專利名稱：棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重pcr檢測方法及檢測用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和動物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、 杜氏顎口線蟲的檢測方法，具體涉及一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重 PCR檢測方法。此外，本發(fā)明還涉及用于同時檢測棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的引物。
背景技術(shù)：
顎口線蟲病是因人食入生的或未熟的含有顎口屬(toathostoma)幼蟲的淡水魚引起的人畜共患寄生蟲病。顎口線蟲屬有13個有效種，目前已報道的致病種有棘顎口線蟲(G. spinigerum)、剛刺顎口線蟲(G. hispidum)、杜氏顎口線蟲(G. doloresi)、日本顎口線蟲(G. nipponicum)、馬來顎口線蟲(G. malaysiae)和雙核顎口線蟲(G. binucleatum)，因此，對食品中檢出的顎口線蟲幼蟲蟲種的鑒別對該病的診斷與防治有重要意義。顎口線蟲種類的鑒定，傳統(tǒng)方法是以形態(tài)特征為鑒別指標(biāo)，但顎口線蟲的生活史復(fù)雜，不同發(fā)育階段形態(tài)變化較大，有些蟲種的第三期幼蟲形態(tài)相似，傳統(tǒng)形態(tài)方法很難鑒別，因而不能作為蟲種鑒別的精確指標(biāo)，且傳統(tǒng)方法也費時費力。PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，目前，該技術(shù)已逐漸應(yīng)用于寄生蟲種類的鑒別，研究的目的基因多以核糖體DNA (rDNA)為主。真核生物rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacerregion, ITS)包括ITS-I和ITS-2，進化較快，具有種間特異性和種內(nèi)保守性，是進行種間分類的極好材料，可設(shè)計特異性的引物進行擴增，并比較ITS序列的差異來鑒定形態(tài)學(xué)上難以區(qū)別的近緣種。將ITS序列用多重PCR方法來鑒別顎口線蟲蟲種， 目前國內(nèi)尚無相關(guān)報道。棘顎口線蟲、杜氏顎口線蟲、日本顎口線蟲是亞洲最常見的3種顎口線蟲致病種，本發(fā)明根據(jù)ITS-2序列，分別設(shè)計這3種顎口線蟲的特異引物，進行多重PCR 擴增，旨在建立一種快速、靈敏、可靠的鑒別顎口線蟲種類的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其不需要繁雜的形態(tài)鑒定與測序步驟，就可以同時鑒別棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲三種顎口線蟲。旨在解決顎口線蟲鑒定時耗時、成本高、工作量大等問題，也為進一步同時鑒定所有13個顎口線蟲蟲種奠定了基礎(chǔ)。該方法的建立可滿足進出口水產(chǎn)品檢疫、快速、準(zhǔn)確的要求，同時，為我國人畜共患寄生蟲病的研究與食品安全防控上提供一種新的適用方法。為此，本發(fā)明還提供用于上述方法的檢測引物。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在本發(fā)明的一方面，提供一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重 PCR檢測方法，具體步驟包括1蟲體DNA提取
2引物設(shè)計與篩選3PCR反應(yīng)條件優(yōu)化4單一 PCR擴增特異性驗證5多重PCR擴增特異性驗證6PCR敏感性驗證7臨床蟲種鑒定方法的可行性驗證步驟1中，所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲DNA提取方法為從 70%乙醇保存液中取出單個標(biāo)準(zhǔn)蟲種(3株標(biāo)準(zhǔn)蟲種已經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定)，置于 1. 5mLEppendorf 管中，按照 QIAGEN 公司 DNA 提取試劑盒(DNeasy Blood&Tissue kit) 使用說明書提取顎口線蟲基因組DNA，將提取的基因組DNA置-20°C保存?zhèn)溆?。步驟2中，所述的顎口線蟲引物設(shè)計與篩選具體為應(yīng)用DNAstar7. 1與 Primer5. 0等分子生物學(xué)軟件對顎口屬線蟲種間的ITS2基因序列進行比對分析，選擇堿基差異較大的區(qū)域，在該范圍設(shè)計棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲特異性引物。篩選確定最終實驗所用的引物，確保所設(shè)計引物能特異擴增出對應(yīng)蟲種的目標(biāo)產(chǎn)物，并且在實施多重PCR過程中，多對引物之間沒有干擾，即沒有同源、互補，不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。最終所確定的引物序列見表1。表1多重PCR引物序列
權(quán)利要求
1.一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于， 具體步驟包括如下①棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的蟲體DNA提取；②引物設(shè)計與篩選；③對步驟②所設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，得到最佳多重PCR模式；④按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進行單一PCR擴增特異性驗證；⑤按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進行多重PCR擴增特異性驗證；⑥按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進行PCR敏感性驗證；⑦按照建立的多重PCR方法對臨床蟲種鑒定方法進行可行性驗證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟①中，所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的蟲體DNA提取方法為從70%乙醇保存液中取出單個標(biāo)準(zhǔn)蟲種，采用DNA提取試劑盒提取棘顎口線蟲、 日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲基因組DNA，將提取的基因組DNA置-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟②中所述的引物設(shè)計與篩選具體為應(yīng)用分子生物學(xué)軟件對顎口屬線蟲種間的ITS2基因序列進行比對分析，選擇堿基差異較大的區(qū)域，在該范圍設(shè)計棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲特異性引物，篩選確定引物，確保所設(shè)計引物必須為特異性引物，一對引物只能擴增出相應(yīng)蟲種的序列片段，并且與其它引物之間沒有干擾，即沒有同源、互補，不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；所述設(shè)計的引物序列為棘顎口線蟲的特異性引物GS2-F 5' -GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’ (SEQ ID NO. 1)；GS4-R 5' -ACTGTATCGGCGAAGCTG-3‘ (SEQ ID NO. 2)；杜氏顎口線蟲的特異性引物GD2-F 5' -AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3，(SEQ ID NO. 3)；GD3-R 5' -TATATACGGCCGCAGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；日本顎口線蟲的特異性引物GNl-F :5，-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’ (SEQ ID NO. 5)；GN5-R 5' -TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’ (SEQ ID NO. 6)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟③中，所述的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化具體方法為選擇25 μ L的PCR反應(yīng)體系，體系包含 25mmol/L Mg2+2. 5 μ L, 10XPCR buffer 2. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 1 μ L, 5U/ μ L Taq聚合酶0. 1 μ L，DNA模板1 μ L，引物工作濃度為10 μ mol/L，根據(jù)多重PCR條帶的明亮，適當(dāng)調(diào)整步驟②的引物加入量的比例；退火溫度根據(jù)引物Tm值范圍進行51°C、53°C、 55 °C、57 °C、59 °C、61 °C退火溫度梯度試驗，最后確定最佳的多重PCR模式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR 檢測方法，其特征在于，步驟③的最佳多重PCR模式具體為最佳多重PCR反應(yīng)體系25yL 反應(yīng)體系中IOXbuffer 2. 5 μ L, Mg2+2. 5μ L, dNTP 1 μ L，杜氏顎口線蟲與日本顎口線蟲上下游引物各0. 3 μ L，棘顎口線蟲上下游引物各0. 4 μ L ;Taq聚合酶0. 1 μ L，模板DNA各 1 μ L，加滅菌雙蒸水至25 μ L ；最佳的多重PCR反應(yīng)條件為95°C 3min ；95°C 30s, 55V 30s,720C 30s, 30 個循環(huán)；72°C 5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟④中，所述的單一 PCR擴增特異性驗證具體方法為用步驟②的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的單一引物，分別對棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲、宮脂線蟲、異尖線蟲、棘口吸蟲與歐猥裂頭蚴的DNA模板，按照步驟③的最佳多重PCR模式，在同等條件下進行PCR反應(yīng)，以鑒定其特異性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑤中，所述的多重PCR擴增特異性驗證具體為同時用步驟②的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲3對引物，分別對棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲及其不同組合、宮脂線蟲、異尖線蟲、棘口吸蟲與歐猥裂頭蚴的DNA模板，按照步驟 ③的最佳多重PCR模式，在同等條件下進行PCR反應(yīng)，以鑒定其特異性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑥中，所述的PCR敏感性驗證具體為先將棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲3種標(biāo)準(zhǔn)蟲種DNA用核酸蛋白測定儀測定模板原液濃度，再以10倍連續(xù)稀釋分別將棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的DNA模板稀釋成5個濃度梯度，按步驟③的最佳多重PCR模式進行PCR擴增，測定單一 PCR和多重PCR反應(yīng)的敏感性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑦中，所述的臨床蟲種鑒定方法進行可行性驗證具體為將各地檢出的顎口線蟲蟲體，提取DNA模板，按上述建立的多重PCR方法進行擴增。
10.用于同時檢測棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的引物，其特征在于，其序列為棘顎口線蟲的特異性引物GS2-F :5，-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’ (SEQ ID NO. 1)；GS4-R 5' -ACTGTATCGGCGAAGCTG-3‘ (SEQ ID NO. 2)；杜氏顎口線蟲的特異性引物GD2-F 5' -AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO. 3)；GD3-R 5' -TATATACGGCCGCAGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；日本顎口線蟲的特異性引物GNl-F :5，-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’ (SEQ ID NO. 5)；GN5-R 5' -TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’ (SEQ ID N0. 6)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的多重PCR檢測方法，包括如下步驟首先提取顎口線蟲DNA，同時進行棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲特異引物設(shè)計。然后，對設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR模式進行實驗，驗證各引物單一PCR特異性、多重PCR特異性、PCR敏感性和臨床樣本操作的可行性。此外，本發(fā)明還公開了用于同時檢測棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲的引物序列。通過各種驗證表明本發(fā)明方法可以同時鑒定棘顎口線蟲、日本顎口線蟲、杜氏顎口線蟲，其快速、敏感、特異和同步鑒定3種顎口線蟲的特點可應(yīng)用于水產(chǎn)品顎口線蟲的鑒定和檢疫。
文檔編號C12Q1/68GK102363809SQ20111034885
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者張子群, 張強, 張鴻滿, 李健, 李樹清, 李雯雯, 王巧全, 王艷, 陳志飛, 陳韶紅, 黃維義 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局