專利名稱：一種嗜熱棲熱菌utm802及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體地，涉及嗜熱棲熱菌UTM802及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)是ー類在40°C以下不能生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為65-70 V，最高生長(zhǎng)溫度80°C，好氧、革蘭氏陰性、非芽孢桿菌，具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。棲熱菌是高溫菌的典型代表，是高溫生物學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的重點(diǎn)菌群，與水熱環(huán)境關(guān)系密切，廣泛存在于各地地?zé)釡厝?，海底火山ロ及人工水熱環(huán)境(如熱水管道和高溫好氧堆肥)。
傳統(tǒng)堆肥一般是利用堆肥物料中的土著微生物，往往存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，臭氣污染嚴(yán)重且腐熟度低等問題，通過在堆肥初期接種微生物制劑的辦法可以提高堆肥效率和成品質(zhì)量。接種微生物促進(jìn)堆肥腐熟的機(jī)理有1)提高堆肥初期微生物的群體，增強(qiáng)微生物的降解活性；2)縮短達(dá)到高溫期的時(shí)間；3)接種分解有機(jī)物質(zhì)能力強(qiáng)的微生物。ー些從堆肥中分離出來的高溫菌、中溫菌、放線菌和真菌常作為堆肥接種劑加速細(xì)胞壁和木質(zhì)素、纖維素水解，促進(jìn)腐殖化過程。目前，高溫堆肥采用的微生物接種劑主要是中溫好氧菌。沈根祥等(1999)在蘑菇培養(yǎng)料上篩選出能促進(jìn)冷性牛糞高溫發(fā)酵的微生物菌群(Hsp菌劑)；顧希賢(1995)從22個(gè)垃圾堆肥、畜糞、土壤等樣品中分離獲得198株纖維分解菌，從中篩選出2株繁殖速度快、粗纖維分解能力強(qiáng)的制成菌劑，并以O(shè). 05%-0. 1%的比例接種到垃圾堆肥的二次發(fā)酵中；李季等(2000)篩選出近10個(gè)具有不同功能作用、繁殖速度快的細(xì)菌、真菌、酵母均等，按照不同比例組合，篩選出能廣泛用于畜禽糞便、市政污泥等有機(jī)廢物堆肥的VT菌劑；席北斗(2003)利用從環(huán)境中分離的微生物，通過誘變培育出活性較高的纖維素分解菌株，并將康氏木霉、白腐菌、變色栓菌與EM菌、固氮菌、解磷菌、解鉀菌按一定比例組合成高效復(fù)合微生物菌劑。申請(qǐng)?zhí)枮?01010514582. 7的中國(guó)專利介紹了ー種將銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、短小芽孢桿菌和珊瑚色諾卡氏菌以及將綠色木霉、脫氮副球菌、黃曲霉、黃孢原毛平革菌和圓褐固氮菌制備成兩種堆肥接種劑，用于堆肥發(fā)酵的不同階段。專利號(hào)為CN 101486969A、CN101186879A、CN101696391A 等中國(guó)專利也公布了將多種芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、光合菌、固氮菌、霉菌等組合制備的堆肥復(fù)合菌劑。這些微生物接種劑中的活性成分在50°C -80°C的堆肥高溫期環(huán)境中常常受到抑制甚至失活，大大降低了接種劑的功效。嗜熱棲熱菌較常溫菌相比，具有更高的微生物代謝活性和有機(jī)物降解速率，在固體有機(jī)廢物處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和科學(xué)價(jià)值。棲熱菌還具有熱穩(wěn)定性的降解酶，可以將堆肥溫度維持在70°C -80°C或更高的溫度，可以更加有效的殺死病原微生物，達(dá)到無害化的要求，同時(shí)棲熱菌酶不僅耐熱，而且對(duì)不良化學(xué)環(huán)境也具有高度的耐受性，能抵抗ー些有毒害作用的污染物或代謝產(chǎn)物的抑制作用，提高處理效率，縮短生產(chǎn)周期。棲熱菌的應(yīng)用，可為有機(jī)固體廢物更好實(shí)現(xiàn)減量化、無害化、穩(wěn)定化和資源化利用的エ業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造有利條件。
將嗜熱棲熱菌作為接種劑應(yīng)用于堆肥，可提高有機(jī)物質(zhì)的降解速率，縮短エ藝運(yùn)行時(shí)間，在有機(jī)廢物資源化利用領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但目前還未見到關(guān)于嗜熱棲熱菌作為接種劑應(yīng)用于高溫堆肥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜熱棲熱菌及其在高溫堆肥中的應(yīng)用。本發(fā)明從高溫期污泥堆肥中，經(jīng)高溫富集、分離純化得到嗜熱棲熱菌Thermusthermophilus UTM802菌株。UTM802于2012年6月4日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJii :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)=CGMCC No. 6186。所述嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus UTM802的鑒定特征是(I)為革蘭氏陰性、無鞭毛、菌體呈短桿狀、無芽孢、專性好氧、菌落光滑、邊緣平整；最適生長(zhǎng)溫度65-70°C，最高80°C，最低40°C ;最適pH值7. 5-7. 8，最高9. 5，最低6. O。(2)利用引物(27f):5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和(1492r):5' -GGTTAC CTT GTT ACG ACT T-3/經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因，基因序列如SEQ ID NOI所示，獲得序列提交到EzTaxon數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示與Thermus thermophilus HB8(T)的相似性最高，為98. 9%。(3)65_70°C下，在復(fù)合培養(yǎng)基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl,0. 05%微量元素，用NaOH調(diào)pH到7. 2，固體培養(yǎng)基加I. 5%瓊脂。微量元素營(yíng)養(yǎng)液組成為(25g MgCl2 ·6Η20，5g CaCl2, 2g MgSO4 · 6Η20，0· 5g ZnSO4 · 7Η20，0· 5g H3BO3, 5g FeCl3 · 6H20,15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 *2H20,20mg NiNO3 *6H20, 50mgCoN03 *6H20,80mg 鹽酸吡哆醇，IOmg 葉酸，0. 5mL 硫酸，IOOmg鹽酸硫胺素,40mg核黃素，80mg煙酰胺，80mg對(duì)氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素,O. 4mg氰鈷胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化膽堿，50mg乳清酸，IOOmg亞精胺，IOOOmL蒸餾水)上生長(zhǎng)良好。本發(fā)明還提供ー種含有所述嗜熱棲熱菌UTM802的高溫菌劑。所述高溫菌劑含有嗜熱棲熱菌UTM802的有效活菌個(gè)數(shù)I X IO4^l X IO6個(gè)/克。其中，所述高溫菌劑還含有載體，所述載體為腐熟堆肥，所述腐熟堆肥含水率30%以下。所述高溫菌劑的制備方法包括以下步驟I)菌種發(fā)酵將UTM802斜面菌種接種改良YTPG固態(tài)斜面上培養(yǎng)；將活化的菌種接種于改良YTPG液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng),制備發(fā)酵種子液；將發(fā)酵種子液接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵菌液；2)制備高溫菌劑發(fā)酵液與腐熟堆肥混勻，干燥、粉碎、篩分得到。其中，步驟(I)中所述菌種活化的方法是取4°C保存的UTM802斜面菌種轉(zhuǎn)接至改良YTPG固態(tài)斜面上，在65°C 70°C下培養(yǎng)至豐厚。所述改良YTPG固態(tài)斜面的配方是酵母提取物I. 5^2. 5g/L，蛋白胨I. 5^2. 5g/L，葡萄糖 I. 5 2. 5g/L，PIPES 4. 5 7. 5g/L，浸提液 IOOOmL, pH 7. 2 7· 4 (用固態(tài) NaOH 調(diào)節(jié))，植物凝膠8 12g/L，瓊脂15 20g/L ；所述浸提液制備方法稱取50g 100g —次發(fā)酵后腐熟堆肥(含水率小于30%)，カロ入250mL蒸餾水，在室溫下，15(T200rpm振蕩8 16小時(shí)；取振蕩液在300(T4000rpm下離心5 20min，收集上清液，得浸提液母液，在4°C保存?zhèn)溆?；使用吋，用蒸餾水稀釋廣3倍即為培
養(yǎng)基浸提液。所述發(fā)酵種子液制備的方法是取步驟(I)中活化培養(yǎng)至豐厚的斜面I個(gè)，用無菌水沖洗菌落至IOOOmL改良YTPG液態(tài)培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)，得發(fā)酵種子液。所述改良YTPG液態(tài)培養(yǎng)基與上述步驟(I)改良YTPG固態(tài)斜面配方的區(qū)別是不含 有植物凝膠和瓊脂。所述發(fā)酵種子液的培養(yǎng)條件是溫度65 70°C，轉(zhuǎn)速12(T200rpm，恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)廣3天。所述發(fā)酵菌液制備的方法是按5% 15%的接種量將發(fā)酵種子液接種至發(fā)酵罐中，在罐溫28 35°C、罐壓O. 02 O. 06MPa、通氣量I: I. O I. 5v/v/min、攪拌速度200 300轉(zhuǎn)/分鐘、發(fā)酵時(shí)間3 8天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵罐中所用的培養(yǎng)液組成為按200_400g/L的濃度將腐熟堆肥(含水率小于30%)溶解在水中，在室溫下，15(T200rpm攪拌4 8小吋，然后靜置過濾，收集上清液，得發(fā)酵母液；使用時(shí)，在發(fā)酵母液中加入1°/Γ3%的糖蜜或紅糖，1°/Γ3%的碳銨、尿素、蛋白胨中的一種或多種制備成發(fā)酵罐培養(yǎng)基。其中，步驟(2)中所述高溫菌劑的制備方法是將所得到的發(fā)酵菌液均勻噴灑在含水率30%以下的腐熟堆肥上，接種量約為5%-10%，然后經(jīng)烘干、粉碎、過篩，制備成高溫菌劑成品，高溫菌劑中有效活菌個(gè)數(shù)I X IO4^l X IO6個(gè)/克。所述腐熟堆肥為利用有機(jī)固體廢棄物經(jīng)過高溫好氧發(fā)酵制備的物料，有機(jī)固體廢棄物包括農(nóng)作物秸桿、畜禽糞便、食品エ業(yè)下腳料、城市污泥、生活垃圾、枯枝落葉、菇渣等，所述腐熟堆肥的標(biāo)準(zhǔn)為物料經(jīng)過高溫發(fā)酵后(55°C以上高溫持續(xù)一周以上)溫度下降到環(huán)境溫度，含水率30%以下，種子發(fā)芽指數(shù)大于60%。高溫菌劑在有機(jī)固廢堆肥化中的應(yīng)用方法是按重量比19Γ5%與待發(fā)酵物料混合即可。所述有機(jī)固廢堆肥初始含水率45% 55%、C/N 20 30、ρΗ 7 8。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所提供的嗜熱棲熱菌UTM802在堆肥達(dá)到60-80°C的高溫環(huán)境中均生長(zhǎng)良好，具有穩(wěn)定的降解性能，能快速降解有機(jī)物質(zhì)，加快堆肥進(jìn)程。本發(fā)明菌株以有機(jī)廢物為載體，制備固態(tài)微生物堆肥接種劑，成本低，應(yīng)用于堆肥時(shí)不會(huì)對(duì)物料水分產(chǎn)生影響。利用本發(fā)明固態(tài)微生物堆肥接種劑進(jìn)行高溫堆肥，可避免接種劑中的活性微生物在高溫發(fā)酵期失活，具有性能穩(wěn)定、使用方便的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I嗜熱棲熱菌UTM802的篩選稱取5g高溫期污泥堆肥樣品于裝有15個(gè)玻璃珠與50mL無菌水的150mL三角瓶中，置于搖床上160rpm振蕩I小時(shí)，使樣品充分散開，然后放置70°C下，靜置3小吋。
取無菌平皿，吸取ImL高溫富集液和低倍稀釋液，接入已作好標(biāo)記的平皿中；將已融化并冷卻至55°C左右的改良YTPG培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約30mL，前后左右輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，與富集液充分混勻，待凝固。將凝固后的平板倒置于密閉容器中，同吋，每密閉容器中放置一個(gè)裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中70°C培養(yǎng)。每天觀察，待長(zhǎng)出菌落后，仔細(xì)觀察菌落特征，確定不同類型菌株，繼續(xù)采用改良YTPG培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離純化，從平板上菌落形態(tài)特征和簡(jiǎn)單染色后顯微鏡下多視野確認(rèn)菌體形態(tài)一致后得到純菌，并繼續(xù)在70°C下傳代培養(yǎng)5代，淘汰生長(zhǎng)不穩(wěn)定的菌株，得到嗜熱棲熱菌UTM802。將UTM802轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)至改良YTPG培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)至豐厚，在4°C保藏備用。其中，改良YTPG培養(yǎng)基的配制方法是(I)浸提液制備先稱取50g —次發(fā)酵后的腐熟污泥堆肥，加入250mL蒸懼水,在室溫下，180rpm振蕩過夜；取振蕩液在4000rpm下離心lOmin，收集上清液，在4°C保存?zhèn)溆?；使用吋，用蒸餾水稀釋2倍即為培養(yǎng)基浸提液。 (2)按培養(yǎng)基配方(酵母提取物2. Og，蛋白胨2. 0g，葡萄糖2. 0g，PIPES 6. 0g，培養(yǎng)基浸提液IOOOmL, pH 8. O (用固態(tài)NaOH調(diào)節(jié))，植物凝膠10g，瓊脂15g)配制，在121°C下滅菌25分鐘。實(shí)施例2嗜熱棲熱菌UTM802的鑒定將實(shí)施例I所得到的嗜熱棲熱菌UTM802在改良YTPG培養(yǎng)基平板上，70°C下培養(yǎng)24小時(shí)，觀察其特征，結(jié)果它是革蘭氏陰性、好氧菌且不形成孢子，菌體呈短桿狀。以本發(fā)明菌株UTM802的DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rRNA序列，引物為(27f)5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/ 和(1492r):5' -GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3/ 。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)其純度后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見序列表SEQ ID NO. I所示。獲得的16S rDNA基因序列通過EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.eztaxon.org/)進(jìn)行比對(duì)，同源性在97%以上的菌株只有Thermus thermophilus HB8 (T)(相似度98. 95%)，故將UTM 802 鑒定為 Ther mus thermophilus HB8(T)。配制復(fù)合培養(yǎng)基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl，0. 05%微量元素，用NaOH調(diào)pH到7. 2，固體培養(yǎng)基加I. 5%瓊脂。微量元素營(yíng)養(yǎng)液組成為(25g MgCl2 · 6H20，5gCaCl2, 2g MgSO4 · 6H20，0. 5g ZnSO4 · 7H20，0. 5g H3B03，5g FeCl3 · 6H20，15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 · 2H20, 20mg NiNO3 · 6H20, 50mg CoNO3 · 6H20,80mg 鹽酸吡哆醇，IOmg 葉酸，O. 5mL 硫酸，IOOmg鹽酸硫胺素,40mg核黃素，80mg煙酰胺，80mg對(duì)氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素，O. 4mg氰鈷胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化膽堿，50mg乳清酸，IOOmg亞精胺，IOOOmL蒸餾水)，接種UTM802，發(fā)現(xiàn)在50°C _80°C下均能生長(zhǎng)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，將該菌株鑒定為Thermus thermophilus HB8 (T),命名為Thermusthermophilus UTM 802，并于2012年6月4日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJii :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏,分類命名為嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus,保藏號(hào)為CGMCCNo.6186。實(shí)施例3嗜熱棲熱菌UTM802生長(zhǎng)的溫度范圍將UTM 802菌株接種于改良YTPG培養(yǎng)基平板上在70°C下活化培養(yǎng)24小吋。然后接種于改良YTPG培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度40 V、50°C、60 V、70°C、80 V下培養(yǎng)。根據(jù)溫度標(biāo)記，分別放入不同的恒溫箱中培養(yǎng)，在24小時(shí)后觀察菌株長(zhǎng)勢(shì)，辨別菌株的生長(zhǎng)情況。將觀察結(jié)果填入下表I?！耙弧北硎静簧L(zhǎng)；“ + ”表示微生長(zhǎng)；“++”表示中度生長(zhǎng)；“+++”表示生長(zhǎng)良好。表I不同溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響
權(quán)利要求
1.嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus) UTM802，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6186。
2.含有權(quán)利要求I所述嗜熱棲熱菌UTM802的高溫菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高溫菌劑，其特征在于，含有嗜熱棲熱菌UTM802的有效活菌個(gè)數(shù)I X IO4 IO6個(gè)/克。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的高溫菌劑，其特征在于，還含有載體，所述載體為腐熟堆肥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高溫菌劑，其特征在于，所述腐熟堆肥含水率30%以下。
6.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述高溫菌劑的制備方法，包括以下步驟 1)菌種發(fā)酵將嗜熱棲熱菌UTM802活化，制備發(fā)酵種子液，之后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵菌液； 2)制備高溫菌劑將發(fā)酵菌液與腐熟堆肥混勻，干燥、粉碎、篩分得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述菌液與腐熟堆肥的質(zhì)量百分比為5% 10%。
8.權(quán)利要求I所述端嗜熱菌UTM802菌株或權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述高溫菌劑在有機(jī)固廢堆肥化中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在干，所述高溫菌劑與有機(jī)固廢混合的重量百分比為1% 5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)UTM802，其保藏號(hào)為CGMCC No.6186。本發(fā)明菌株以有機(jī)廢物為載體，制備固態(tài)微生物堆肥高溫菌劑，成本低，應(yīng)用于堆肥時(shí)不會(huì)對(duì)物料水分產(chǎn)生影響。利用本發(fā)明固態(tài)微生物堆肥高溫菌劑進(jìn)行高溫堆肥，可避免接種劑中的活性微生物在高溫發(fā)酵期失活，具有性能穩(wěn)定、使用方便的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102851246SQ201210343220
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉永躍, 周順桂, 許宜北, 汪涌 申請(qǐng)人:大地綠源環(huán)?？萍?北京)有限公司