條件型伊維菌素受體ivmr轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種條件型伊維菌素受體(ivermectin?receptor，IVMR)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于條件型動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。在Cre重組酶的作用下，該小鼠模型的所有細(xì)胞(特別是腦神經(jīng)元)中均能條件型的表達(dá)伊維菌素受體IVMR，通過施加藥物伊維菌素(ivermectin，IVM)可以下調(diào)表達(dá)伊維菌素受體IVMR的神經(jīng)元的興奮性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方法(包括給藥方式，針對(duì)使用特定表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠)對(duì)小鼠沒有任何腦部損傷。本發(fā)明使用的藥物伊維菌素IVM對(duì)動(dòng)物的影響具有足夠長的半衰期，適合進(jìn)行動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)。另外半衰期也相對(duì)穩(wěn)定，可以在藥物失效后再次實(shí)驗(yàn)，方便的對(duì)同一個(gè)動(dòng)物的進(jìn)行前后比較實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及條件型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，尤其是涉及一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及在神經(jīng)元功能研究中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵問題就是特定神經(jīng)元的活性(興奮性)與行為的因果關(guān)系。對(duì)這個(gè)問題，目前國際上已經(jīng)發(fā)展出了不少新的方法，比如，突觸傳遞的分子操作方法、光遺傳學(xué)方法和配體門控的離子通道方法。特別是已發(fā)展出用配體門控的離子通道用于可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的調(diào)控神經(jīng)元活性的方法。比如，果蠅Allatostatin受體在被Allatostatin激活的情況下，可以抑制神經(jīng)元的動(dòng)作電位的產(chǎn)生，這種方法已經(jīng)在哺乳動(dòng)物腦中開始使用。然而，Allatostatin這個(gè)分子不能透過血腦屏障，必須通過侵入性的方法(比如腦部打孔埋管)將其注射到腦中，這在進(jìn)行大規(guī)模動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)時(shí)就顯得很不方便。最近，一種工程化的GABAa受體已經(jīng)用來沉默特定的腦神經(jīng)元，特點(diǎn)是對(duì)藥物唑吡坦(zolpidem)不敏感。但是這個(gè)系統(tǒng)也有明顯的缺陷，就是必須在已經(jīng)表達(dá)GABAa Y 2亞基的神經(jīng)元中起作用。第三種能夠降低神經(jīng)元發(fā)放動(dòng)作電位的系統(tǒng)就是伊維菌素IVM門控的氯離子通道(該通道來源于線蟲谷氨酸氯離子通道GluCl α和β亞基)，已有報(bào)道顯示這種通道在小鼠腦中可以很好的起作用(Lerchner, ff.et al.2007.Reversiblesilencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted，ivermectin-gated Cl-channel.Neuron 54，35-49.)。但是，該系統(tǒng)的一個(gè)大的限制就是需要同時(shí)表達(dá)α和β 兩個(gè)亞基。為了克服這個(gè)問題，Lynagh等人將人源的甘氨酸α I受體進(jìn)行了 F207A和A288G兩個(gè)點(diǎn)突變，使該受體不再對(duì)甘氨酸敏感，而對(duì)伊維菌素IVM敏感(這個(gè)突變后的人甘氨酸α I受體被命名為伊維菌素受體IVMR)，這就提供了一種很好的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)沉默神經(jīng)元的工具(Lynagh, T.&Lynch, J.W.2010.An ImprovedIvermectin-activated Chloride Channel Receptor for Inhibiting ElectricalActivity in Defined Neuronal Populat1ns.J Bi。Chem 285,14890-14897)。但截至目前，國際上只有構(gòu)建表達(dá)伊維菌素受體IVMR受體的病毒進(jìn)行研究的報(bào)道，而將其制備為轉(zhuǎn)基因小鼠模型還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是為了針對(duì)現(xiàn)有缺乏伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的不足，而提供一種能夠更好的用于神經(jīng)元的活性對(duì)動(dòng)物行為的影響的研究的條件型(或稱誘導(dǎo)型)伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0004]將IVMR的序列整體插入到Rosa26基因位點(diǎn)的下游(該基因?yàn)橐粋€(gè)表達(dá)廣泛并且水平很強(qiáng)的基因)，緊接在一個(gè)1xP位點(diǎn)包圍的STOP元件后面。接著將這樣的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，正負(fù)篩選、多次PCR進(jìn)行篩選完成同源重組的胚胎干細(xì)胞。再將陽性的胚胎干細(xì)胞移植進(jìn)母鼠的囊胚中，選取出生后嵌合水平最高的嵌合小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠可與Cre重組酶小鼠進(jìn)行交配或者在腦立體定位注入Cre表達(dá)病毒，這樣在特定的Cre重組酶的作用下，IVMR前面的STOP序列被剪切掉，IVMR得以在特定神經(jīng)元中表達(dá)出來。在Cre表達(dá)的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔給藥IVM即可激活I(lǐng)VMR，降低神經(jīng)元的活性。
[0005]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種條件型表達(dá)伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠的模型。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建條件型表達(dá)伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)將IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位點(diǎn)的下游，緊接在一個(gè)1xP位點(diǎn)包圍的STOP元件后面，構(gòu)建Rosa26-1VMR打靶載體；
[0008](2)將Rosa26-1VMR打靶載體電轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，經(jīng)過正負(fù)篩選和PCR篩選完成同源重組的胚胎干細(xì)胞；
[0009](3)將陽性的胚胎干細(xì)胞移植進(jìn)母鼠的囊胚中，選取出生的嵌合小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠；
[0010](4)將表達(dá)Cre重組酶的病毒經(jīng)立體定位注射進(jìn)IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，或者將特定神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶的小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，得到的雙陽性的子代小鼠，成功構(gòu)建條件型IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠；
[0011](5)對(duì)注射病毒或者特定神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠給藥伊維菌素IVM,降低特定神經(jīng)元的活性。
[0012]上述步驟(2)需要用到基因特異性引物鑒定篩選陽性的小鼠胚胎干細(xì)胞，步驟
(3)和(4)需要用到基因特異性引物鑒定陽性的IVMR和Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0013]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該小鼠模型在研究特定神經(jīng)元的活性與動(dòng)物行為之間關(guān)系的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明提供的條件型表達(dá)伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠的模型與以往技術(shù)相比的有益效果如下:
[0015]首先，與現(xiàn)有的構(gòu)建表達(dá)伊維菌素受體IVMR病毒的技術(shù)相比，本發(fā)明首次構(gòu)建成功伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，目前在國際上未見有報(bào)道。
[0016]其次，與其余能夠降低神經(jīng)元活性的技術(shù)方法相比，特別是現(xiàn)在國際上特別流行的光遺傳學(xué)技術(shù)(需要在腦部埋管插入光纖)相比，本發(fā)明的技術(shù)方法(包括給藥方式，針對(duì)使用特定表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠)對(duì)小鼠沒有任何腦部損傷。
[0017]最后，本發(fā)明使用的藥物伊維菌素IVM對(duì)動(dòng)物的影響具有足夠長的半衰期，適合進(jìn)行動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)。另外半衰期也相對(duì)穩(wěn)定，可以在藥物失效后再次實(shí)驗(yàn)，方便的對(duì)同一個(gè)動(dòng)物的進(jìn)行前后比較實(shí)驗(yàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為構(gòu)建IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠使用的基因打靶策略的示意圖；
[0019]圖2為PCR鑒定發(fā)生同源重組小鼠胚胎干細(xì)胞；
[0020]圖3為獲得IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠后使IVMR基因表達(dá)、神經(jīng)元活性下降的技術(shù)步驟和策略；
[0021]圖4為將表達(dá)Cre重組酶的病毒通過腦立體定位注射的方法注射到IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦后，使用IVMR基因的RNA原位雜交鑒定IVMR的表達(dá)情況；
[0022]圖5為將表達(dá)特定Cre重組酶(CamKII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)的CamKI1-Cre)的轉(zhuǎn)基因小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到雙陽性的CamKI1-Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，使用IVMR基因的RNA原位雜交鑒定IVMR的表達(dá)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024]實(shí)施例:
[0025]1、構(gòu)建IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的打靶載體
[0026]包含IVMR-2A-GFP基因序列的質(zhì)粒由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Joseph W.Lynch教授惠贈(zèng)，Rosa26-CAG打靶載體從美國Addgene網(wǎng)站購得。使用通用分子克隆的方法將IVMR-2A-GFP基因序列(GFP為綠色熒光蛋白，2A為自酶切序列，方便將IVMR和GFP蛋白分開)插入到Rosa26打靶載體的STOP位點(diǎn)后面，替換掉原始載體中的tdTomato序列，從而構(gòu)建成功包含IVMR基因的打靶載體，如圖1B所示，打靶載體⑶所用到的5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’arm)位于野生型Rosa26基因位點(diǎn)(A)的第一和第二外顯子(exon)之間。同源重組將打靶載體的兩個(gè)同源臂之間的基因序列插入至胚胎干細(xì)胞Rosa26基因位點(diǎn)的同源序列之間，包括CAG啟動(dòng)子、1xp包圍的STOP位點(diǎn)、IVMR-2A-GFP表達(dá)序列和多個(gè)篩選標(biāo)記等。其中，5’同源臂和3’同源臂鑒定引物也在圖1C上標(biāo)記出來。其中，該打靶載體含有1.1kb長的5’同源臂(5，arm)和4.3kb長的3’同源臂(3，arm)、CAG啟動(dòng)子、1xp包圍的STOP序列、IVMR-2A-GFP表達(dá)序列和用于篩選克隆用的PGK-NeoR和PGK_DTA_pA序列。
[0027]2、同源重組
[0028]接著將構(gòu)建好的打祀載體線性化后，通過Amaxa電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)到129/B6小鼠雜交第一代的胚胎干細(xì)胞系G442中。發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞可以表達(dá)Neo抗性基因，因此能夠在含有抗生素G418的培養(yǎng)液中存活下來；并且同源重組不會(huì)將PGK-DTA-pA序列整合進(jìn)干細(xì)胞的基因組里，所以干細(xì)胞不會(huì)被DTA的毒性所損傷。通過上述正負(fù)篩選的胚胎干細(xì)胞，進(jìn)一步提取它們的總基因組DNA，進(jìn)行同源臂的PCR鑒定。5’和3’同源臂的引物位點(diǎn)如圖1C下面5’ arm_F/R,3’ arm_F/R所示,引物序列如下:
[0029]5，arm-F:5，-CGCGGAACTCCATATATGGGCTATG-3，，如 SEQ ID NO:1 所示；
[0030]5，arm-R:5，-GGCTCCTCAGAGAGCCTCGGCTAG-3，，如 SEQ ID NO:2 所示；
[0031]3，arm-F:5/ -AGACCATTCTCAGTGGCTCAACAAC-3’，如 SEQ ID NO:3 所示；
[0032]3，arm-R:5，-ATTCGGCTATGACTGGGCACAACA-3，，如 SEQ ID NO:4 所示；
[0033]PCR鑒定的結(jié)果如圖2所示，5’和3’同源臂PCR均為陽性的胚胎干細(xì)胞為2、4、5、7和10號(hào)克隆。這表明，這五個(gè)克隆是經(jīng)過同源重組的胚胎干細(xì)胞。
[0034]3、囊胚注射與嵌合體獲得
[0035]選取5’和3’同源臂PCR均為陽性的4、5和10號(hào)胚胎干細(xì)胞克隆分別注射到C57BL/6J母鼠的囊胚中。其后這些經(jīng)過同源重組的胚胎干細(xì)胞和囊胚中的其他胚胎干細(xì)胞會(huì)整合在一起，發(fā)育成胚胎直到順利出生。由于129品系小鼠的皮毛是白色，C57BL/6J品系的皮毛是黑色的，再加上使用的4、5、10號(hào)胚胎干細(xì)胞克隆都是上述2個(gè)品系混合，所以出生的小鼠的皮毛呈黑白相間，稱為嵌合體小鼠。將嵌合體小鼠和C57BL/6J品系小鼠相交配，在子代小鼠用以下引物進(jìn)行PCR，鑒定為陽性的小鼠即為伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0036]WT-F:5，-TGCATAAAACCCCAGATGACTACC-3，，如 SEQ ID NO:5 所示；
[0037]WT-R:5，-GCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCT-3，，如 SEQ ID NO:6 所示；
[0038]IVMR-F:5，-TCGACCATGGTAATAGCGATGAC-3，，如 SEQ ID NO:7 所示；
[0039]進(jìn)行PCR鑒定時(shí)同時(shí)加入以上3個(gè)引物，PCR程序設(shè)定為:94°C預(yù)變性5分鐘，940C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸5分鐘，12°C保存。野生型小鼠的條帶為304bp，而IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的條帶為514bp。
[0040]到這一步為止，成功的構(gòu)建出IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，但在這種小鼠中，IVMR基因前面還有一個(gè)STOP序列，所以伊維菌素受體IVMR并不會(huì)表達(dá)。
[0041]4、條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
[0042]在構(gòu)建條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠可以有以下兩種策略(如圖3所示):A，使用Cre重組酶表達(dá)病毒(包括腺相關(guān)病毒AAV、慢病毒Lentivirus等)；B，使用特定Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠(以特定啟動(dòng)子序列表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠)。詳細(xì)來說，當(dāng)使用Cre重組酶表達(dá)病毒時(shí)(圖3A)，將麻醉后的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的頭固定在立體定位儀上，剪開頭皮暴露頭骨，用微型鉆頭在頭骨上的相應(yīng)位置(如紋狀體)打孔，使用玻璃毛細(xì)管將AAV病毒注射至紋狀體內(nèi)。另一種方法(圖3B)就是將特定Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠(如CamKII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠)與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠交配，在子代中通過PCR篩選Cre和IVMR雙陽性的小鼠即為Cre ； IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0043]篩選IVMR陽性的引物和PCR程序與上一步用到的WT_F，WT_R，IVMR-F相同。
[0044]篩選Cre陽性的弓丨物如下:
[0045]Cre-F:5，-TCGATGCAACGAGTGATGAG-3，，如 SEQ ID NO:8 所示；
[0046]Cre-R:5，-TCCATGAGTGAACGAACCTG-3，，如 SEQ ID NO:9 所示；
[0047]PCR程序設(shè)定為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，共30個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸5分鐘，12°C保存。野生型小鼠無條帶，Cre陽性小鼠的條帶為約400bp。
[0048]不論是通過病毒表達(dá)Cre重組酶還是通過與Cre重組酶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配表達(dá)Cre,都是為了將IVMR基因序列前面的STOP序列剪切掉，以使該伊維菌素受體IVMR順利表達(dá)出來。這樣成功獲得了條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0049]最后將伊維菌素IVM通過腹腔注射至在腦中注射過Cre表達(dá)病毒的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠以及Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠中，伊維菌素IVM在腦中激活伊維菌素受體IVMR，使神經(jīng)元的活性下降。
[0050]5、條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
[0051]進(jìn)行了兩種策略獲得的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定?；虻腞NA原位雜交是一種常用的檢測(cè)基因mRNA表達(dá)的方法。在IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠中注射表達(dá)Cre的AAV病毒7天后，將小鼠麻醉處死，用PBS和4% PFA先后灌注，4% PFA后固定，冰凍切片，進(jìn)行原位雜交，藍(lán)紫色信號(hào)即為雜交的陽性信號(hào)，表明該細(xì)胞表達(dá)伊維菌素受體IVMR的mRNA(圖4B)，而未注射Cre病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖4A)或是注射Cre病毒的野生型小鼠(圖4C)，都沒有IVMR的表達(dá)。另外，將CamKI1-Cre小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，獲得雙陽性子代小鼠CamKI1-Cre ；IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，將這種小鼠以上述相似的方法處死、灌注、切片，進(jìn)行IVMR基因的RNA原位雜交。在海馬和大腦皮質(zhì)廣泛區(qū)域均有原位雜交的陽性信號(hào)表達(dá)，這表明在CamKI1-Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠腦中的海馬和大腦皮質(zhì)中，均有較強(qiáng)的IVMR基因表達(dá)，如圖5所示，圖5中C Al:海馬CAl區(qū)；DG:海馬齒狀回；I_V1:大腦皮質(zhì)的分層。
[0052]上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0053]

【權(quán)利要求】
1.一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位點(diǎn)的下游，緊接在一個(gè)1xP位點(diǎn)包圍的STOP元件后面，構(gòu)建Rosa26-1VMR打靶載體； (2)將Rosa26-1VMR打靶載體電轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，經(jīng)過正負(fù)篩選和PCR篩選完成同源重組的胚胎干細(xì)胞； (3)將陽性的胚胎干細(xì)胞移植進(jìn)母鼠的囊胚中，選取出生的嵌合小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠； (4)將表達(dá)Cre重組酶的病毒經(jīng)立體定位注射進(jìn)IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，或者將特定神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶的小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，得到的雙陽性的子代小鼠，成功構(gòu)建條件型IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)~步驟(4)中分別進(jìn)一步包括對(duì)所獲得的小鼠利用特異基因擴(kuò)增引物進(jìn)行基因型鑒定。
3.一種采用權(quán)利要求1方法得到的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
4.一種采用權(quán)利要求1方法得到的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究腦神經(jīng)元活性下降與神經(jīng)元功能和動(dòng)物行為中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)注射病毒或者特定神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠給藥伊維菌素IVM，降低特定神經(jīng)元的活性。
【文檔編號(hào)】C12N15/89GK104131036SQ201410363847
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】丁玉強(qiáng), 胡玲, 張玲, 黃纓, 張磊, 宋寧寧 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)