -CTGCTAGAGATTTTCCACACTG,p4 5 ’ -CCCGTTAACGCGGCCGCGACTCTAGTCCCTCCCAATTCGATATCAAGCTTATCGpl/p2 擴(kuò)增得到 5’LTR，p3/p4 擴(kuò)增得到 3’LTRU3 Δ，依次裝入 pBluescript SK (+) (購(gòu)自Stratagene)載體中，得到過(guò)渡載體plasmid-Ι (圖2)，其中3’LTR中U3區(qū)的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子被去除，在將來(lái)的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，缺失的3’ LTR傳遞到子代載體的5’ LTR，這導(dǎo)致所形成的載體缺乏增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列而失活，即使在所有病毒蛋白都存在的情況下也不能轉(zhuǎn)錄RNA，提高安全性。以質(zhì)粒pSilencer2.0-U6(購(gòu)自Ambion)為模板，引物序列為p5 5 ’ -CCTCTCGAGAAGAATTCTTTCTAGAGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATAT,p6 :5， -CTAGCTAGCACCCCAGTGGAAAGACGC,擴(kuò)增得到hTO片段，Nhel/Xhol雙酶切消化hTO片段與plasmid-l，膠回收后連接， 得到過(guò)渡載體plasmid-2 (圖3)，以質(zhì)粒pBABE-puro (購(gòu)自addgene)為模板，引物序列為p7 :5，-CGCGTTAACGGGGTCGTGCGCTCCTTTC,p8 :5’ -GGCTTTTTTGTTAGACGGAATTCACGCGTGGGCCCGGGATCCACCGGTCGACTACAAGGACG ACGATGACAAGGGGCATCACCATCACCACCATTAGCTAGCGTTTAAACACAGCTGTGGAATGTGTGTCAG,擴(kuò)增得到 puro+FH(Tag)片段，以及以質(zhì)粒pLenti6/Ubc/V5-DEST Gateway(購(gòu)自 Invitrogen)為模板，引物序列為p9 :5’-CTGACACACATTCCACAGCTGTGTTTAAACGCTAGCTAATGGTGGTGATGGTGATGCCCCTTG TCATCGTCGTCCTTGTAGTCGACCGGTGGATCCCGGGCCCACGCGTGAATTCCGTCTAACAAAAAAGCC,ρ10 5 ’ -CTTCTCGAGAGGCCTCCGCGCCGGGTTTTG擴(kuò)增得到UbiC+FH(Tag)片段，膠回收puro與UbiC片段并混合，以其為模板，用 p7，plO為一對(duì)引物，擴(kuò)增得到puro+FH+UbiC片段，Hpal/Xhol雙酶切該片段與plasmid2， 膠回收后連接，得到多功能慢病毒載體PU2-H1(圖4)。5’ LTR與UbiC之間的多克隆位點(diǎn) 1 (MCSl)，用于插入目的基因的shRNA, UbiC與FH(Tag序列)之間的多克隆位點(diǎn)2 (MCS2)， 用于插入抗RNAi目的基因或者功能相關(guān)的基因。多功能慢病毒載體PU2-H1整體構(gòu)建策略的圖示和酶切鑒定圖譜分別見(jiàn)圖5與圖6。該慢病毒載體有下列特點(diǎn)
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)較傳統(tǒng)的慢病毒載體，具有兩個(gè)啟動(dòng)子與相應(yīng)的兩個(gè)可供ShRNA與基因插入的多克隆位點(diǎn)，兩者可同時(shí)表達(dá)且互不沖突。用于插入表達(dá)基因的MCS2的3’端帶上Tag序列，并且可以根據(jù)需要進(jìn)行更換，有利于后續(xù)的外源基因表達(dá)的蛋白的檢測(cè)，也可以刪除，以避免Tag對(duì)某些外源基因的影響；采用U6與UbiC啟動(dòng)，可以高效的表達(dá)shRNA 與外源基因；慢病毒載體能感染絕大部分不同類型的細(xì)胞，并且能將DNA整合到細(xì)胞基因組中穩(wěn)定表達(dá)。應(yīng)用特點(diǎn)對(duì)照只表達(dá)shRNA與同時(shí)表達(dá)shRNA和靶基因，可確定shRNA的干擾作用是否具有特異性，有效的避免實(shí)驗(yàn)研究中由于RNA干擾的脫靶效應(yīng)，而對(duì)靶基因的功能作出不恰當(dāng)?shù)慕忉?；在基因治療中，將可以用?lái)抑制內(nèi)源功能缺陷型基因，消除缺陷型基因?qū)?xì)胞的負(fù)面影響，可提高導(dǎo)入的外源功能野生型基因的療效。


圖1是多功能慢病毒載體PU2-FH結(jié)構(gòu)示意2是pl/p2引物擴(kuò)增5，LTR以及p3/p4引物擴(kuò)增3，LTRU3 Δ的結(jié)果。圖3是ρ5/ρ6引物擴(kuò)增hTO的結(jié)果。圖 4 是 p7/p8 引物擴(kuò)增 puro+FH(Tag)與 p9/pl0 擴(kuò)增 UbiC+FH(Tag)以及用 p7/ PlO為引物，做連接PCR，擴(kuò)增puro+FH+UbiC的結(jié)果。圖5是多功能慢病毒載體PU2-FH構(gòu)建策略的圖示。圖6是多功能慢病毒載體PU2-FH的酶切鑒定圖譜。圖 7 是 α -ACTNl shRNA 靴序列以及抗 RNAi 的人 α -ACTNl (rr- α -ACTN1)部分序列。圖8是Jurkat T細(xì)胞感染含不同表達(dá)框的病毒后，免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9是Jurkat T細(xì)胞感染含不同表達(dá)框的病毒后，顯微共聚焦觀察結(jié)果。圖10是細(xì)胞遷移分析結(jié)果。圖11是U20S內(nèi)源p53RNAi與外源p53表達(dá)恢復(fù)后免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果。序列表說(shuō)明SEQ ID No 1是多功能慢病毒載體PU2-FH序列。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋和說(shuō)明，對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1 α -ACTNl shRNA表達(dá)框的構(gòu)建預(yù)測(cè)的人α -ACTNl shRNA 靴序列是 5，GGGACACAGATCGAGAACATCGAAGAG (圖 7)。設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)寡聚核苷酸，序列如下Al 5 ‘ -CTAGAGGGACACAGATCGAGAACATCGAAGAGTTCAAGAGACTCTTCGA TGTTCTCGATCTGTGTCCCTTTTTCA2 5 ’ TCGAGAAAAAGGGACACAGATCGAGAACATCGAAGAGTCTCTTGAACTCTTCGATGTTCTCGATCTG TGTCCCT
將這對(duì)引物A1/A2等量混合后，95度變性5分鐘，自然冷卻退火。與經(jīng)過(guò)XbaI/ XhoI酶切的慢病毒載體PU2-FH連接，得到質(zhì)粒PU2- α -ACTmshRNA。實(shí)施例2 抗 RNAi 的人 α -ACTNl (rr- α -ACTN1) cDNA 的構(gòu)建(圖 7)根據(jù)siRNA靶序列，在不影響氨基酸序列的前提下，設(shè)計(jì)含有4個(gè)點(diǎn)突變的引物， 序列如下(1) ；5，-AGAGAATTCCATGGACCATTATGATTCTCAGCAAAC,(2) ；5，-CCTCTTCAATATTTTCAATCTGTGTCCCCGCCTTCCGGAG,(3) ；5，-CACAGATTGAAAATATTGAAGAGGACTTCCGGGATGGCCTG,(4) ；5，-CTCGGTACCGGTGAGGTCACTCTCGCCGTACAG,以質(zhì)粒 GC-Z6382 (購(gòu)自 genecopoeia)為模板，rr_ α -ACTNl 的 N-端片段(N_ter) 用1和2引物擴(kuò)增，C-端片段(C-ter)用3和4引物擴(kuò)增，再利用連接PCR以1，4為引物， 兩個(gè)純化后的混合PCR產(chǎn)物片段為模板，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)rr- α -ACTm，經(jīng)過(guò)EcoRI/Agel酶切，克隆到同樣用EcoRI/Agel酶切的本發(fā)明的慢病毒質(zhì)粒PU2-α -ACTm shRNA中，這樣， 所得到的α -ACTNl核苷酸突變體重組質(zhì)粒既能抑制內(nèi)源α -ACTNl的表達(dá)但又能同時(shí)表達(dá)外源野生型 α-ACTNl，命名為 PU2-α-ACTm shRNA+rr-α-ACTm。以質(zhì)粒 pEGFP-Cl (購(gòu)自 clontech)為模板，設(shè)計(jì)引物，序列如下(5) ；5，-ACGACCGGTATGGTGAGCAAGGGCGAG(6) ；5，-ACGACCGGTTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC擴(kuò)增得到EGFP cDNA,經(jīng)過(guò)AgeI酶切，克隆到同樣用AgeI酶切的本發(fā)明的慢病毒質(zhì)粒PU2- α -ACTNl shRNA+rr- α -ACTNl中，得到帶GFP標(biāo)簽的質(zhì)粒，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)，命名為 PU2-α -ACTNl shRNA+rr-α -ACTN1+GFP.實(shí)施例3 慢病毒的產(chǎn)生和導(dǎo)入將293T細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)培養(yǎng)在直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，用包裝質(zhì)粒 pHR，8. 2deltaR/pCMV-VSV-G (購(gòu)自 addgene)，比例為 8 1 (總 DNA 量為 5 μ g)分別與兩個(gè)慢病毒重組質(zhì)粒PU2- α -ACTNl shRNA, PU2- α -ACTNl shRNA+rr- α -ACTN1+GFP (各 5 μ g) 共轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后更換培養(yǎng)液，第二天從轉(zhuǎn)染的293Τ細(xì)胞中收集含病毒的培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò) 0.45 μ m濾器過(guò)濾，去除殘留的293T細(xì)胞。在感染Jurkat T細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)時(shí)，將病毒與新鮮培養(yǎng)基等體積混合，加入硫酸魚(yú)精蛋白(終濃度為10 μ g/ml，Sigma)，培養(yǎng)細(xì)胞6小時(shí)或過(guò)夜后，更換新鮮的無(wú)病毒的培養(yǎng)液，24小時(shí)后，加入嘌呤霉素篩選，直到所有細(xì)胞在熒光顯微鏡下都呈綠色。實(shí)施例4 內(nèi)源α -ACTNl與外源rr_ α -ACTNl表達(dá)與定位分析提取被兩種病毒感染(表達(dá)shRNA或shRNA/rr- α -ACTN1+GFP)的Jurkat T細(xì)胞的蛋白，以及以未感染的Jurkat T細(xì)胞為對(duì)照，每個(gè)樣品上樣30 μ g，用抗α-ACTW抗體 (購(gòu)自CST)做免疫印記實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如(圖8)。將兩種病毒感染(表達(dá)shRNA或shRNA/rr- α -ACTN1+GFP)的JurkatT細(xì)胞的蛋白，以及以未感染的Jurkat T細(xì)胞為對(duì)照，種于蓋玻片上，36小時(shí)后制片，用抗α-ACTm抗體做免疫熒光實(shí)驗(yàn)，顯微共聚焦顯微鏡觀察到的結(jié)果如圖9，rr-α -ACTm+GFP在細(xì)胞中的定位與內(nèi)源的α-ACmi相同，都定位在細(xì)胞外圍，內(nèi)源F-actin抗體(購(gòu)自CST)標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)rr- α -ACTN1+GFP還能與內(nèi)源F-actin共定位，說(shuō)明C端的GFP標(biāo)簽并不影響α -ACTNl的細(xì)胞定位。實(shí)施例5 細(xì)胞遷移分析Jurkat T細(xì)胞(3X105/ml)在遷移培養(yǎng)基中血清饑餓培養(yǎng)(RPMI含有0. 25% BSA 和IOmM HEPES pH 7. 0) 1. 5小時(shí)，含有4X105細(xì)胞的100 μ 1的遷移培養(yǎng)基加到上室孔，并且在下室孔里加600 μ 1的遷移培養(yǎng)基，加入或者不加趨化因子h-SDF-1 α (購(gòu)自sigma) (5ng/ ml)。在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1. 5小時(shí)后，收集在下室孔中的細(xì)胞，離心沉淀，重懸于 100 μ 1的遷移培養(yǎng)基中并計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖10。結(jié)果該質(zhì)粒能通過(guò)抑制ci-ACmi的表達(dá)從而抑制細(xì)胞遷移，當(dāng)恢復(fù)α -ACTNl表達(dá)后，又能恢復(fù)細(xì)胞遷移的功能，從而說(shuō)明該質(zhì)粒能特異的抑制α -ACTNl并且高效的恢復(fù)α -ACTNl的表達(dá)。實(shí)施例6 :p53 shRNA表達(dá)框與抗RNAi p53突變體的構(gòu)建根據(jù)已發(fā)表的p53 cDNA序列(gi | 187830767)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物 5，-GGAATTCGGATGGAGGAGCCGCAGTC 和 5，-CGGGATCCGGGTCTGAGTCAGGCCCTTC,以 HeLa 細(xì)胞 cDNA為模板，擴(kuò)增得到p53基因，利用EcoRI/BamHI克隆到pUC19(購(gòu)自Takara)。p53 shRNA 靶序列是GACTCCAGTGGTAATCTAC，在不影響氨基酸序列的前提下，設(shè)計(jì)一對(duì)含有4個(gè)點(diǎn)突變的引物，序列如下(5)5， -GACTCGAGCGGAAACCTACTGGGACGGAACAGC,
(6) 5，-AGTAGGTTTCCGCTCGAGTCTTCCAGTGTGATG以pUC19_p53重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增后用DpnI消化模板質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取克隆，通過(guò)測(cè)序鑒定得到P53核苷酸突變體，命名為pUC19-p53Sh775r。人工合成一對(duì)互補(bǔ)的寡聚核苷酸01 5 ’ -CTAGAGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTC02 5’ -TCGAGAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCACTGGAGTCT將這對(duì)引物等量混合后，95攝氏度變性5分鐘，自然冷卻退火。與經(jīng)過(guò)Xbal/Xhol 酶切的慢病毒載體PU2-H1連接，得到能抑制內(nèi)源p53表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒PU2-p53sh775。再利用 EcoRI/BamHI 分別酶切 pUC19_p53sh775r 與 PU2_p53sh775，將 p53sh775r 通過(guò) EcoRI/ BamHI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)與PU2_p53sh775連接，得到能抑制內(nèi)源p53表達(dá)同時(shí)表達(dá)外源p53 的慢病毒質(zhì)粒 PU2-p53sh775+p53sh775r。同樣，利用 EcoRI/BamHI 分別酶切 pUC19_p53 與PU2-FH，將p53sh775通過(guò)EcoRI/BamHI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)與PU2-FH連接，得到只表達(dá)外源ex-p53的慢病毒質(zhì)粒，產(chǎn)生三種病毒p53sh775(內(nèi)源抑制)，p53(外源表達(dá))與 p53sh775+p53sh775r (內(nèi)源抑制+外源表達(dá))，分別感染U20S細(xì)胞，慢病毒的產(chǎn)生和導(dǎo)入的方法同實(shí)施例3，免疫印跡分析，結(jié)果如圖11。結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒PU2-p53sh775+p53sh775r不但能有效的抑制內(nèi)源P53的表達(dá)而且高效的表達(dá)外源p53。
權(quán)利要求
1.一種在抑制內(nèi)源靶基因表達(dá)的同時(shí)能表達(dá)外源基因的多功能慢病毒載體，所述的共表達(dá)功能由插入慢病毒載體中的表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)，所述的表達(dá)盒由TO啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn) MCSl、UbiC啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)MCS2組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能慢病毒載體，其特征在于，所述的多功能慢病毒載體具有以下各項(xiàng)結(jié)構(gòu)特征中的一種或多種，優(yōu)選具有所有以下結(jié)構(gòu)特征a)具有5’LTR-U6-MCSl-UbiC-MCS2-FH-IRES-Puro-WPRE-3’LTRU3A 的特征序列，如圖 1所示；b)5，LTR與3，LTRU3Δ為來(lái)源于FUGW質(zhì)粒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列，其中3，LTRU3 Δ缺失 U3區(qū)的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子；c)U6與 UbiC 為分別來(lái)源于 pSilencer2. 0-U6 質(zhì)粒和 pLenti6/Ubc/V5_DEST Gateway 質(zhì)粒的啟動(dòng)子；d)MCSl與MCS2為基于常用內(nèi)切酶設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)；e)FH,IRES、Puro分別為來(lái)源于pBABE-puro質(zhì)粒的標(biāo)簽蛋白編碼序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列、嘌呤霉素編碼序列；和f)WPRE為來(lái)源于FUGW質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能慢病毒載體，其特征在于a)所述多克隆位點(diǎn)MCSl用于插入抑制內(nèi)源功能缺陷型靶基因的shRNA；和b)所述多克隆位點(diǎn)MCS2用于插入外源功能野生型靶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能慢病毒載體，其特征在于a)所述多克隆位點(diǎn)MCSl用于插入抑制內(nèi)源功能野生型靶基因的shRNA；和b)所述多克隆位點(diǎn)MCS2用于插入外源功能缺陷型靶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能慢病毒載體，其特征在于a)所述多克隆位點(diǎn)MCSl用于插入抑制內(nèi)源功能野生型靶基因的shRNA；和b)所述多克隆位點(diǎn)MCS2用于插入外源功能野生型靶基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能慢病毒載體，其特征在于a)所述多克隆位點(diǎn)MCSl用于插入抑制內(nèi)源功能缺陷型靶基因的shRNA；和b)所述多克隆位點(diǎn)MCS2用于插入外源功能缺陷型靶基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多功能慢病毒載體，其特征在于在5’LTR與MCSl 之間具有Hl啟動(dòng)子，或是其他適于shRNA表達(dá)的啟動(dòng)子；在MCSl與MCS2之間具有CMV，或是其他適于目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多功能慢病毒載體，其特征在于在IRES與WPRE 之間具有潮霉素編碼序列，或是其他抗性篩選藥物基因編碼序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多功能慢病毒載體，其特征在于所針對(duì)的靶基因突變體為促細(xì)胞凋亡基因，或是細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因，或是免疫調(diào)節(jié)因子，或是其他任何影響細(xì)胞正常表型的靶基因突變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多功能慢病毒載體，其特征在于此多功能慢病毒載體具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
全文摘要
一種抑制內(nèi)源靶基因的同時(shí)能表達(dá)外源基因的多功能慢病毒載體。該載體由基因工程技術(shù)構(gòu)建而成，包含兩個(gè)啟動(dòng)子與相應(yīng)的兩個(gè)可供shRNA和基因插入的多克隆位點(diǎn)，能在利用RNA干擾技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)源基因的同時(shí)，通過(guò)外源基因的導(dǎo)入，恢復(fù)該基因的表達(dá)，從而恢復(fù)整個(gè)細(xì)胞正常的表型，該技術(shù)克服了一些在RNA技術(shù)的難點(diǎn)，如確保了RNA干擾的特異性以及高效的感染細(xì)胞并能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。從而使得基礎(chǔ)研究者更能精確的闡述靶基因在信號(hào)通路的地位，以及一些未知功能，并且該載體還可用來(lái)抑制內(nèi)源功能缺陷型靶基因而高效導(dǎo)入并穩(wěn)定表達(dá)外源功能野生型靶基因，為基因治療提供一種非常有力的工具。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102344939SQ20111020639
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者馮云峰, 彭釗, 楊寬, 楊瓊, 池振奮, 聶凌云, 聶凌虎, 趙永良 申請(qǐng)人:聶凌云