一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，熒光定量PCR方法采用一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針，兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，第一條熒光探針是用于檢測細菌的通用型熒光探針，第二條熒光探針是用于檢測人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴增技術(shù)進行檢測。通過上述方式，本發(fā)明的檢測方法，適用于血小板制品細菌污染篩查，可充分解決血小板制品細菌污染中細菌有無、細菌含量、細菌死活等問題，滿足快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測要求，為血小板安全輸注提供一種科學(xué)、有效的輔助診斷方法。
【專利說明】—種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子診斷和檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法。

【背景技術(shù)】
[0002]通過輸血傳播的病原體主要是病毒、細菌和原蟲等，我國目前納入血源篩查的項目僅有乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋體。在輸血的感染性風(fēng)險中，細菌污染和敗血癥性輸血反應(yīng)尚未得到足夠重視。血小板制品必須在(22±2)°C條件下振蕩保存，這種環(huán)境下細菌污染的概率要高于其他血液成分細菌污染或病毒感染的概率，因此血小板制品有效保存期很短，一般規(guī)定是24小時或5天。研究表明，大約每3000單位的血小板制品中就有I個單位發(fā)生細菌污染，主要污染來源是獻血者皮膚菌群，獻血者存在無癥狀的菌血癥以及在制備過程中發(fā)生的污染。發(fā)生細菌污染的血小板制品如果輸注到病人體內(nèi)，幾乎無例外都要引起輕重程度不等的輸血反應(yīng)，甚至是致命的菌血癥和敗血癥。美國血庫協(xié)會(AABB)2004年規(guī)定所有血小板制品在輸注前均應(yīng)作細菌污染檢測。我國衛(wèi)生部在2004年專門討論了血液制品的細菌安全問題，但至今還沒有關(guān)于血液及血液成分細菌污染檢測的相關(guān)法律法規(guī)出臺。開展血小板細菌污染檢測，既是為了保證臨床血小板輸注的安全，同時也是為了充分有效利用有限的血小板資源。
[0003]血小板細菌污染檢測技術(shù)主要有三類:細菌培養(yǎng)檢測、血清學(xué)免疫檢測、核酸分子檢測。目前以細菌培養(yǎng)檢測方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，其中通過FDA認證的有Bact/ALERT細菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)和PalleBDS細菌檢測系統(tǒng)，均是基于細菌培養(yǎng)生長繁殖過程中的各種指標(biāo)變化，如消耗的O2、累積的CO2、營養(yǎng)成分改變等，這種方法檢測耗時較長，需要I?2天，會有漏檢的情形發(fā)生。此外，通過FDA認證的PGD試紙條檢測系統(tǒng)是采用細菌表面特異性抗原的單克隆抗體床旁快速檢測血小板制品細菌污染，但該方法不能作為血小板質(zhì)量控制檢測方法，敏感性較差，對一些革蘭氏陰性細菌不易檢出。Scansystem系統(tǒng)則是利用單抗富集血小板濾過樣本，對其中的細菌DNA用通透劑和熒光劑進行標(biāo)記，并用激光掃描確定污染情況，該方法檢測時間雖短，但靈敏度不高，最終結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜。目前，國內(nèi)尚未開發(fā)血小板細菌制品污染相關(guān)的檢測試劑及儀器。
[0004]核酸檢測(Nucleic Acid Test，NAT) —般是對各種病原生物的特異性靶標(biāo)核酸序列進行定性、定量分析。在血液及血液制品的篩查和檢測領(lǐng)域，核酸檢測已經(jīng)廣泛用來檢測樣本是否存在病毒感染，以降低輸血傳播病毒性傳染病的風(fēng)險。如艾滋、乙肝、丙肝和梅毒(HIV,HBV,HCV,Tp)是血液相關(guān)樣本法定檢測的四項，目前都采用核酸檢測或聯(lián)合酶聯(lián)免疫檢測的方法進行確認。核酸檢測技術(shù)平臺主要是從PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增)技術(shù)發(fā)展而來，其中的PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。
[0005]熒光定量PCR是從PCR技術(shù)發(fā)展而來，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，可實時監(jiān)控反應(yīng)過程，通過計算機對產(chǎn)物進行分析，省略普通PCR的后續(xù)鑒定步驟，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定量。熒光定量PCR檢測已經(jīng)在臨床疾病診斷，優(yōu)生優(yōu)育檢測，動植物檢驗檢疫，食品安全，科學(xué)研究等不同領(lǐng)域得到應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，該方法檢測快速、準(zhǔn)確、可靠。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，所述熒光定量PCR方法采用一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條突光標(biāo)記的突光探針和第二條突光標(biāo)記的突光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，所述第一條熒光探針是用于檢測細菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴增技術(shù)進行檢測。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6_probe探針，所述CR6_probe探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 202 bp。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR6-F上游引物和CR8-R下游引物，所述CR6-F上游引物為TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R下游引物為GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一條熒光探針為CR7_probe探針，所述CR7_probe探針為 6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 291 bp。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR7-F上游引物和CR9-R下游引物，所述CR7-F上游引物為GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R下游引物為TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一條熒光探針為CR8-probe探針，所述CR8_probe探針為 6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 243 bp。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述一對檢測細菌的通用型引物為23S3⑶-F上游引物和23S3⑶-R下游引物，所述23S3⑶-F上游引物為CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R下游引物為GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一條熒光探針為23S3CD -probe探針，所述 23S3CD -probe 探針為 6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQl，擴增產(chǎn)物大小為 189
bp ο
[0012]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和所述一對檢測細菌的通用型引物完全匹配，中間80bp的序列和內(nèi)參探針是人工設(shè)計的，與任何細菌及人類基因組沒有任何相關(guān)性，所述人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)為5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補序列3’。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述人工內(nèi)參加入到檢測樣本中，可設(shè)為最低檢出限或任意閾值，也可作為標(biāo)準(zhǔn)品，具有對檢測結(jié)果提供質(zhì)控、判讀、定量參照功能。
[0014]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述熒光定量PCR方法中通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測樣本中的RNA，與人工內(nèi)參和相應(yīng)DNA的Ct值進行比較，判斷細菌是否為活性菌。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，該方法只用一對引物，兩種探針就能完成血小板細菌污染的檢測，其人工內(nèi)參除了具有一般內(nèi)參功能外，還可作為標(biāo)準(zhǔn)品使用，解決了目前血小板制品細菌污染缺少標(biāo)準(zhǔn)品的問題，也使得核酸檢測用于血小板制品細菌污染篩查成為可能。本發(fā)明對常規(guī)熒光定量PCR方法進行了重新設(shè)計和優(yōu)化，使其更適用于血小板制品細菌污染篩查，可充分解決血小板制品細菌污染中細菌有無、細菌含量、細菌死活等問題，以及滿足快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測要求，為血小板安全輸注提供一種科學(xué)、有效的輔助診斷方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明的通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法的原理過程圖；
圖2是血小板細菌污染中細菌種類的統(tǒng)計圖；
圖3是計算機分析相關(guān)引物、探針在26種細菌中的匹配性圖；
圖4是CR5-F和CR7-R引物對細菌和人基因組的擴增特異性圖；
圖5是熒光定量PCR檢測細菌DNA的信號圖；
圖6是人工內(nèi)參的檢測限與樣本檢測Ct值間的差異與判讀圖；
圖7是反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測細菌RNA的Ct值比較圖。

【具體實施方式】
[0017]下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0018]請參閱圖1，本發(fā)明是基于熒光定量PCR方法檢測血小板細菌污染的，所述熒光定量PCR方法設(shè)計了一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針。一對引物進行核酸擴增，兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，一條熒光探針用于檢測細菌靶標(biāo)，另一條熒光探針是內(nèi)參探針，用于內(nèi)部質(zhì)量控制以及定量參照。
[0019]所述熒光定量PCR方法采用以上設(shè)計的優(yōu)點有:(I)只用一對引物就能完成靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的PCR擴增，不同一般靶標(biāo)和內(nèi)參分別需要不同引物來進行擴增，優(yōu)化了整個PCR反應(yīng)，減少引物過多引起的非特異性假陽性問題。(2)建立人工內(nèi)參作為標(biāo)準(zhǔn)品，由于污染血小板的細菌種類各異，一般情況是不存在血小板細菌污染的標(biāo)準(zhǔn)品，本發(fā)明的人工內(nèi)參既可作為血小板細菌污染檢測樣本的標(biāo)準(zhǔn)品，也可作為熒光PCR反應(yīng)的內(nèi)部質(zhì)量控制以及定量參照。用內(nèi)參作為最小檢出限時，只有Ct (檢測)=Ct (內(nèi)參)，才能確保檢測樣本陽性，避免假陽性；用內(nèi)參作為絕對定量參照時，可在檢測不同樣本的同時制作統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時既可作為反應(yīng)質(zhì)控內(nèi)標(biāo)，也可作為定量標(biāo)準(zhǔn)樣品；(3)檢測樣本和內(nèi)參可在同一個反應(yīng)體系里進行，不同于一般核酸檢測中標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本分開在不同反應(yīng)體系中，本發(fā)明設(shè)計可以更好發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)點，減少一般情形下標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣需放在不同反應(yīng)體系所造成的人為或系統(tǒng)誤差。
[0020]請參閱圖2，血小板制品中可能污染的細菌種類有很多，研究發(fā)現(xiàn)，污染血小板的主要細菌屬種為:葡萄球菌屬(表皮葡萄球菌、金黃葡萄球菌)占27%，鏈球菌屬(化膿鏈球菌，溶血性鏈球菌)占12%，假單胞菌屬(銅綠假單胞菌，鼻疽假單胞菌)占9%，棒桿菌屬(白喉桿菌，蠟狀芽孢桿菌，皮膚丙酸桿菌，莢膜梭狀桿菌，變性桿菌)占14%，腸科細菌(乳酸菌，腸球菌)占8%，傷寒沙門氏菌占8%，粘質(zhì)沙雷氏菌占7%，大腸埃希菌占6%，腸結(jié)炎耶爾森氏菌占3%，肺炎克雷伯氏菌占4%，這些細菌占了 97%以上。資料來源:Murphy MF和PamphilonDH 所著《Practical Transfus1n Medicine)) (2009,第 3 版，pl46_152) 一書。
[0021]在檢測血小板制品細菌污染的實踐中，一般情形下，并不需要對每種細菌都進行檢測，只需能區(qū)分有無細菌污染的發(fā)生即可。因此，本發(fā)明以在人類基因組中不存在，但在細菌進化中高度保守的共有核酸序列作為細菌通用型檢測靶標(biāo)，如16S rDNA或23S rDNA，這2個基因存在于所有細菌染色體基因中，通常作為細菌系統(tǒng)分類研究中的靶標(biāo)，具有良好的分子鐘性質(zhì)，進化上高度保守，可稱為“細菌化石”。
[0022]本發(fā)明在16S rDNA和23S rDNA基因中選擇了合適區(qū)域設(shè)計相關(guān)檢測引物和探針:
(I)16S rDNA作為細菌通用型特異性檢測祀標(biāo),在其不同恒定區(qū)(constant reg1n,CR)設(shè)計了 3套引物和探針:
①在恒定區(qū)5和恒定區(qū)7分別設(shè)計上下游引物，探針設(shè)計在恒定區(qū)6，擴增范圍包括CR5-VR5-CR6-VR6-CR7:
CR5-F 上游引物:GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA ；
CR7-R 下游引物:TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG ；
CR6-probe 探針:6FAM-CAGGATTAGATACCCTG_BHQ1 ；
擴增產(chǎn)物大小:202 bp。
[0023]②在恒定區(qū)6和恒定區(qū)8分別設(shè)計上下游引物，探針設(shè)計在恒定區(qū)7，擴增范圍包括 CR6-VR6-CR7-VR7-CR8:
CR6-F 上游引物:TTAGATACCCTGGTAGTCCA ；
CR8-R 下游引物:GAGCTGACGACAICCITGC ；
CR7-probe 探針:6FAM_ ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1 ；
擴增產(chǎn)物大小:291 bp。
[0024]③在恒定區(qū)7和恒定區(qū)9分別設(shè)計上下游引物，探針設(shè)計在恒定區(qū)8，擴增范圍包括 CR7-VR7-CR8-VR8-CR9:
CR7-F 上游引物:GCAACGCGAAIAACCTTACC ；
CR9-R 下游引物:TGACGTCITCCCCACCTTC ；
CR8-probe 探針:6FAM_ TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1 ；
擴增產(chǎn)物大小:243 bp。
[0025](2) 23S rDNA作為細菌特異性檢測靶標(biāo)，在其3端的高度保守恒定區(qū)里設(shè)計引物和探針:
23S3CD-F 上游引物:CTCAACGGATAAAAGITAC ；
23S3CD-R 下游引物:GACCIAACTGTCTCACGAC ；
23S3CD -probe 探針:6FAM_ TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQl ；
擴增產(chǎn)物大小:189 bp。
[0026]上述4套引物和探針經(jīng)過對26種經(jīng)報道的常見血小板污染細菌相關(guān)核酸序列進行計算比對，結(jié)果顯示出良好的匹配性和特異性。個別位置不一致的核苷酸序列，在引物合成中通過換成次黃嘌呤(I)堿基則可以與任意四種ATGC堿基互補，第I套引物、探針的比對結(jié)果如圖3所示，其他幾套引物比對結(jié)果也是如此。由于這26種細菌在統(tǒng)計中，基本覆蓋已經(jīng)報道并鑒定的血小板污染細菌，覆蓋率大于97%以上，因此這些引物和探針具有非常高的檢測血小板污染細菌的通用性。盡管如此，我們還將這些引物序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行了搜索比對,結(jié)果顯示和各種細菌微生物吻合，但沒有一例真核生物的匹配結(jié)果。在下面實施例里，也證實在人類基因中沒有檢出。
[0027]本發(fā)明設(shè)計了一套獨特的人工內(nèi)參系統(tǒng)，在通常血小板細菌污染沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，這套人工內(nèi)參的作用更加突出。這套人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和檢測用的上下游引物完全匹配，中間80bp的序列以及內(nèi)參探針是人工設(shè)計的，與任何細菌以及人類基因組均沒有任何相關(guān)性。
[0028]人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)是5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補序列3’，以16S rDNA第①套引物為實施例，人工內(nèi)參的序列是:5 ’ GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA3’，其中 GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA 序列為上游引物，CCGCCTGGGGAITACGGICGCAA 為下游引物(TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG)的互補序列，而CCTGCTTGGAACTG 序列是內(nèi)參探針:HEX_ CTGCTTGGAACTG-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 125bp。
[0029]本發(fā)明作為常規(guī)的熒光定量PCR可以檢測細菌的DNA是否在血小板制品中存在，同時本發(fā)明可增加反轉(zhuǎn)錄步驟作為RT-熒光定量PCR檢測細菌的RNA是否存在，從而評估血小板細菌污染中的細菌是否為活菌。
[0030]實踐中，一些血小板制品經(jīng)過輻照處理，大部分細菌已經(jīng)死亡，它們的DNA仍然存在于血小板中，常規(guī)熒光定量PCR可以檢出這些極少量的細菌DNA，如何評價這些極少量細菌污染的血小板制品中，是否存在繁殖活躍的細菌，則可通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR進行細菌RNA檢測，由于細菌RNA在生長過程中會大量轉(zhuǎn)錄，而細菌死亡后，RNA會迅速被降解，很少殘留，因此活菌中RNA的檢出量會顯著高于DNA，即Ct (RNA) < Ct (DNA) ( Ct (內(nèi)參)，而死菌中RNA的檢出量會小于DNA，甚至是內(nèi)參。
[0031]所用試劑和儀器:選用第①套引物和探針，CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA, CR7-R 下游引物為 TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，CR6_probe 探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，內(nèi)參為 GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA，內(nèi)參探針為HEX- CTGCTTGGAACTG-BHQ1,引物、探針和內(nèi)參均在上海生工合成。PCR反應(yīng)試劑為國產(chǎn)近岸生物產(chǎn)品，雙蒸水，TE緩沖液，ABI 7500熒光定量PCR儀，國產(chǎn)基因組DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒，qPCR用8聯(lián)管耗材。
[0032]樣本:人全血樣本、大腸桿菌、芽孢桿菌。
[0033]實施例一:CR5_F和CR7-R引物對細菌和人基因組的特異性干粉引物和探針用TE緩沖液溶解到10 μ M ;人基因組DNA和細菌基因組DNA用試劑盒進行提取，并用微量分光光度計進行定量；常規(guī)PCR進行擴增，30 μ L反應(yīng)體系，包括:
2Χ 預(yù)混 PCR Mix Buffer15 μ L
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
基因組模板(50?10ng)I UL
雙蒸水補足12 μ L0
[0034]反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性，5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；最后72°C孵育5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，記錄結(jié)果，如圖4顯示，這對引物只擴增細菌基因組，對人類基因組沒有特異性。
[0035]實施例二:熒光定量PCR檢測細菌DNA
實施例并沒有使用血小板制品樣本進行檢測，而是用人全血基因組和細菌基因組單獨或混合來模擬，以人基因組作為陰性對照，以人基因組混合梯度稀釋的細菌基因組作為檢測樣本，進行熒光定量PCR檢測，30 μ L反應(yīng)體系，包括:
2Χ 預(yù)混 PCR Mix Buffer15 μ L
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
0?6-?1"必6探針(1(^]\00.5 μ L
內(nèi)參探針(10 μ Μ)0.5 yL
基因組模板(50?10ng)I UL
人工內(nèi)參(稀釋至約100拷貝) I yL 雙蒸水補足10 μ L0
[0036]反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性，2min ;95°C變性20s，60°C退火、延伸及熒光檢測lmin，共進行40個循環(huán)。結(jié)果如圖5顯示，CR6-pix)be探針只在檢測樣本中有信號(圖中①-④)，在陰性對照中無信號，而內(nèi)參探針在所有樣本中均有熒光信號(圖中⑤)，說明無論是檢測探針還是內(nèi)參探針都有很好的特異性。
[0037]實施例三:人工內(nèi)參的檢測限與樣本檢測Ct值間的差異與判讀
在該實施例中，人工內(nèi)參由基因合成每OD約33ug的量，人工內(nèi)參的分子數(shù)為38881.9，換算成拷貝數(shù)進行梯度稀釋，通過熒光定量PCR可以確定在本實施例條件下(包括試劑，耗材，儀器，操作等因素)，能檢測的內(nèi)參最低限是20拷貝數(shù)。培養(yǎng)的大腸桿菌用可見光分光光度檢測其OD6tltl值，在OD6qq=L O時，ImL培養(yǎng)液中約有6.3xl08個活菌，進行相應(yīng)的梯度稀釋，拿50 μ L稀釋液在95°C裂解20分鐘，離心后取I μ L稀釋液作為模版進行熒光定量PCR檢測，最后可檢測的細菌最小范圍是5?15個菌/mL濃度。人工內(nèi)參的檢測限與樣本檢測Ct值的差異與判讀的結(jié)果如圖6所示:1、細菌量濃度>25個/mL時，Ct (檢測)明顯小于Ct (內(nèi)參)，表明在實施例條件下，檢測結(jié)果是可保證的；2、細菌量濃度在15個/mL、10個/mL時，Ct (檢測)和Ct (內(nèi)參)差異不明顯，表明在該實驗條件下，樣本中細菌載量接近最低檢測限，結(jié)果可設(shè)為疑似或排除；而細菌量濃度在5個/mL時，Ct (檢測)大于Ct (內(nèi)參)，結(jié)果可排除為假陽性。
[0038]實施例四:反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測細菌RNA 在目前血小板輸注實踐中，并不可能要求血小板制品完全無菌，因為通過FDA認證的檢測系統(tǒng)，它們的細菌最低檢出限都達不到10個菌/mL，比如Bact/ALERT和PalleBDS的細菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，檢測限在12?13個菌/mL范圍，而基于免疫方法的PGD檢測試紙條的檢測限要> 13個菌/mL。而從實施例三可以看出熒光定量PCR核酸檢測細菌的最低檢出限很容易達到12個菌/mL范圍內(nèi)，由此更可以說明人工內(nèi)參的重要作用，它可以根據(jù)實際情況進行閾值設(shè)定幫助判讀樣品檢測結(jié)果。本發(fā)明還提出通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測細菌RNA，可對一些細菌載量在12個菌/mL范圍的樣品進行細菌活性評估。
[0039]同實施例三一樣，對培養(yǎng)的大腸桿菌進行濃度測定，梯度稀釋后取兩份含12個菌左右的100 μ L樣品，其中一份樣品在70°C下孵育30min使細菌完全死亡，然后分別提取兩份樣品的總RNA，作為模版進行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測，同時以相同菌數(shù)的樣本DNA作為陽性對照，50 μ L反應(yīng)體系，包括:
1X one step RT-PCR Buffer5 μ L
dNTPs (1mM)4 yL
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
0?6-?1"必6探針(1(^]\00.5 μ L
內(nèi)參探針(ΙΟμΜ)0.5 μ L
總 RNA (100 ?300ng)I μ L
人工內(nèi)參(稀釋至約100拷貝)I yL
反轉(zhuǎn)錄酶I μ L
Taq 酶IyL
雙蒸水補足34 μ L0
[0040]反應(yīng)條件:42°C反轉(zhuǎn)錄，50min ;75°C終止反轉(zhuǎn)錄，15min ;95°C預(yù)變性，2min ；95°C變性20s，60°C退火、延伸及熒光檢測lmin，共進行40個循環(huán)。結(jié)果如圖7顯示，未經(jīng)處理就提取RNA的樣本，可以檢測到熒光信號，其Ct (檢測)明顯小于Ct (內(nèi)參);而經(jīng)過滅活處理后提取的RNA樣本中，其Ct (檢測)值大于Ct (內(nèi)參)；陽性對照樣本Ct (檢測)處于兩個RNA樣本的Ct (檢測)值之間。說明滅活后的細菌，其RNA會迅速降解，在反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測中可能測不出或者得到很大的Ct值。
[0041]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法采用一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，所述第一條熒光探針是用于檢測細菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴增技術(shù)進行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6_probe探針，所述 CR6-probe 探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 202 bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR6-F上游引物和CR8-R下游引物，所述CR6-F上游引物為TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R下游引物為GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一條熒光探針為CR7-probe探針，所述CR7-probe 探針為 6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 291 bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR7-F上游引物和CR9-R下游引物，所述CR7-F上游引物為GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R下游引物為TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一條熒光探針為CR8-probe探針，所述CR8-probe 探針為 6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為 243 bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為23S3⑶-F上游引物和23S3⑶-R下游引物，所述23S3⑶-F上游引物為CTCAACGGATAAAAGITAC,所述 23S3CD-R 下游引物為 GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一條熒光探針為 23S3CD -probe 探針，所述 23S3CD -probe 探針為 6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT-BHQl，擴增產(chǎn)物大小為189 bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和所述一對檢測細菌的通用型引物完全匹配，中間80bp的序列和內(nèi)參探針是人工設(shè)計的，與任何細菌及人類基因組沒有任何相關(guān)性，所述人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)為5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補序列3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述人工內(nèi)參加入到檢測樣本中，可設(shè)為最低檢出限或任意閾值，也可作為標(biāo)準(zhǔn)品，具有對檢測結(jié)果提供質(zhì)控、判讀、定量參照功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法中通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測樣本中的RNA，與人工內(nèi)參和相應(yīng)DNA的Ct值進行比較，判斷細菌是否為活性菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372072SQ201410363658
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】蒙青林, 李勇, 田晶晶, 魏雙施, 王紅梅, 段生寶, 丁少華, 陳曄洲, 李冬 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所