專利名稱：擬南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高種子壽命和萌發(fā)活力中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl在提高種子壽命和萌發(fā)活力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
種子作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的根本，其壽命和活力對于植物繁殖、作物產(chǎn)量、種質(zhì)資源保存和生物多樣性起著決定性的作用。成熟的干種子即使是在合適的貯藏條件下也會劣變，其程度隨著貯藏時間的延長而加劇，并最終導(dǎo)致種子喪失活力，不能萌發(fā)。種子的劣變通常伴隨著一系列生理生化上的變化，如DNA的損傷、脂質(zhì)的過氧化和蛋白的損傷等。McDonald等認(rèn)為，種子壽命受內(nèi)在的遺傳因子和外在的環(huán)境因素共同影響。盡管對于種子壽命和活力已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但是對其確切的機(jī)理仍然不是十分清楚。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對種子質(zhì)量的另外一個判斷標(biāo)準(zhǔn)是種子在不利條件下的萌發(fā)活力，高質(zhì)量的種子即使在逆境條件下仍能夠保持高的萌發(fā)率和長出健壯的幼苗。關(guān)于種子劣變的原理，人們普遍接受的是自由基氧化學(xué)說，其中活性氧(Reactive Oxygen Species, R0S)被認(rèn)為是導(dǎo)致種子劣變的一個重要因子。ROS能夠?qū)NA、脂類和蛋白質(zhì)過氧化，使得這三類生物大分子無法正常行使其在細(xì)胞中的功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的破裂和植物組織的損傷。為了應(yīng)對由活性氧引起的氧化損傷，植物進(jìn)化出了一套完整的抗氧化系統(tǒng)，包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)?？寡趸到y(tǒng)效率的高低通常影響著種子的壽命和活力。例如，2004年，Sattler等證明維生素E對于維持種子的壽命和活力起著至關(guān)重要的作用。2008年，Oge等發(fā)現(xiàn)L型異天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶參與種子的壽命和萌發(fā)活力。而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶和抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶也被證明與種子的壽命和活力有關(guān)(Bailly等，1996，2001 ;Lee等，2010)。DNA糖苷酶(OGGl)是一類能夠?qū)NA中錯配堿基切除的蛋白質(zhì)，其參與堿基切除修復(fù)(base excision r印air，BER)過程。已有的研究表明，OGGl與動物的多種疾病和衰 ^ ; ) ^ (Jaiswal et al. , 2001; Osterod et al. , 2001; Shinmura and Yokota, 2001)。在模式植物擬南芥中，AtOGGl在種子發(fā)育后期脫水階段和種子萌發(fā)前期吸水階段表達(dá)大量上調(diào)，表明其可能跟種子成熟和萌發(fā)有很大的關(guān)系。種子脫水和吸水的過程中伴隨著大量的ROS產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷和種子的衰老，AtOGGl能夠參與BER途徑修復(fù)DNA，因此其與種子衰老也有著密切的關(guān)系。種子在逆境條件下萌發(fā)同樣會導(dǎo)致大量的ROS產(chǎn)生， 因此AtOGGl在種子萌發(fā)前期表達(dá)大量上調(diào)也與種子在不利條件下的萌發(fā)活力密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的新用途。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl具有提高種子壽命、萌發(fā)活力等功能，尤其是種子在脅迫環(huán)境如甲基紫精、高鹽、甘露醇、高溫等人工老化條件下的萌發(fā)活力。本發(fā)明主要通過制備含有擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的轉(zhuǎn)基因植物種子實(shí)現(xiàn)提高種子萌發(fā)活力的目的。具體制備方法如下
一種制備高萌發(fā)活力種子的方法，通過擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌浸染植株后培養(yǎng)，收獲的種子即為高萌發(fā)活力種子。所述擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表達(dá)載體是由AtOGGl的編碼基因插入到真核表達(dá)載體PBI121構(gòu)建而成，具體制備方法如下
(1)以擬南芥總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得cDNA作為模板，以SEQID NO:廣2所示序列為引物，擴(kuò)增Jim^基因；
(2)以擴(kuò)增的4扮你7基因?yàn)槟０?，以SEQID N0:3、所示序列為引物，擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的*·基因片段；
(3)將含酶切位點(diǎn)的Jii^W基因片段與載體pGEMT-Easy進(jìn)行連接，構(gòu)建中間載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)，培養(yǎng)后挑取單克隆測序鑒定，提取鑒定正確的克隆的質(zhì)粒，用 Sma I和fee I進(jìn)行雙酶切，回收小片段，與同樣經(jīng)過I和fee I進(jìn)行雙酶切的pBI121 載體連接，得到表達(dá)載體。本發(fā)明所述的擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的基因序列在GenBank中的登錄號為 NM-102020。根據(jù)獲得的的序列信息，設(shè)計(jì)添加了酶切位點(diǎn)5 I和I的引物， 用PCR的方法從擬南芥葉片cDNA中擴(kuò)增出4扮你7的開放讀碼框片段，然后將PCR產(chǎn)物連接入pGEMT-Easy載體，構(gòu)建中間載體pGEMT-AtOGGl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆測序鑒定。提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，用I和fee I酶切后回收小片段，連接入用同樣酶消化的PBI121載體的大片段中，從而構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-At0GGl。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆測序鑒定。提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥(Cb/O。通過卡那霉素篩選和葉片PCR 鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因的陽性植株。繼續(xù)培養(yǎng)直到獲得T3代的轉(zhuǎn)基因純合子。利用Real-time PCR和Wfestern Blot證明J扮你7基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中RNA水平和蛋白水平上都得到了大量表達(dá)。將擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl在水稻、小麥、玉米或大豆等多種農(nóng)作物中高表達(dá)，有望提高作物種子的對損傷DNA的修復(fù)功能，并進(jìn)一步提高種子的質(zhì)量，本發(fā)明實(shí)施例以擬南芥CWY的種子為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行研究，以證明其功能。將篩選出的轉(zhuǎn)基因種子和野生型種子，經(jīng)過人工老化處理后，進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終萌發(fā)率都遠(yuǎn)高于野生型種子，轉(zhuǎn)基因幼苗的生長狀況明顯好于野生型幼苗。上述結(jié)果表明Jii^似具有提高植物種子壽命和活力的能力。 將轉(zhuǎn)基因和野生型種子在含有不同濃度的逆境脅迫因子(5- 200 μ M甲基紫精、75- 200 mM氯化鈉和150- 600 mM甘露醇)的1/2 MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終萌發(fā)率都明顯高于對照的野生型種子，表明Jii^W能提高植物種子在逆境 (甲基紫精、高鹽、甘露醇)脅迫下的萌發(fā)活力。將轉(zhuǎn)基因和野生型種子經(jīng)過50°C高溫處理后在1/2 MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終萌發(fā)率都明顯高于對照的野生型種子，表明Jii^似能提高植物種子在高溫脅迫下的萌發(fā)活力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
4(1)證實(shí)了擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl能提高植物種子的壽命和在逆境(甲基紫精、高鹽、甘露醇)脅迫下的萌發(fā)活力。(2)將似·轉(zhuǎn)入到水稻、小麥、玉米和大豆等重要農(nóng)作物中，則可提高重要農(nóng)作物種子的貯藏壽命和活力。⑶AtOGGl的應(yīng)用可降低全球每年因?yàn)榉N子劣變和逆境(甲基紫精、高鹽、甘露醇、 高溫)脅迫而造成的巨大農(nóng)業(yè)損失，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。


圖1是植物表達(dá)載體pBI121-At0GGl的示圖，RB 右邊界，LB 左邊界。圖2是轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的Real-time PCR和flfestern Blot檢測結(jié)果以及 8-oxo-dG含量測定結(jié)果，wt為野生型，OE-U 0E-2、0E-3分別是三個不同的轉(zhuǎn)基因株系；A 為Real-time PCR的檢測結(jié)果；B為flfestern Blot的檢測結(jié)果，35kD是分子量大小，KD 千道爾頓，CBB 考馬斯亮藍(lán)染色)；C為8-oxo-dG含量測定結(jié)果。圖3是人工老化處理1-7天的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子后的萌發(fā)結(jié)果和老化5 天后干種子和吸水24h的種子中8-oxo-dG含量測定結(jié)果圖。A為人工老化處理1-7天后的種子播種后第7天的萌發(fā)結(jié)果，橫坐標(biāo)是老化處理天數(shù)，縱坐標(biāo)是播種后第7天的萌發(fā)率。
表示野生型，·■▲表示不同的轉(zhuǎn)基因株系；B為老化5天后干種子和吸水24h的種子中 8-oxo-dG含量測定，黑色矩形表示干種子，白色矩形表示吸水24h的種子。圖4是人工老化處理5天后野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子后的幼苗生長圖。Wt表示野生型。0Ε-1、0Ε-2、0Ε-3分別是三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。圖5是不同逆境處理?xiàng)l件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)結(jié)果圖。A為甲基紫精處理后的種子播種后第8天的萌發(fā)結(jié)果；B為氯化鈉處理后的種子播種后第8天的萌發(fā)結(jié)果橫坐標(biāo)是老化處；C為甘露醇處理后的種子播種后第8天的萌發(fā)結(jié)果；D為5(T52°C高溫處理后的種子播種后第8天的萌發(fā)結(jié)果。橫坐標(biāo)是不同的逆境濃度，縱坐標(biāo)是播種后第 8天后的萌發(fā)率。 表示野生型，··▲表示不同的轉(zhuǎn)基因株系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1擬南芥DNA糖苷酶蛋白基因Jii^似基因全長cDNA的克隆 (1)擬南芥葉片的準(zhǔn)備野生型擬南芥種子萌發(fā)2周后，收集葉片。(2)總RNA的提取采用hvitrogen公司的Trizol產(chǎn)品提取總RNA。(3)獲得 cDNA 采用 Takara 公司的 Primekript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書步驟反轉(zhuǎn)錄(2)中的RNA以獲得cDNA。(4)獲得基因全長cDNA 以獲得的cDNA為模板，根據(jù)GenBank (登錄號為 NM-102020)公布的序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得4扮你7基因，測序確認(rèn)。PCR引物如下
正向引物:SEQ ID N0:1 5' - ACGGCGATGAAGAGACCTCGACCT- 3，； 反向引物:SEQ ID NO:2 5' - AATAACTACGCTCATTTGCCAGGG-3，。實(shí)施例2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)基因片段的克隆
以實(shí)施例1所述的擬南芥Jii^W基因全長cDNA為模板，通過PCR克隆得到添加了酶切位點(diǎn)5 I和fee I的PCR片段。PCR引物如下，下劃線部分為酶切位點(diǎn) 正向引物SEQ ID N0:3 :5，-TCCCCCGGGATGAAGAGACCTCGACCTAC-3‘； 反向引物SEQ ID N0:4 :5，-CGAGCTCTCATGGCTTCAACGTATCAC-3’。PCR反應(yīng)體系為1基因，5 μ L dNTP(2. 5 mM),2 μ L MgCl2 1. 5 μ L 正向引物(10 μΜ)，1·5 PL 反向引物(10 μ Μ),5 μ L 10XPCR 緩沖液，1 μ L KOD plus 酶(Τ0Υ0Β0公司產(chǎn)品)，最后補(bǔ)充去離子水，使總體系為50 UL0 PCR的反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘；然后進(jìn)入如下循環(huán)94°C 30秒，60°C 45秒，72°C 70秒，共觀個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。(2) T載體連接
取2 μ L PCR產(chǎn)物與pGEMT-Easy載體進(jìn)行連接，按照Promega公司的說明書步驟進(jìn)行操作，構(gòu)建中間載體pGEMT-AtOGGl。(3)大腸桿菌轉(zhuǎn)化
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)(天根公司產(chǎn)品)，按照天根公司的產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。在含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素(100 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上涂板，37°C過夜培養(yǎng)后，挑取白色單菌落，在含有氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中生長，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定。(4)細(xì)菌質(zhì)粒DNA的制備
收集上述LB液體培養(yǎng)基中的菌體，按照天根公司的質(zhì)粒小提試劑盒說明書制備細(xì)菌質(zhì)粒DNA，酶切和測序鑒定。測序由廣州hvitrogen公司完成。(5)表達(dá)載體構(gòu)建
提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，按照iTakara公司的產(chǎn)品說明書，用5 I和fee I進(jìn)行雙酶切，然后回收小片段，連接入用同樣酶消化的PBI121載體大片段中，構(gòu)建植物表達(dá)載體 pBI121-At0GGl，示圖如圖1所示。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，進(jìn)行PCR、 酶切和測序鑒定。(6)根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，通過電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105。實(shí)施例3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 1.擬南芥轉(zhuǎn)化前處理
當(dāng)擬南芥主苔長至5飛cm時，在花序基部剪掉整個花序，去其頂端優(yōu)勢，1周后在腋芽部位長出4飛個新生側(cè)苔，待其側(cè)苔花序形成花蕾并部分開花或形成廣2個角果時，即可用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前需剪去已長成的角果。轉(zhuǎn)化的前一天給植物澆足水分，并罩一個塑料袋以保持高濕環(huán)境。2.浸染培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
用于浸泡擬南芥花絮的浸染培養(yǎng)基成分為含5% (質(zhì)量)蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，pH=5. 8 (用IM KOH調(diào)節(jié))，高壓滅菌。用時添加0.02 °Γθ. 05 % (質(zhì)量)表面活性劑Silwet L-77， 搖勻。3.農(nóng)桿菌準(zhǔn)備及擬南芥轉(zhuǎn)化
(1)菌種的活化將儲存的農(nóng)桿菌液或平板保存的農(nóng)桿菌在含卡那霉素(Km，100 mg/L )和利福平(Rif，30 mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上劃板活化，并進(jìn)行PCR檢測。
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(2)挑取活化的含目的基因的單克隆陽性農(nóng)桿菌至5 mL新鮮含卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，280C，180 rpm搖動培養(yǎng)M小時。(3)取上述菌液5 mL (1°/Γ2%)接至500 mL新鮮含卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，280C，180 rpm培養(yǎng)18 24小時，使OD600值達(dá)到0. 8左右(用YEB+Rif+Km作為空白對照)。(4)將上述菌液分裝到100 mL離心管中，室溫，5000 rpm離心20分鐘收集菌體。(5)將收集的菌體懸浮在浸染培養(yǎng)基中，使最終菌體適宜濃度0D_值大約為 0. 8^1 (用浸染培養(yǎng)基作對照)。(6)將上述浸染液倒在燒杯中，將待轉(zhuǎn)化的植物迅速倒扣在浸染液中，使花序浸沒 60秒鐘后取出。操作時盡量小心，不要讓土屑等掉入到浸染培養(yǎng)基中。(7)轉(zhuǎn)化后用吸水紙吸去過多的菌液，但不需要吸得太干。將植株平放，并用黑色塑料袋罩住擬南芥地上部分。保濕暗培養(yǎng)16 24h后，小心去掉塑料袋，并澆足水，恢復(fù)正常光照。(8)為了提高轉(zhuǎn)化率，在一周以后重復(fù)一次浸染過程。(9)正常管理，收獲成熟種子。收獲后的種子在含有50 mg/L的卡那霉素和150 mg/L的羧芐青霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因種子的Real-time PCR檢測
(1)總RNA的提取按照百泰克公司的植物通用RNA提取試劑盒說明書步驟提取野生型和不同的轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥干種子總RNA。(2)第一鏈 cDNA 的合成按照 Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書步驟操作。(3) Real-time PCR 反應(yīng) AtOGGl基因特異引物
正向引物SEQ ID NO:5 :5' -TACAGAGCCAAATACATA ACAG-3‘； 反向引物SEQ ID N0:6 5' -TGCTACCTTCGGACCAAC-3‘。內(nèi)參1 tin2基因引物
正向引物SEQ ID NO:7 :5' -ATTACCCGATGGGCAAGTCA-3‘； 反向引物SEQ ID NO:8 :5' -TGCTCATACGGTCAGCGATA-3‘。Real-time PCR的反應(yīng)體系為1 μ L稀釋30倍的第一鏈cDNA模板，IOyL SYBR Green ΜΙΧ(Τ0Υ0Β0 公司)，0. 4 yL 正向引物(10 μΜ)，0·4 yL 反向引物(10 μΜ)，最后補(bǔ)充去離子水，使總體系為20 UL0 PCR反應(yīng)條件為95°C 5分鐘，然后進(jìn)入如下循環(huán)94°C 10秒，58°C 10秒，72°C 20秒，共40個循環(huán)。Real-time PCR反應(yīng)共做3次生物重復(fù)，每個生物重復(fù)包含3次技術(shù)重復(fù)(/ =9)。以肌動蛋白2 (IiiM)為內(nèi)參。Real-time PCR的結(jié)果如圖2A所示，在3個不同的轉(zhuǎn)基因株系種子中都能檢測到4扮你7基因的表達(dá)相對于野生型擬南芥種子中有大幅度上升。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因種子的Wfestern Blot檢測
(1)原核表達(dá)以實(shí)施例2所述的中間載體pGEMT-AtOGGl為模板，通過PCR克隆得到添加了酶切位點(diǎn)&oR I和Xho I的PCR片段。PCR引物如下，下劃線部分為酶切位點(diǎn) 正向引物SEQ ID NO:9 :5' -CCGGAATTCATGAAGAGACCTCGACCTAC-3‘；反向引物SEQ ID NO: 10:5' - CCGCTCGAGTCATGGCTTCAACGTATCAC-3‘。PCR反應(yīng)體系為1基因，5 μ L dNTP(2. 5 mM),2 μ L MgCl2 1. 5 μ L 正向引物(10 μ Μ), 1.5 yL 反向引物(10 μ Μ),5 μ L 10XPCR 緩沖液，1 yL KOD plus 酶 (TOYOBO公司產(chǎn)品)，最后補(bǔ)充去離子水，使總體系為50 μ L0 PCR反應(yīng)程序94°C 5分鐘； 然后進(jìn)入如下循環(huán)94°C 30秒，60°C 45秒，72°C 70秒，共觀個循環(huán)；最后72°C延伸10 分鐘。純化后的PCR產(chǎn)物用I和Xho I酶切后，回收，連接入用同樣酶消化的pET-14b (Novagen公司產(chǎn)品大片段)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體6His_At0GGl。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定，方法與實(shí)施例2相同。蛋白的純化按照Novagen公司的 His bind purification kit 說明書進(jìn)行。(2)抗體制備上述純化后的蛋白用于注射兔子制備特異性抗體anti-AtOGGl。(3)蛋白提取野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的蛋白提取參照Fan等(1997) (1997， Antisense suppression of phospholipase D [alpha] retards abscisic acid [mdash] and ethylene-promoted senescence of postharvest arabidopsis Leaves. The Plant Cell Online 9: 2183)的方法。(4)Western Blot :免疫印記參照Mizzen等(1996)(Mizzen, C.A.,et al. , 1996， Sensitive detection of metallothioneins—l, _2 and _3 in tissue homogenates by immunoblotting: a method for enhanced membrane transfer and retention. J. Biochem. Bioph. Meth. 32: 77-83)的方法。Western Blot 的結(jié)果如圖 2B 所示，在三個不同的轉(zhuǎn)基因株系種子中都能檢測到AtOGGl蛋白的含量的表達(dá)相對于野生型擬南芥種子中有大幅度上升。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)人工老化處理后的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
(1)人工老化是在密閉容器中完成的。利用不同飽和鹽溶液在不同溫度條件下能夠使密閉容器的空氣保持固定的相對濕度的原理來進(jìn)行老化處理。分別配制飽和的KCl和MgCl2 溶液，將含有1 L體積的過飽和的MgCl2溶液放置于2. 5 L體積的密閉容器中，然后將密閉容器放置于20°C (相對濕度33%)的培養(yǎng)箱中，平衡2天備用；將含有1 L體積的過飽和的 KCl溶液放置于2. 5 L體積的密閉容器中，然后將密閉容器放置在15°C (相對濕度85%)和 400C (相對濕度82%)的培養(yǎng)箱中備用，平衡2天。(2)將野生型和轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子用1. 5 mL的去掉蓋子的離心管裝好后(每管大約120粒)放置于離心管架上后迅速放入在15°C培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡好的含有KCl過飽和溶液的密閉容器中，平衡三天，使所有種子的含水量達(dá)到一致。(3) 3天后，將平衡好的擬南芥種子取出，迅速放入在40°C培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡好的含有KCl過飽和溶液的密閉容器中，處理廣7天。(4)處理完成后，將擬南芥種子取出，迅速放入在20°C培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡好的含有 MgCl2過飽和溶液的密閉容器中，平衡3天。(5 天后，取出擬南芥種子并馬上進(jìn)行消毒滅菌，4°C層積處理兩天后進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率及對幼苗的生長情況進(jìn)行拍照。(6)人工老化后的種子萌發(fā)結(jié)果如圖3所示，從老化2天后開始至老化7天的時間中轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終的萌發(fā)率都遠(yuǎn)高于野生型的種子。老化5天后的種子在播種后第7天，野生型種子的萌發(fā)率僅為27%，而轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率高達(dá)6(Γ75%。播種10天后的幼苗的生長情況如圖4所示，轉(zhuǎn)基因幼苗的子葉展開率和幼苗大小要明顯好于野生型，表明過量表達(dá)基因能提高種子的壽命和活力。
實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因種子的逆境脅迫萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在消毒滅菌后，放置于4°C層積處理兩天。然后播種于含有不同濃度的逆境脅迫因子(5- 200 μ M甲基紫精、75- 200 mM氯化鈉和150- 600 mM甘露醇)的1/2 MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)。統(tǒng)計(jì)每一天種子的萌發(fā)率，共計(jì)8天。將轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥干種子直接放置于50°C的水中處理30分鐘后播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)統(tǒng)計(jì)每一天種子的萌發(fā)率，共計(jì)8天。情況如圖5所示，轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終的萌發(fā)率都遠(yuǎn)高于野生型的種子，表明過量表達(dá)基因能提高種子在多種逆境脅迫下萌發(fā)的活力。
權(quán)利要求
1.擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl在提高種子壽命和萌發(fā)活力中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl提高擬南芥種子在脅迫環(huán)境下的萌發(fā)活力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述脅迫環(huán)境為人工老化環(huán)境。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述人工老化環(huán)境為甲基紫精、鹽、甘露醇和/或最高52°C的高溫脅迫環(huán)境。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于是通過制備含有擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl 的轉(zhuǎn)基因植物種子實(shí)現(xiàn)提高種子萌發(fā)活力的目的。
6.一種制備高萌發(fā)活力種子的方法，其特征在于通過擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌浸染植株后培養(yǎng)，收獲的種子即為高萌發(fā)活力種子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備高萌發(fā)活力種子的方法，其特征在于所述擬南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表達(dá)載體制備方法如下(1)以擬南芥總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得cDNA作為模板，以SEQID NO:廣2所示序列為引物，擴(kuò)增Jim^基因；(2)以擴(kuò)增的4扮你7基因?yàn)槟０?，以SEQID N0:3、所示序列為引物，擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的*·基因片段；(3)將含酶切位點(diǎn)的Jii^W基因片段與載體pGEMT-Easy進(jìn)行連接，構(gòu)建中間載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)，培養(yǎng)后挑取單克隆測序鑒定，提取鑒定正確的克隆的質(zhì)粒，用 Sma I和fee I進(jìn)行雙酶切，回收小片段，與同樣經(jīng)過I和fee I進(jìn)行雙酶切的pBI121 載體連接，得到表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備高萌發(fā)活力種子的方法，其特征在于所述根癌農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述種子為水稻、小麥、玉米、大豆或擬南 Jt Col-O的種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了擬南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高種子壽命和萌發(fā)活力中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過構(gòu)建AtOGG1的植物表達(dá)表達(dá)載體，制備含有AtOGG1的轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子比野生型擬南芥種子具有更強(qiáng)的抵抗人工老化的能力和甲基紫精、鹽、甘露醇和高溫脅迫下的萌發(fā)活力。將AtOGG1轉(zhuǎn)入到水稻、小麥、玉米和大豆等重要農(nóng)作物中，也可能提高重要農(nóng)作物種子的貯藏壽命和活力。AtOGG1的應(yīng)用可降低全球每年因?yàn)榉N子劣變和多種逆境(氧化、鹽、干旱和高溫)脅迫而造成的巨大農(nóng)業(yè)損失，在植物品種選育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N15/66GK102533815SQ20121000309
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者陳虎輝, 黃上志 申請人:中山大學(xué)