專利名稱：一種黃色短桿菌及其應(yīng)用及發(fā)酵制備賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)(該菌株于2011年10 月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為 CGMCC)，保藏編號為CGMCC5341)及其應(yīng)用，以及采用該黃色短桿菌作為發(fā)酵菌種發(fā)酵制備賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
賴氨酸是人和動(dòng)物營養(yǎng)的八種必需氨基酸之一。它對調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高體內(nèi)對谷類蛋白質(zhì)的吸收、改善人類膳食營養(yǎng)和動(dòng)物營養(yǎng)、促進(jìn)生長發(fā)育均有重要作用。目前主要用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)，從消費(fèi)結(jié)構(gòu)上看，賴氨酸在飼料中的消費(fèi)占了近90%，而在食品及醫(yī)藥中間體的消費(fèi)僅占10%。賴氨酸多是通過微生物發(fā)酵來制備，一般通過將賴氨酸發(fā)酵菌種在種子罐培養(yǎng)后接種至發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)生賴氨酸，黃色短桿菌是一種常用的賴氨酸發(fā)酵菌種。為了提高賴氨酸的生產(chǎn)能力，進(jìn)行菌株改良，開發(fā)具有高產(chǎn)率的菌株是重點(diǎn)的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提高發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸的生產(chǎn)能力，提供一種新的黃色短桿菌及采用該黃色短桿菌作為發(fā)酵菌種發(fā)酵制備賴氨酸的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種黃色短桿菌，其特征在于，所述黃色短桿菌的保藏編號為CGMCC5341。另一方面，本發(fā)明提供了一種如上所述的黃色短桿菌在發(fā)酵制備賴氨酸中的應(yīng)用。第三方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備賴氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成賴氨酸的條件下，將如權(quán)利要求1所述的黃色短桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明提供的黃色短桿菌，保藏編號為CGMCC5341，采用該黃色短桿菌作為發(fā)酵菌種發(fā)酵制備賴氨酸，可提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式
部分予以詳細(xì)說明。生物保藏本發(fā)明的菌株被命名為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，并于2011年10 月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為 CGMCC)，保藏編號為 CGMCC5;341。
具體實(shí)施例方式
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以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。一方面，本發(fā)明提供了一種黃色短桿菌，該黃色短桿菌的保藏編號為CGMCC5341。將該黃色短桿菌在30-32°C下，在固體培養(yǎng)基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)M_30h，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn) 該菌株在瓊脂培養(yǎng)基上形成1. 0-1. 4mm厚的菌膜，細(xì)胞短桿近球形，不形成孢子，無鞭毛， 不運(yùn)動(dòng)。該菌株最適生長溫度為25-32°C，革蘭氏染色陽性，G+，在水中為均勻懸浮液，菌落圓形，奶油色，邊緣光滑，菌落產(chǎn)生非水溶性黃色素。本發(fā)明中的黃色短桿菌菌株是通過將黃色短桿菌FB21 (購自江南大學(xué))作為出發(fā)菌株，經(jīng)N+注入誘變技術(shù)得到的。該N+注入誘變技術(shù)是將培養(yǎng)24h后的出發(fā)菌株用0. 85%生理鹽水從培養(yǎng)基上洗脫下來，用生理鹽水適當(dāng)稀釋至菌懸液濃度約IO8-IO9個(gè)/mL。取適量菌懸液涂布于滅菌冷卻后的載玻片上，以在顯微鏡下觀察無相互重疊的細(xì)胞為宜。自然干燥后立即進(jìn)行N+注入。將制得的樣品載片置于離子注入機(jī)載臺(tái)上進(jìn)行N+注入誘變。注入能量為20kev，劑量為0.01-3. OX IOw個(gè)離子/s，注入靶室的真空度為10_3Pa，離子束流量為1mA。N+注入后立即將載玻片在無菌操作下從平皿中取出，放入裝有IOmL無菌水的搖瓶中，在130rpm/min的搖瓶機(jī)上搖洗20min，適當(dāng)稀釋后涂布于固體培養(yǎng)基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的瓊脂培養(yǎng)基)上，31°C培養(yǎng)40-4 ,挑取單菌落，在無菌條件下將其轉(zhuǎn)接入固體培養(yǎng)基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和 0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的瓊脂培養(yǎng)基)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，32°C培養(yǎng)40-4他。對獲得的菌株進(jìn)行搖瓶和小試篩選，最后獲得一株黃色短桿菌菌株，即本發(fā)明的黃色短桿菌，保藏編號為CGMCC5341。另一方面，本發(fā)明提供了一種如上所述的黃色短桿菌在發(fā)酵制備賴氨酸中的應(yīng)用。第三方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備賴氨酸的方法，所述方法包括在生成賴氨酸的條件下，將如上所述的黃色短桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發(fā)酵液也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培養(yǎng)基(該液體培養(yǎng)基也即本發(fā)明中所稱發(fā)酵培養(yǎng)基)，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物。發(fā)酵過程就其本質(zhì)來說是由微生物參與的生物化學(xué)反應(yīng)過程，因此微生物細(xì)胞的數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對產(chǎn)物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是菌體濃度過高會(huì)產(chǎn)生其他影響，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，如有毒物質(zhì)的積累等，這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，本發(fā)明中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黃色短桿菌的接種量優(yōu)選為12-18體積％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，黃色短桿菌在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前，采用常規(guī)方法將黃色短桿菌經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，然后再將菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、( (optical density)值測定對黃色短桿菌的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、測定OD值達(dá)到0. 95以上時(shí)停止培養(yǎng)，將此時(shí)種子罐中的種子液稱為成熟種子液，然后再將成熟種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明中，黃色短桿菌的接種量優(yōu)選為12-18體積％，指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體積的12-18%。由于黃色短桿菌個(gè)體微小，數(shù)量不易統(tǒng)計(jì)，而種子液的OD值為被測種子液吸收的光密度，可以反映種子液中黃色短桿菌的數(shù)量，因此，本領(lǐng)域中一般均采用OD值來表示種子液中黃色短桿菌的數(shù)量，本發(fā)明也沿用本領(lǐng)域的采用OD值來表示種子液中黃色短桿菌的數(shù)量的習(xí)慣。且本發(fā)明中，OD值用722N可見光分光光度計(jì)測定。種子罐培養(yǎng)可以采用一級種子罐培養(yǎng)也可以采用二級種子罐培養(yǎng)，一級種子罐培養(yǎng)即將黃色短桿菌在一個(gè)種子罐中一直培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度；二級種子罐培養(yǎng)即先將黃色短桿菌在一個(gè)種子罐中培養(yǎng)一段時(shí)間后再轉(zhuǎn)入另一個(gè)種子罐繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度。二級種子罐培養(yǎng)在各個(gè)種子罐的培養(yǎng)時(shí)間沒有具體限定，只要最終能培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度即可。為了操作方便，本發(fā)明的種子罐培養(yǎng)優(yōu)選采用一級種子罐培養(yǎng)。本發(fā)明中，對于種子罐培養(yǎng)基的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的種子罐培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子罐培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升種子罐培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升種子罐培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為30-40 克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為 0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. 1克，硫酸銨的用量可以為5-15克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。由于本發(fā)明提供的制備賴氨酸的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)主要在于使用本發(fā)明的黃色短桿菌作為發(fā)酵菌種，因此對于本發(fā)明方法的其他條件和操作沒有特別的要求， 例如，優(yōu)選在接種后在流加碳源和流加氮源的條件下進(jìn)行發(fā)酵。優(yōu)選情況下，流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在 0. 35-0. 8克/升。此處“流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升”是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來使在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵液中還原性糖的濃度維持在5-10克/升，使發(fā)酵液中氮的濃度維持在0. 35-0. 8克/升。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)該在空氣中進(jìn)行。為了有效利用發(fā)酵罐的產(chǎn)能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積優(yōu)選為發(fā)酵罐體積的40-60%，隨著流加碳源和流加氮源，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積逐漸增大，為了保證發(fā)酵罐中的空氣量，優(yōu)選為流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，為了保證放料后發(fā)酵罐中的菌種數(shù)量，不影響放料后發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)，放料體積優(yōu)選為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的5-10%。本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)流加比間歇流加的發(fā)酵效果好，因此，本發(fā)明中的流加優(yōu)選為連續(xù)流加。
本發(fā)明中，優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)57-63小時(shí)后放罐。本發(fā)明中的放罐是指將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基全部從發(fā)酵罐中放出，即停止發(fā)酵。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產(chǎn)品，本發(fā)明方法還包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對于提取賴氨酸的方法無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，例如，采用連續(xù)離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的濃硫酸調(diào)PH至2. 0-3. 0進(jìn)行酸化，酸化后經(jīng)過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或?qū)⑺峄蟮馁嚢彼岚l(fā)酵液經(jīng)絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附交換，樹脂吸附飽和后用稀氨水進(jìn)行洗脫，洗脫下來的賴氨酸經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發(fā)酵液酸化，經(jīng)過濾或離心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值至8. 0-11. 5，使賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質(zhì)生成不溶物，經(jīng)固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經(jīng)過過濾可以得到高純度的賴氨酸溶液，然后經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。本發(fā)明中，對發(fā)酵培養(yǎng)的條件無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的條件，優(yōu)選為 溫度為30-32°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘。本發(fā)明中，碳源優(yōu)選為淀粉質(zhì)原料糖化清液。淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進(jìn)行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并加入淀粉酶對淀粉進(jìn)行第一次水解；對第一次水解產(chǎn)物進(jìn)行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進(jìn)行第二次水解，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。優(yōu)選地，粉碎使淀粉質(zhì)原料過 30目篩的通過率大于75%，更優(yōu)選過30目篩的通過率為100%。調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，但優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17Β °。術(shù)語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計(jì)檢測溶液得到的度數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，淀粉酶的用量可以為10-30酶活力單位，酶解的溫度可以為88-92°C，酶解的時(shí)間可以為90-120分鐘，酶解的 PH值可以為5. 5-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，固液分離的條件使得到的液相組分中的固含量為19-22重量％，更優(yōu)選為20-21重量％。根據(jù)本發(fā)明，在第二次水解中，以每克液相組分計(jì)，糖化酶的用量可以為110-130 酶活力單位，酶解的溫度可以為55-65°C，酶解的時(shí)間可以為420-600分鐘，酶解的pH值可以為 4. 0-4. 5。本發(fā)明酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫
克淀粉轉(zhuǎn)化為還原性糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶。
α-淀粉酶又稱淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，糖化酶優(yōu)選為α -1,4-葡萄糖水解酶。按照本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。本發(fā)明中，氮源的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以為銨鹽。當(dāng)?shù)礊殇@鹽時(shí)，發(fā)酵液中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升，則銨根離子的濃度控制在0. 5-1. 0克/升。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為 40-60克，糖蜜的用量可以為30-50克，玉米漿(干重為20-50重量％ )的用量可以為20-40 克，硫酸銨的用量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)的菌種為經(jīng)過活化后進(jìn)行增殖培養(yǎng)后的菌種?；罨驮鲋撑囵B(yǎng)為本領(lǐng)域的公知常識，在此不再贅述。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式
中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。實(shí)施例以下的實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。在下述實(shí)施例和對比例中OD值測定將取樣的發(fā)酵液進(jìn)行沈倍稀釋，采用722Ν可見光分光光度計(jì)，在波長 562納米可見光下測定吸光值。按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵液中還原性糖的濃度。按照GB3595-83的方法測定發(fā)酵液中銨根離子的濃度。按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵液中的賴氨酸濃度(以賴氨酸鹽酸鹽計(jì))。
單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放料體積)。轉(zhuǎn)化率(％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。以下實(shí)施例使用的黃色短桿菌A均為本發(fā)明的上述黃色短桿菌(該菌株于2011 年10月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC5341)。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。(1)將收獲的100重量份玉米通過機(jī)械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過30目篩的通過率為80%。(2)將粉碎后的產(chǎn)物加水調(diào)漿至12Β °，相對于每克粉碎產(chǎn)物的干重，加入20個(gè)酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶)，在90°C、ρΗ為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產(chǎn)物。其中，將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解清液 (固含量為20重量％)；之后加入115個(gè)酶活力單位的糖化酶(α-1，4_葡萄糖水解酶，諾維信公司)，在60°C、ρΗ為4. 5的條件下酶解420分鐘，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。(3)使用步驟(2)得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制種子罐培養(yǎng)基，具體組成為相對于每升種子罐培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量為35克，玉米漿(干重為35重量％ ) 的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸銨的用量為10 克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克。將培養(yǎng)基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至31°C并保持恒定。開啟攪拌，調(diào)節(jié)罐壓為0. IMPa，按照通風(fēng)量與培養(yǎng)基1 0.5 體積比通入無菌空氣，用氨水調(diào)節(jié)pH至6. 8并保持恒定。然后將黃色短桿菌A活化和增殖后接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0. 95時(shí)停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。(4)使用步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成為相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量為50克，糖蜜(產(chǎn)地新疆)的用含量為40 克，玉米漿(干重為35重量％ )的用量為30克，硫酸銨的用量為30克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷氨酸的用量為0. 3克。培養(yǎng)基加熱到121°C消毒30分鐘后降溫至31°C并保持恒定，用氨水調(diào)節(jié) ρΗΜ6·9。(5)在發(fā)酵罐中裝入步驟(4)配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的50%。使用步驟C3)所得的成熟種子液，接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，步驟C3)所得的成熟種子液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa,發(fā)酵溫度控制為31°C，通氣量為 0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)pH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的8%。發(fā)酵培養(yǎng)60小時(shí)后放罐。測定放罐的賴氨酸濃度(即終點(diǎn)賴氨酸含量，下同)和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實(shí)施例1相同。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的40%。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為12體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa,發(fā)酵溫度控制為30°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的5%。發(fā)酵培養(yǎng)63小時(shí)后放罐。測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度， 計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實(shí)施例1相同。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的60%。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為18體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1. 0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發(fā)酵溫度控制為32°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在7. 0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的10%。發(fā)酵培養(yǎng)57小時(shí)后放罐。測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對比例1按照實(shí)施例1的方法發(fā)酵制備賴氨酸，不同的是，接入的黃色短桿菌菌株為黃色短桿菌FB21 (購自江南大學(xué))，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。表 1
終點(diǎn)賴氨酸含量(g/100ml)單罐供酸量(噸)轉(zhuǎn)化率(% )實(shí)施例116. 2138. 7952. 24實(shí)施例216. 5739. 2153. 65
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權(quán)利要求
1.一種黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，其特征在于，所述黃色短桿菌的保藏編號為 CGMCC5;341。
2.一種如權(quán)利要求1所述的黃色短桿菌在發(fā)酵制備賴氨酸中的應(yīng)用。
3.一種發(fā)酵制備賴氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成賴氨酸的條件下，將如權(quán)利要求1所述的黃色短桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黃色短桿菌的接種量為12-18體積％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，所述方法包括接種后在流加碳源和流加氮源的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，所述發(fā)酵在發(fā)酵罐中進(jìn)行，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐體積的40-60%，流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的5-10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述流加為連續(xù)流加。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質(zhì)原料糖化清液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氮源為銨鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)57-63小時(shí)后放罐。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括溫度為30-32°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，該黃色短桿菌的保藏編號為CGMCC5341。還提供了上述黃色短桿菌在發(fā)酵制備賴氨酸中的應(yīng)用及發(fā)酵制備賴氨酸的方法，該方法包括在生成賴氨酸的條件下，將上述黃色短桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液。本發(fā)明提供的黃色短桿菌(該菌株于2011年10月14日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC5341)，作為發(fā)酵菌種制備賴氨酸，可提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12N1/20GK102533604SQ20121000935
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者盧宗梅, 吳曉艷, 周勇, 鐘華, 陳修 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司