專利名稱：一種檢測(cè)AML1-ETO融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)AMLl-ETO融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
急性髓系白血病常見于60歲以下的病人，也可見于大約8%兒童和青少年，通常主要表現(xiàn)為多能干細(xì)胞或者已輕度分化的前體細(xì)胞核型發(fā)生突變。t(8;21)(q22;q22)易位是急性髓系白血病最常見的一種染色體異常，主要見于急性粒細(xì)胞白血病部分分化型 (AML-M2)，亦可發(fā)生于急性粒細(xì)胞白血病未分化型(AML-Ml)、急性粒-單核細(xì)胞白血病 (AML-M4)及骨髓增生異常綜合征(MDS)-RAEB-T中。其主要特征表現(xiàn)為位于21號(hào)染色體 q22 的 AMLl 基因(acute myeloblastic leukemia one gene)與 8 號(hào)染色體 q22 的 ETO 基因(eight twenty one gene,也稱為MTG8基因)發(fā)生融合,從而生成AML1-ET0融合基因。 AMLl-ETO融合基因一方面阻止CBF結(jié)合區(qū)域的反式激活，從而抑制AMLl的功能；另一方面 ETO與核抑制子異常結(jié)合，形成具有組蛋白脫乙?；富钚缘膹?fù)合物，進(jìn)而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，導(dǎo)致髓系前體細(xì)胞分化停滯，增殖異常。
AMLl-ETO融合基因陽性是預(yù)后好的標(biāo)志，其完全緩解率可達(dá)90%，5年長(zhǎng)期無病生存率可達(dá)50%_70%，因此，t(8 ；21) (q22 ；q22)的存在是白血病預(yù)后良好的標(biāo)志，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)急性髓系白血病診療指南明確指出急性髓系白血病需要進(jìn)行骨髓或者外周血中AMLl-ETO融合基因的檢測(cè)，并定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。大部分病人經(jīng)化療或BMT后可在短期內(nèi)轉(zhuǎn)為陰性，但仍有轉(zhuǎn)陽性的可能，及時(shí)治療可再次轉(zhuǎn)陰性。在老年AML患者中，t(8;21)易位伴隨正常核型被認(rèn)為其預(yù)后屬于中等；而在AML伴隨t (8; 21)易位的高齡患者中異常細(xì)胞核型的檢測(cè)率不到2%，且此類患者完全緩解率可高達(dá)87%，但是5年內(nèi)復(fù)發(fā)率也可高達(dá)84%。 t(8;21)對(duì)不同年齡患者的預(yù)后存在差別。
AMLl-ETO融合基因mRNA表達(dá)的AML患者通過前期誘導(dǎo)加上緩解后的繼續(xù)治療能夠達(dá)到較高的完全緩解率和較長(zhǎng)的生存率。因此，AMLl-ETO融合基因表達(dá)的檢測(cè)適應(yīng)了急性髓系白血病的診斷需要，對(duì)其預(yù)后的預(yù)測(cè)具有指導(dǎo)意義。而熒光定量PCR檢測(cè)AMLl-ETO 融合基因的mRNA水平比應(yīng)用免疫組化定量檢測(cè)AMLl-ETO融合蛋白含量其敏感性及特異性均較高。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)與免疫組化法相比有更強(qiáng)的特異性、更高的靈敏度而且檢測(cè)快速、降低了污染，但目前尚未有用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)急性髓性白血病中AML1-ET0融合基因的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè) AML1-ET0融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)AML1-ET0融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測(cè)用引物、 熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，所述檢測(cè)用引物、熒光探針包括AMLl-ETO融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示；AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；AMLl-ETO融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID NO: 5所示；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列和內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。進(jìn)一步地，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA0具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽性對(duì)照為含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品。具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl24yL, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin) O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1Χ的PCR預(yù)混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、?！?2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和效果如下(I)敏感度高可重復(fù)敏感度為O. 01%，即10000個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)含AMLl-ETO融合基因就可以被檢測(cè)出。(2)特異性強(qiáng)使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，準(zhǔn)確性高。同時(shí)，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡(jiǎn)便安全操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開蓋，不易被污染；同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，無需要擔(dān)心放射性污染。(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時(shí)完成。本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)AMLl-ETO融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于急性髓性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為急性髓性白血病的診斷、制定治療方案及療效評(píng)價(jià)和預(yù)后提供了重要的檢測(cè)手段。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖；圖IB是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2A是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖；圖2B是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例I.本發(fā)明試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計(jì)根據(jù)基因序列(ABL基因序列、AMLl基因序列和ETO基因序列來源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫，其中ABL基因ID為25，核酸參考序列號(hào)為NM_005157.4 ;AML1基因ID為861，核酸參考序列號(hào)為NM_001001890. 2 ;ΕΤ0基因ID為862，核酸參考序列號(hào)為NM_001198625. I)分別設(shè)計(jì)對(duì)上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發(fā)明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號(hào)15596-026/100ml),每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑快速提取急性髓系白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號(hào)K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積 11 μ L0③引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品包括AMLl-ETO融合基因引物、內(nèi)部陽性控制序列引物、內(nèi)參基因ABL引物以及與引物對(duì)應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下AMLl-ETO融合基因上游引物為5’ -GCCCCGAGAACCTCGAAA-3’(序列表中序列I);AMLl-ETO融合基因下游引物為5’ -TCCACAGGTGAGTCTGGCATT-3’(序列表中序列2)；
AMLl-ETO 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -CGTACTGAGAAGCACTC-3’ TAMRA (序列表中序列3)；內(nèi)部陽性控制序列為5’ -UGCUGAGCGUGCGACCGCUCUCGUACUGAGCUGCACUCCACGUCCAGCUGUCACUGAGCCG-3，(序列表中序列 7)；內(nèi)部陽性控制序列上游引物為5’-TGCTGAGCGTGCGACCGCTC-3’(序列表中序列8);內(nèi)部陽性控制序列下游引物為5’ -CGGCTCAGTGACAGGAC-3’(序列表中序列9)；內(nèi)部陽性控制序列Taqman 熒光探針為TET 5’-CGTACTGAGCTGCACTC-3’TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL 基因上游引物為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列 4)；ABL基因下游引物為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);其中，內(nèi)部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的AMLl-ETO融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標(biāo)準(zhǔn)品。上述引物序列、控制序列、基因序列和探針序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。④陰性對(duì)照和陽性對(duì)照以去離子水為陰性對(duì)照，以含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品為陽性對(duì)照，采用上述實(shí)施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號(hào)15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入ImlTrizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有AMLl-ETO融合基因的急性髓系白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對(duì)照。⑤AMLl-ETO融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)AMLl-ETO融合基因的引物、探針組成1X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)210212，2XPCRPremix)、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 AMLl-ETO 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0· 25pmol/yL的AMLl-ETO融合基因下游引物(序列表中序列2)、O. 3pmol/ μ L的AMLl-ETO融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測(cè)樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水，反應(yīng)總體積通常為20 μ L。⑥ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的ABL基因上游引物(序列表中序列4)、O. 25pmol/ μ L的ABL基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman突光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測(cè)時(shí)，加入ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品模板2 μ L,其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。⑦內(nèi)部陽性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)內(nèi)部陽性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)=210212,
2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9),0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測(cè)時(shí)，通常取1-2 μ L的模板(內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。3、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經(jīng)過95°C 15s，60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)施例2.用實(shí)施例I制備的試劑盒檢測(cè)AMLl-ETO mRNA的表達(dá)量以檢測(cè)30例急性髓系白血病骨髓組織標(biāo)本結(jié)果為例。用實(shí)施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)AMLl-ETO融合基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)流程為首先獲取臨床急性髓系白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)，然后再配制AMLl-ETO融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個(gè)檢測(cè)過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測(cè)失敗，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復(fù)檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分別計(jì)算AMLl-ETO融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析，并標(biāo)化計(jì)算樣本數(shù)據(jù)。具體步驟如下①急性髓系白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提急性髓系白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm與280nm光密度值計(jì)算RNA的純度與濃度，用0.1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取2111^上述1 應(yīng)提取液，在701保溫101^11，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24 μ L，IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I μ L濃度為2 μ g/ml的內(nèi)部陽性控制序列RNA (序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對(duì)照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24yL,10X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。③將內(nèi)部陽性控制基因序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實(shí)施例I提供的內(nèi)部陽性控制序列和ABL內(nèi)參基因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)。④AML1-ET0融合基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20yL:含IXPCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào)210212, 2 X PCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，AMLI-ETO融合基因引物終濃度0. 2 μ mo I /L，AMLI-ETO融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,被測(cè)樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA l.OyL,同時(shí)加入終濃度為0. 2 μ mo I/L的內(nèi)部陽性控制序列的引物、終濃度為0. 3 μ mol/L的內(nèi)部陽性控制序列的探針和終濃度為0. 2 μ mol/L的內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA (②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，加入超純水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物終濃度0. 2 μ mol/L,探針終濃度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNA l.OyL,加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。⑥陽性對(duì)照、陰性對(duì)照熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，AML 1-ΕΤ0融合基因引物終濃度0. 2 μ mol/L,探針終濃度0. 3 μ mol/L,陽性對(duì)照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. 0μ L或者陰性對(duì)照去離子水I. O μ L，加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。
⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個(gè)檢測(cè)過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出AMLl-ETO融合基因相對(duì)于ABL基因的相對(duì)表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值大于或等于
O.0001為陽性表達(dá)，小于O. 0001為陰性表達(dá)(具體參見表I)表I熒光定量PCR分析融合基因AMLl-ETO在急性髓系白血病中的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)AMLl-ETO融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測(cè)用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，其特征在于，所述檢測(cè)用引物、熒光探針包括AMLl-ETO融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示； AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:2所示； AMLl-ETO融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示； ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:5所示； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ IDNO: 10所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽性對(duì)照為含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ 1，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預(yù)混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)AML1-ETO融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括AML1-ETO融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針。AML1-ETO融合基因是急性髓系白血病最常見易位之一，其與CBFβ作用，干擾AML1介導(dǎo)的髓系特異性基因的正常表達(dá)。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測(cè)AML1-ETO融合基因mRNA水平，其檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高。本發(fā)明試劑盒為預(yù)測(cè)急性髓系白血病的預(yù)后以及化療方案的確定提供了一種全新的快速簡(jiǎn)便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925573SQ20121044110
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請(qǐng)人:李艷, 童永清