一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，生產方法為混菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)法。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是以酶解豆粕與米糠為主料，添加適量的無機鹽，分裝后滅菌，接種與固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%的等體積丁酸梭菌TK2種子液和總重量5%的等體積凝結芽孢桿菌TQ33種子液，攪拌均勻后進行發(fā)酵。37℃發(fā)酵48h后，經50℃烘干、粉碎、過篩得到的丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33復合益生菌制劑中，混菌發(fā)酵中，丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌的互利共棲協同作用，更有效的分解豆粕中的抗營養(yǎng)因子，使發(fā)酵豆粕中的營養(yǎng)物質更加豐富、均衡，提供一種富含復合益生菌的高蛋白飼料。
【專利說明】一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，涉及一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法。
【背景技術】
[0002]丁酸梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，是人和動物腸道的正常菌群，也存在于土壤、奶酪和天然酸奶中；周身鞭毛，具運動性；芽孢偏心或次端生(內生)，呈圓形或橢圓形，無孢外壁和附屬絲。丁酸梭菌具有抵抗外界相對惡劣環(huán)境的理化性質，能耐高溫、耐儲存且穩(wěn)定性良好，在體內丁酸梭菌能耐受胃液、膽汁酸和消化液的作用；丁酸梭菌只對新生霉素、萬古霉素和四環(huán)素等少數抗生素敏感，對其他多種抗生素具有很強的耐藥性，具有良好的應用前景。
[0003]丁酸梭菌具有防止病原菌及腐敗菌在腸道內的異常增殖和促進腸道有益菌群增殖、發(fā)育的雙重作用，從而糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的產生；能增強宿主的免疫功能，促進動物的生長，改善動物的生產性能；可降解飼料，提高飼料營養(yǎng)、適口性等；在腸道內產生多種酶類、氨基酸、B族維生素和維生素K等，為宿主補充營養(yǎng)物質兼具其他保健功能；能分解有害物質，改善環(huán)境；其重要代謝產物丁酸是腸道上皮組織細胞再生、修復的主要營養(yǎng)物質。
[0004]凝結芽孢桿菌是一種呈桿狀，兩端鈍圓，兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陽性，芽孢端生，無鞭毛；最適生長溫度為45-50°C,最適pH值為6.6-7.0。凝結芽孢桿菌是被美國食品和藥品管理局(FDA)以及美國飼料監(jiān)察協會(AAFCO)規(guī)定允許飼喂的微生物種類，也是中、日、韓等多國公認的芽孢益生菌。
[0005]凝結芽孢桿菌發(fā)酵飼料也能提高其營養(yǎng)物質、適口性、飼料轉化率，同時產生苯乳酸等抑菌物質，提高飼料的儲存性及穩(wěn)定性；可替代抗生素作為動物生長促進劑，增強免疫，改善動物產品質量；產生胞外多糖，去除腸道內的活性氧，預防疾??；能產生芽孢，耐高溫、耐磨損及腸道內各種消化液的作用，調節(jié)腸道微生態(tài)平衡，補充機體營養(yǎng)物質等多種保健功能。
[0006]名稱為一種凝結芽孢桿菌及其發(fā)酵液和發(fā)酵方法及發(fā)酵液作為生物農藥的應用的發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01110313933.2，發(fā)明涉及一種凝結芽孢桿菌及該菌發(fā)酵獲得的發(fā)酵液作為農藥的應用，名稱為TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏編號為=CGMCCN0.5233，方法所用發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L:蛋白胨10.0、淀粉10.0、溶劑為水，pH7.2-7.4 ;發(fā)酵條件為:35-39°C搖瓶150-170r/min培養(yǎng)15-25h，按照發(fā)酵條件發(fā)酵后獲得發(fā)酵液。本發(fā)明從凝結芽孢桿菌TQ33發(fā)酵液中分離出一種抑制植物病原真菌的活性物質，其結構鑒定為苯乳酸，并且溫室盆栽實驗進一步驗證了苯乳酸對植物病原菌的抑制作用，這是首次從凝結芽孢桿菌中分離出苯乳酸這種抑制植物病原菌活性物質，為凝結芽孢桿菌應用于生物農藥，抑制植物病原菌生長等方面提供了實驗依據。
[0007]名稱為一種丁酸梭菌及丁酸梭菌飼料添加劑的生產方法，申請?zhí)枮?01110126498.2。發(fā)明涉及一種丁酸梭菌及丁酸梭菌飼料添加劑的生產方法，名稱為TK2，分類名稱Clostridium butyricum，保藏編號為:CGMCCN0.4729，保藏日期:2011年4月2日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，提供了一種生產方法為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)法。本發(fā)明中丁酸梭菌TK2菌株經過液體種子培養(yǎng)將凍藏菌種活化，再經優(yōu)化后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，并對其活菌濃度及芽孢濃度測定，用本方法生產的丁酸梭菌活菌數為4.35X 109cfu/g，芽孢轉化率85%，基于本菌種開發(fā)了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制劑生產方法。在丁酸梭菌單菌發(fā)酵后，培養(yǎng)基中含有特有的酸臭味。
[0008]目前，已有報道丁酸梭菌制劑的制備是通過固態(tài)發(fā)酵的方法獲得，都是以丁酸梭菌的單菌發(fā)酵為主，然而丁酸梭菌是嚴格厭氧菌且對營養(yǎng)物質要求較高，丁酸梭菌單據發(fā)酵增加其對厭氧設備的需求，且發(fā)酵初期啟動困難、易染菌。單菌發(fā)酵中，可增加丁酸梭菌的接種量以利于發(fā)酵的啟動，而接種量的增大又會引發(fā)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量高、通氣和干燥困難等一系列問題。通過混菌固態(tài)發(fā)酵制備丁酸梭菌復合益生菌制劑卻少見報道。在混菌固態(tài)發(fā)酵中，菌株間的互利共棲協同作用，能提高產率和菌體濃度；多菌株的產酶、產酸和產營養(yǎng)物質能力、對基質的分解能力等要顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵?；炀虘B(tài)發(fā)酵還具有獲得純種發(fā)酵無法獲得的產物，生長速度快，對底物利用率高，可多級轉化，發(fā)酵后的微生物群體穩(wěn)定，省工節(jié)能，簡化工藝及發(fā)酵設備和易控制等諸多優(yōu)點，且不易染菌。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對現有技術的不足之處，提供一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法?；炀l(fā)酵中兩種菌株相互促進生長，凝結芽孢桿菌能為丁酸梭菌的生長提供嚴格的厭氧環(huán)境及豐富的營養(yǎng)物質，丁酸梭菌則為凝結芽孢桿菌提供維生素等生長因子；提供一種富含益生菌的高蛋白飼料；制得的復合益生菌制劑含有高數量的丁酸梭菌及凝結芽孢桿菌活菌數，兼具兩種益生菌的所有益處，能更好的促進動物生長，增強機體免疫，改善禽、畜、漁、 蛋、奶等產品的質量，打破國際貿易的“綠色壁壘”;此外，凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸具顯著的抑菌作用，能提高復合益生菌制劑的穩(wěn)定性及儲存性。
[0010]另外，丁酸梭菌產生的丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸和凝結芽孢桿菌能夠產生的乳酸等有機小分子酸在產生部位直接被吸收，還能調節(jié)腸道PH，刺激腸道蠕動，改善腸道微環(huán)境，抑制病原菌的增殖而調節(jié)腸道微生態(tài)平衡，以治療相關疾病。其中，丁酸在預防與治療相關腸炎、腸癌中起積極作用，因其是結腸上皮細胞能量代謝和正常生長主要的營養(yǎng)物質，能量供應的不充分是導致結腸炎的主要原因之一；丁酸及其鹽類還具有促進癌細胞凋亡和在體外抑制癌細胞的增殖，從而在體內能抵抗相關的癌癥。
[0011]本發(fā)明實現目的的技術方案如下:
[0012]一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，具體步驟如下:
[0013]滅菌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量的10%_15%接種丁酸梭菌種子液和按其重量的2%_5%接種凝結芽孢桿菌種子液；
[0014]不透氣材料封口于發(fā)酵容器，37 ± I °C條件下培養(yǎng)46_50h。發(fā)酵完畢后，在不高于60°C下烘干，粉碎，過篩，即成為丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌復合益生菌制劑產品。
[0015]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比為:酶解豆柏30-35、米糠5-10、MgSO4.7Η200.06-0.12,MnSO4.7Η200.06-0.12、加水至 100%，每 IOOmL 三角瓶裝量為 50_80g(發(fā)酵容器裝量系數0.5-0.8)，pH自然。
[0016]所述酶解豆柏的制備方法為:豆柏加水重量比為1:2，中性蛋白酶用量1000u每克豆柏，酶解3h。所用中性蛋白酶ZDB-G-20購自天津諾奧科技發(fā)展有限公司。
[0017]所述丁酸梭菌為CGMCC N0.4729 ；
[0018]所述凝結芽孢桿菌CGMCC N0.5233
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0020]1、本發(fā)明解決了傳統(tǒng)丁酸梭菌制劑制備過程中的資源浪費及廢水處理的問題。傳統(tǒng)的丁酸梭菌制劑是通過液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后固液分離獲得菌體，加以輔料，冷凍干燥或低熱干燥制得的，而丁酸梭菌產生的揮發(fā)性短鏈脂肪酸、消化酶、維生素和天然促生長因子等均存在于廢水中，造成資源浪費且廢水處理困難。
[0021]2、本發(fā)明采用混菌固態(tài)發(fā)酵法制備復合益生菌制劑，與原液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵能耗小、培養(yǎng)基來源廣泛、設備相對簡單、產物濃度高，具有投資少、操作簡單、物質損耗小、能耗低、發(fā)酵管理簡單的優(yōu)勢。
[0022]3、本發(fā)明中的丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌非厭氧發(fā)酵。由于丁酸梭菌的生長、增殖需要嚴格的厭氧環(huán) 境及豐富的營養(yǎng)，丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌發(fā)酵過程中，利用凝結芽孢桿菌消耗周圍空間的氧氣，及其生命活動中對固態(tài)培養(yǎng)基的降解，為丁酸梭菌的生長提供嚴格的厭氧環(huán)境及豐富的營養(yǎng)物質，降低了對厭氧設備及培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的需求；丁酸梭菌產生的維生素能補充凝結芽孢桿菌生長所需的生長因子。
[0023]4、本發(fā)明是丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌發(fā)酵，微生物的相關酶的作用能有效的分解豆柏中的胰蛋白酶抑制劑、植酸、大豆凝血素、脲酶等多種抗營養(yǎng)因子，為動物提供一種富含丁酸梭菌、凝結芽孢桿菌復合益生菌的高蛋白飼料。
[0024]5、本發(fā)明解決了丁酸梭菌單菌發(fā)酵培養(yǎng)基中特有的酸臭味，因凝結芽孢桿菌能產生大量的乳酸等，使混菌固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基具有一定的芳香氣味，且酸度適宜。
[0025]6、本發(fā)明中，丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌發(fā)酵后的飼料可直接用于飼喂，便可降低能耗；也可以干粉形式作為產品，產品性能穩(wěn)定，因凝結芽孢桿菌產生苯乳酸而具更為良好的儲存性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1:混菌厭氧發(fā)酵中凝結芽孢桿菌TQ33接種量對丁酸梭菌TK2生長的影響
[0027]圖2:混菌厭氧發(fā)酵中凝結芽孢桿菌TQ33接種量對凝結芽孢桿菌TQ33生長的影響
[0028]圖3:混菌非厭氧發(fā)酵中凝結芽孢桿菌TQ33接種量對丁酸梭菌TK2生長的影響
[0029]圖4:混菌非厭氧發(fā)酵中凝結芽孢桿菌TQ33接種量對凝結芽孢桿菌TQ33生長的影響
【具體實施方式】
[0030]下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。[0031]一種丁酸梭菌TK2,分類名稱Clostridium butyricum,保藏編號為:CGMCCN0.4729，保藏日期:2011年4月2日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0032]一種凝結芽孢桿菌TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏編號為:CGMCCN0.5233，保藏日期:2011年9月9日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0033]丁酸梭菌TK2液體活化及種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖5-10、胰蛋白胨5_15、酵母膏 2-6、K2HP043-7、MgSO4.7Η200.1-0.5、MnSO4.H2O0.1-0.5、溶劑為水，ρΗ7.2-7.4，培養(yǎng)溫度為37±1°C，厭氧培養(yǎng)18-22h。凝結芽孢桿菌TQ33種子培養(yǎng)基為(g/L):酵母膏5_15，葡萄糖 40-60，蛋白胨 5-15，MgSO4.7Η200.1-0.5，ρΗ6.8-7.2，培養(yǎng)溫度為 37± 1°C，160_200r/min搖床培養(yǎng)18-22h。
[0034]1、丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33種子的培養(yǎng) [0035]實施例1
[0036]丁酸梭菌活化及種子液培養(yǎng)基的配置(g/L):葡萄糖8、胰蛋白胨10、酵母膏4、K2HP045、MgSO4.7H200.2、MnSO4.H2O0.2、溶劑為水，pH7.4?；罨囵B(yǎng)基用試管分裝，每支試管裝量IOmL ;種子培養(yǎng)基用50mL平底燒瓶分裝，每瓶裝量為40mL，121°C滅菌20min。
[0037]將甘油管凍藏的菌種接到活化培養(yǎng)基中，37°C靜置厭氧培養(yǎng)18h ;活化后的丁酸梭菌TK2接種到種子培養(yǎng)基，接種量為5%，37°C厭氧培養(yǎng)24h。
[0038]實施例2
[0039]凝結芽孢桿菌TQ33種子培養(yǎng)基的配置(g/L):酵母膏10，葡萄糖60，蛋白胨10，MgSO4.7Η200.5，溶劑為水，ρΗ7.2，每250mL三角瓶分裝50mL種子培養(yǎng)基，115°C滅菌20min。
[0040]將試管斜面保存的凝結芽孢桿菌TQ33接種到種子培養(yǎng)基中，接種量為I~3環(huán)，370C、180r/min 震蕩培養(yǎng) 20h。
[0041 ] 2、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配置
[0042]實施例3
[0043]酶解豆柏的制備:豆柏加水重量比為1:2，中性蛋白酶用量1000u每克豆柏，酶解3h。所用中性蛋白酶ZDB-G-20購自天津諾奧科技發(fā)展有限公司。
[0044]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配置:酶解豆柏33.1、米糠6.6、MgSO4.7H200.12、MnSO4.7H200.12、加水至100%，每IOOmL三角瓶裝量為70g，pH自然。先用水溶解無機鹽，再邊攪拌邊依次加入酶解豆柏、米糠，最終使其混合均勻，分裝后滅菌，121°C滅菌20min。
[0045]3、凝結芽孢桿菌TQ33的不同接種量對混菌固態(tài)厭氧發(fā)酵的影響
[0046]實施例4
[0047]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的2%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液1.4mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加牛皮紙封口，放入厭氧培養(yǎng)箱中，利用厭氧設備抽放氣三次，用N2置換三角瓶中的空氣，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測；發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基于50°C烘干，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數再次進行檢測。
[0048]實驗結果:厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為3.77X 108CFU/g和2.83X 108CFU/g，芽孢率為75.07% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為2.75X 109CFU/g和5.45X 108CFU/g，芽孢率為19.82%。50°C烘干后丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為1.56X 109CFU/g和1.43X 109CFU/g，芽孢率為91.67% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為1.63X 109CFU/g和1.41 X 109CFU/g,芽孢率為86.50%。
[0049]實施例5
[0050]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的5%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液3.5mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加牛皮紙封口，放入厭氧培養(yǎng)箱中，利用厭氧設備抽放氣三次，用N2置換三角瓶中的空氣，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測。
[0051]實驗結果:厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為
1.63X 108CFU/g和1.12X 108CFU/g，芽孢率為68.71% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為 3.15 X 109CFU/g 和 4.72 X 108CFU/g,芽孢率為 14.98%。
[0052]實施例6
[0053]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的8%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液5.6mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加牛皮紙封口，放入厭氧培養(yǎng)箱中，利用厭氧設備抽放氣三次，用N2置換三角瓶中的空氣，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測。
[0054]實驗結果:厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為8.40X 107CFU/g和5.12X10 7CFU/g,芽孢率為60.95% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為 3.31 X 109CFU/g 和 3.25X 108CFU/g,芽孢率為 9.82%。
[0055]4、凝結芽孢桿菌TQ33的不同接種量對混菌固態(tài)非厭氧發(fā)酵的影響
[0056]實施例7
[0057]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的2%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液1.4mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加一次性防滑聚乙烯手套雙層(不透氣材料)封口，無需抽換氣體，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測；發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基于50°C烘干，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數再次進行檢測。
[0058]實驗結果:非厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為
2.70X 108CFU/g和1.92X 108CFU/g，芽孢率為71.11% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為1.48X 109CFU/g和3.85 X 108CFU/g，芽孢率為26.01%。50°C烘干后丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為1.09 X 109CFU/g和1.02 X 109CFU/g,芽孢率為93.58% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為2.38X 109CFU/g和2.09X 109CFU/g，芽孢率為87.82%。
[0059]實施例8
[0060]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的5%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液3.5mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加一次性防滑聚乙烯手套雙層(不透氣材料)封口，無需抽換氣體，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測。
[0061]實驗結果:非厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為1.18 X 108CFU/g和8.05 X 107CFU/g,芽孢率為68.22% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為 1.67X 109CFU/g 和 2.49 X 108CFU/g，芽孢率為 14.91%。
[0062]實施例9[0063]按照固態(tài)培養(yǎng)基總重量的10%，等體積的接入丁酸梭菌TK2種子液7mL ;按固態(tài)培養(yǎng)基總重量的8%，等體積接入凝結芽孢桿菌TQ33種子液5.6mL。用玻璃棒攪拌均勻并使其集中堆放在三角瓶瓶底，紗布塞加一次性防滑聚乙烯手套雙層(不透氣材料)封口，無需抽換氣體，37°C條件下培養(yǎng)48h，對丁酸梭菌TK2及凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數進行檢測。
[0064]實驗結果:非厭氧發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為
5.66X107CFU/g和3.17X 107CFU/g，芽孢率為56.00% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為 2.69X 109CFU/g 和 3.30 X 108CFU/g，芽孢率為 12.27%。
[0065]檢測與對比:
[0066]一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于:丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33混菌固態(tài)發(fā)酵中，凝結芽孢桿菌TQ33的接種量對其發(fā)酵效果具有一定的影響。當丁酸梭菌TK2的接種量為10%，及凝結芽孢桿菌TQ33的接種量為2%的時候，丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數最高，同時凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數也適宜。
[0067]一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33厭氧混菌固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基經50°C烘干、粉碎、過篩得到的丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33復合益生菌制劑中，丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為1.56X 109CFU/g和1.43X 109CFU/g，芽孢率為91.67% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為1.63 X IO9CFU/g 和 1.41 X 109CFU/g,芽孢率為 86.50%。
[0068]一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33非厭氧混菌固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基經50°C烘干、粉碎、過篩得到的丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33復合益生菌制劑中，丁酸梭菌TK2的活菌數及芽孢數為1.09X 109CFU/g和
1.02X 109CFU/g，芽孢率為93.58% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為2.38 X IO9CFU/g 和 2.09X 109CFU/g,芽孢率為 87.82%。
[0069]丁酸梭菌TK2與凝結芽孢桿菌TQ33非厭氧混菌發(fā)酵所得的復合益生菌制劑雖不及混菌厭氧發(fā)酵的效果好，但數量級基本一致，且發(fā)酵過程中不需要厭氧環(huán)境，極大程度的降低了生產成本；相比于國內丁酸梭菌的固態(tài)研究而言，活菌數及芽孢數基本相當，最重要的是本發(fā)明可不需要厭氧培養(yǎng)，復合益生菌制劑中含有丁酸梭菌TK2和凝結芽孢桿菌TQ33復合芽孢益生菌，能改善禽畜漁等產品的質量，打破國際貿易的“綠色壁壘”，且凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸具有優(yōu)良的防腐(抑菌)功能，保證該復合制劑具有良好的穩(wěn)定性及儲存性。
【權利要求】
1.一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵飼料，由以下方法制得，滅菌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量的10%-15%接種丁酸梭菌種子液和按其重量的2%-5%接種凝結芽孢桿菌種子液；不透氣材料封口于發(fā)酵容器，37土1°C條件下培養(yǎng)46-50h。發(fā)酵完畢后，在不高于60°C下烘干，粉碎，過篩，即成為丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌復合益生菌制劑產品。
2.一種丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，具體步驟如下: 滅菌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量的10%_15%接種丁酸梭菌種子液和按其重量的2%-5%接種凝結芽孢桿菌種子液；不透氣材料封口于發(fā)酵容器，37±1°C條件下培養(yǎng)46-50h。發(fā)酵完畢后，在不高于60°C下烘干，粉碎，過篩，即成為丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌復合益生菌制劑產品。
3.根據權利要求2所述丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比為:酶解豆柏30-35、米糠5-10、MgSO4.7H200.06-0.12、MnSO4.7Η200. 06-0.12、加水至 100%。
4.根據權利要求2所述丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于所述丁酸梭菌為 CGMCC N0.4729。
5.根據權利要求2所述丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于所述和凝結芽孢桿菌CGMCC N0.5233。
6.根據權利要求2-5所述丁酸梭菌與凝結芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵飼料，所述混菌固態(tài)發(fā)酵飼料中丁酸梭菌ΤΚ2的活菌數及芽孢數為1.09Χ 109CFU/g和1.02X 109CFU/g，芽孢率為93.58% ;凝結芽孢桿菌TQ33的活菌數及芽孢數為2.38X 109CFU/g和2.09X 109CFU/g，芽孢率為87.82%。
【文檔編號】C12R1/145GK103627656SQ201310546125
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權日:2013年11月6日
【發(fā)明者】王海寬, 路福平, 張善亭 申請人:天津科技大學