專利名稱：一種產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑的制備方法，適用于功能性酸奶及益生菌制劑等發(fā)酵乳制品干粉發(fā)酵劑的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
開菲爾是以牛乳或羊乳為原料，添加含有乳酸菌和酵母菌的開菲爾粒發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵釀制而成的一種傳統(tǒng)酒精發(fā)酵乳飲料。目前工業(yè)化生產(chǎn)的開菲爾乳品是以牛乳為原料，利用從開菲爾粒(又稱藏靈菇)中分離的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行發(fā)酵制得。開菲爾起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，當(dāng)?shù)啬撩駥⑴Ｈ榛蛏窖蛉樽⑷胙蚱た诖?jīng)自然發(fā)酵生產(chǎn)酸乳酒，其殘留物再補加牛乳或山羊乳繼續(xù)發(fā)酵，經(jīng)長期發(fā)酵后在皮口袋中形成不規(guī)則顆粒狀物體， 即為開菲爾粒。此后人們便直接將開菲爾粒添加到牛乳中，使之發(fā)酵成具有爽快酸味和起泡性的保健飲料，即為開菲爾。開菲爾乳品中含有消化吸收效果好的乳蛋白質(zhì)和乳脂肪，其中有益菌群將牛乳中的乳糖大部分水解為對人體有益的L (+)-乳酸，只生成極少量的D (-)-乳酸。據(jù)測定，開菲爾中D(-)_乳酸的含量僅為2% 5%，遠(yuǎn)低于普通酸奶的25% 60%，故開菲爾乳品適于乳糖不耐癥者飲用。同時，開菲爾中的L(+)_乳酸可改善人體對鈣、磷、鐵的吸收，且可提高人體中B族維生素(VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸、尼克酸等)的含量。一些研究證實，開菲爾乳品具有較好的降血脂和降血糖的功效，并對結(jié)核病具有治療效果。此外，開菲爾乳品中含有抑制癌細(xì)胞增殖的莢膜多糖和溶解癌細(xì)胞的四碳二羧酸，可降低癌癥的發(fā)病率。同時還有降低血清膽固醇含量，增強肝臟功能，提高機(jī)體免疫力和抗衰老作用。開菲爾粒中的活菌對結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等病原菌均有強烈的抑制作用。乳酸菌是開菲爾粒中含量最多、最具活力的一部分菌群，屬于益生菌，主要存在于人體腸道。當(dāng)其在人體腸道中達(dá)到一定數(shù)量時，能夠改善或調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡。乳酸菌的代謝產(chǎn)物可以降低腸道內(nèi)的PH，抑制腸道中的腐敗菌生長和減弱腐敗菌在腸道的產(chǎn)毒作用，并有助于幫助消化，預(yù)防便秘，防止細(xì)胞老化，增強機(jī)體免疫力，降低血清膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等。早在1963年人們就證實攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇含量的功效。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者對乳酸菌降膽固醇作用機(jī)理的研究尚存在不同觀點，主要集中于以下三點1.乳酸菌菌體細(xì)胞直接吸收同化膽固醇；2.乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結(jié)合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；3.其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。本發(fā)明所用干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx作為益生菌， 可在生長代謝過程中產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解酶，經(jīng)過體外牛津杯試驗和動物實驗證明有降低機(jī)體血清膽固醇含量的功效。目前，國內(nèi)申請各種發(fā)酵劑制備方法的專利較多，如天津科技大學(xué)肖冬光和汪建明申請的“益生乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法及其在新鮮干酪中的應(yīng)用”(CN1560231)是制備直接添加于酸奶、干酪等發(fā)酵乳制品中的益生乳酸菌發(fā)酵劑；哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司張柏林和吳榮榮申請的“德氏乳桿菌保加利亞亞種酸奶或發(fā)酵乳干粉發(fā)酵劑”(CN1628528)是利用單一的德氏乳桿菌保加利亞亞種制備用于酸奶或其他發(fā)酵乳生產(chǎn)的發(fā)酵劑；陜西師范大學(xué)張富新和雷長鵬申請的“羊奶酸奶專用發(fā)酵劑的制備方法”(CN102113556A)是利用從商品牛奶酸奶中分離所得的乳酸菌制備羊奶酸奶專用發(fā)酵劑。但關(guān)于利用分離篩選自藏靈菇的產(chǎn)膽鹽水解酶的乳酸菌，利用自動發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)， 并制備干粉發(fā)酵劑的方法未見國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株產(chǎn)膽鹽水解酶的菌種制備干粉發(fā)酵劑的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的所述方法中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) KLl,乳酸乳球菌乳亞種 (Lactococcus lactis subsp. lactis)KS4，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) Tx三株菌種，均分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)，并已于 2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號分別為CGMCCNo. 1809 (菌株 KLl)，CGMCCNo. 1807 (菌株 KS4)和 CGMCCNo. 1810 (菌株 Tx)。 所述方法中，在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上，干酪乳桿菌KLl菌株的菌落大小為2 3mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，半透明， 菌落周圍有溶解CaCO3的透明圈，菌落有較高黏性；個體形態(tài)呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時菌體呈球形，G+無芽孢桿菌；乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx菌株的菌落大小為I 2_，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解 CaCO3的透明圈，菌落有較高黏性。個體形態(tài)呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，G+兼性厭氧菌。干酪乳桿菌KLl、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx作為益生菌，均可在生長代謝過程中產(chǎn)生膽鹽水解酶。所述方法中，菌種所用培養(yǎng)基均為市售蒙牛純牛奶，并于115°C滅菌15min。所述方法中，以2% (V/V)的接種量將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的干酪乳桿菌KLl，乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株菌種分別接種于裝有IOmL滅菌牛奶的試管中，37°C培養(yǎng)12h至牛乳凝固，得到活化后的菌種。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以3%的接種量將三株活化后的菌種分別接種于裝有IOOmL滅菌牛奶的三角瓶中，37°C培養(yǎng)12h至牛乳凝固，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將2000mL蒙牛純牛奶加入5L自動發(fā)酵罐， 并加入5% (即IOOmL)新鮮胡蘿卜原汁作為生長因子，利用發(fā)酵罐于115°C滅菌15min，滅菌后利用冷水機(jī)將發(fā)酵罐中的牛奶冷卻至培養(yǎng)溫度。將KL1、KS4和Tx三株菌種擴(kuò)大培養(yǎng)液以3 : I : 2的比例接種于發(fā)酵罐內(nèi)，總接種量為4%，利用發(fā)酵罐自動控溫系統(tǒng)維持培養(yǎng)溫度為40°C，培養(yǎng)過程中流加濃度為10%的滅菌Na2CO3溶液，以維持培養(yǎng)液pH6. 5，設(shè)置攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為50r/min，培養(yǎng)時間6h，得到液體發(fā)酵劑。所述方法中，上述5L發(fā)酵罐由上海高機(jī)生物工程有限公司生產(chǎn)，其型號為 BI0F6005GBN。上述新鮮胡蘿卜原汁為將市售新鮮胡蘿卜去皮、煮熟，用九陽牌食物料理機(jī)直接榨汁所得。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將2000mL液體發(fā)酵劑于4°C、8000r/min條件下離心lOmin，收集得到菌泥。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將收集的菌泥平均加入2只盛有IOOmL滅菌乳的600mL凍干瓶中，加入2. 5%甘油(V/V)、2. 5%谷氨酸鈉(W/V)和2. 5%脫脂奶粉(伊利牌)的凍干保護(hù)劑，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑。將濃縮發(fā)酵劑于-30°C預(yù)凍13h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍發(fā)酵劑。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用6L LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)(美國) 將預(yù)凍發(fā)酵劑于凍干溫度_55°C、真空度O. 16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干發(fā)酵劑。所述方法中，所得產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑活菌數(shù)可達(dá)101(lCfU/g以上，菌種存活率可達(dá)70%以上。干粉發(fā)酵劑發(fā)酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠細(xì)膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風(fēng)味。上述方法得到的產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑的制備方法屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
具體實施例方式下述實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量對體積的百分含量。實施例I、產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑的制備方法I、活化將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株菌種分別以2% (V/V)的接種量接種于IOmL滅菌牛奶中，37°C培養(yǎng)至牛乳凝固。如此傳代培養(yǎng)3次得到活化后的菌種。2、擴(kuò)大培養(yǎng)將上述活化后的菌株KLl、KS4和Tx以3 %的接種量分別接種于裝有IOOmL滅菌牛奶的三角瓶中，37°C培養(yǎng)12h至牛乳凝固，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。3、高密度培養(yǎng)將2000mL蒙牛純牛奶加入5L自動發(fā)酵罐，按表I加入不同組合的生長因子，利用發(fā)酵罐于115°C滅菌15min，滅菌后利用冷水機(jī)將發(fā)酵罐內(nèi)的牛奶冷卻至培養(yǎng)溫度。將KU、 KS4和Tx三株菌種以3 I 2的比例接種于發(fā)酵罐內(nèi)，總接種量為4% (即80mL)，利用發(fā)酵罐控溫系統(tǒng)維持培養(yǎng)溫度為40°C，按表2流加濃度為10%的滅菌Na2CO3溶液，以維持一定的培養(yǎng)液PH，設(shè)置攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為50r/min，培養(yǎng)時間6h，得到液體發(fā)酵劑。采用平板菌落計數(shù)法測定活菌數(shù)。表I不同生長因子對發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響
權(quán)利要求
1. 一種利用菌株KLl CGMCCNo. 1809為干釀乳桿菌菌(Lactobacillus casei),菌株 KS4 CGMCCNo. 1807 為乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp. Iacti),菌株 Tx CGMCCNo. 1810為嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)三種產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌制備干粉發(fā)酵劑的方法，其特征在于將菌株KL1、KS4和Tx分別于接種量2% (V/V)，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間12h的條件下進(jìn)行活化，得到活化菌種；將活化菌種于接種量3%，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間12h的條件下分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液；將KLU KS4和Tx 菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液按3 I 2的比例接種于蒙牛純牛奶中，總接種量為4%，并按純牛奶體積5%的量加入新鮮胡蘿卜原汁作為生長因子，利用5L自動發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌和高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)液pH6. 5，攪拌轉(zhuǎn)速50r/min，培養(yǎng)時間6h，得到液體發(fā)酵劑；將液體發(fā)酵劑于4°C、8000r/mmin離心IOmin,棄掉上清液，收集得到菌泥；按離心前發(fā)酵劑1/10 體積的量，取滅菌牛奶作為凍干基質(zhì)，分裝于600mL的凍干瓶中，將離心收集后的菌泥置于凍干基質(zhì)中，加入2. 5%甘油(V/V)、2. 5%谷氨酸鈉(W/V)和2. 5%脫脂奶粉(W/V)的凍干保護(hù)劑，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑；將每個凍干瓶裝量為IOOmL的濃縮發(fā)酵劑于_30°C 預(yù)凍13h至凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍發(fā)酵劑；利用美國產(chǎn)6L LABC0NC0真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍發(fā)酵劑于凍干溫度_55°C、真空度O. 16mBar條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑的制備方法，適用于功能性酸奶及益生菌制劑等發(fā)酵乳制品干粉發(fā)酵劑的生產(chǎn)。本發(fā)明利用篩選自藏靈菇的干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株產(chǎn)膽鹽水解酶的菌種，經(jīng)過活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，利用自動發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)，再經(jīng)離心濃縮和加入凍干保護(hù)劑，預(yù)凍和凍干，制備產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌干粉發(fā)酵劑。本發(fā)明優(yōu)化高密度培養(yǎng)、預(yù)凍和凍干條件，使菌種存活率達(dá)到70％以上，且干粉發(fā)酵劑活菌數(shù)可達(dá)1010cfu/g以上。本發(fā)明制備的干粉發(fā)酵劑發(fā)酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠細(xì)膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風(fēng)味。
文檔編號C12R1/46GK102586137SQ20121000553
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者劉慧 , 張紅星, 熊利霞, 謝遠(yuǎn)紅, 賈慧, 鐘思瓊, 高秀芝 申請人:北京農(nóng)學(xué)院