專(zhuān)利名稱(chēng)：重組幽門(mén)螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組幽門(mén)螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途。
背景技術(shù)：
幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤的發(fā)生亦密切相關(guān)。此外，血清流行病學(xué)研究表明Hp感染與循環(huán)、呼吸、胃十二指腸外消化系統(tǒng)疾病以及自身免疫疾病的發(fā)生也有關(guān)。隨著Hp病因地位的上升，對(duì)其致病機(jī)制的研究亦趨深入，Hp的致病機(jī)制包括諸多環(huán)節(jié)，但尤以其黏附機(jī)制最為關(guān)鍵，因?yàn)镠p必須首先定植于人胃黏膜才能進(jìn)一步發(fā)揮其致病作用，而黏附又是Hp定植在胃黏膜表面的前提。
既然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃十二指腸潰瘍是傳染病，治療目的之一就是用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進(jìn)行單獨(dú)治療已被證實(shí)并不令人滿意，因?yàn)樯踔猎谶@種情況下僅有0-15％病例會(huì)根除細(xì)菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結(jié)合使用達(dá)到最成功的治療效果，這種療法使清除率達(dá)80％(Malfertheiner，1994)。但用抗生素治療消除幽門(mén)螺桿菌并不是有前途的長(zhǎng)期治療方案，因?yàn)榧?xì)菌會(huì)迅速產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐性。
迄至已描述了幾種有潛力的幽門(mén)螺桿菌粘附素，并克隆了編碼所謂N-乙酰神經(jīng)氨基乳粘-結(jié)合血凝集素的一種基因(hpaA)并進(jìn)行測(cè)序(Evans等，1993)。它是一種應(yīng)能識(shí)別上皮細(xì)胞上含唾液酸的受體的蛋白質(zhì)。
在Hp疫苗的研制過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)目前采用的基因重組抗原尿素酶、細(xì)胞空泡毒素、過(guò)氧化氫酶等，基本上著眼于阻斷Hp的毒力因素，而與Hp定植密切相關(guān)的黏附素評(píng)價(jià)較少。目前文獻(xiàn)報(bào)道的Hp黏附素較多，其中已經(jīng)證實(shí)的有四種，包括迄今為止唯一明確受體的Hp黏附素BabA，和經(jīng)體外黏附及其相應(yīng)抗體的抑制實(shí)驗(yàn)證明的黏附素AlpA、AlpB和HopZ；然而這四種黏附素并不是存在于所有菌株中，如BabA存在于CagA致病島陽(yáng)性的菌株中，而且它們?cè)诓煌木曛写嬖谝欢ǔ潭鹊淖儺?。Harry等早在1998就提出作為Hp疫苗的抗原成分應(yīng)是保守的，即不是特異的存在與某些菌株中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種運(yùn)用PCR技術(shù)克隆幽門(mén)螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對(duì)其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，提高抗血清可阻止幽門(mén)螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細(xì)胞的基因重組幽門(mén)螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號(hào)1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)它編碼一種能粘附人細(xì)胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個(gè)拷貝，(c)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；及(a)序列號(hào)1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細(xì)胞。
除了序列號(hào)1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)與該序列相應(yīng)的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號(hào)1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)的相應(yīng)核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細(xì)胞上、特別是人胃上皮細(xì)胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號(hào)1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長(zhǎng)度最好至少為45個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個(gè)拷貝的載體。該載體可以是最好在表達(dá)信號(hào)(啟動(dòng)子、操縱基因、增強(qiáng)子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質(zhì)粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質(zhì)粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細(xì)胞的載體(例如，質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞是原核細(xì)胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細(xì)胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。不過(guò)，另一方面，本發(fā)明的細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞(如酵母)、動(dòng)物或植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽最好能粘附人細(xì)胞，并且包括(a)序列號(hào)1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號(hào)1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過(guò)下述方法生產(chǎn)用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可用作免疫原來(lái)產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見(jiàn)藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門(mén)螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門(mén)螺桿菌感染。對(duì)治療應(yīng)用而言，將多肽或其片斷用于產(chǎn)生主動(dòng)疫苗，或?qū)⒖贵w用于產(chǎn)生被動(dòng)疫苗。
本發(fā)明具有運(yùn)用PCR技術(shù)克隆幽門(mén)螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對(duì)其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，提高抗血清可阻止幽門(mén)螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細(xì)胞和提高免疫原性及活性高和粘附功能高等優(yōu)點(diǎn)。
設(shè)計(jì)CB特異引物，通過(guò)DNA重組技術(shù)獲得四種(BabA)、AlpA、AlpB和HopZ的蛋白序列，黏附素保守區(qū)的結(jié)構(gòu)基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步表達(dá)保守區(qū)基因。構(gòu)建了四種黏附素共同保守區(qū)的重組質(zhì)粒，測(cè)序顯示CB基因長(zhǎng)588bp；該基因編碼195個(gè)氨基酸，與四種黏附素保守區(qū)的同源性均達(dá)50％以上，蛋白質(zhì)分子量約為22.5KD，顯示出了良好的抗原性和疏水性。分析了836767個(gè)序列，與其同源性達(dá)40％的均勻?yàn)镠p序列。蛋白電泳分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達(dá)相對(duì)分子量為22 500的蛋白，與預(yù)期分子量大小一致，凝膠自動(dòng)掃描分析，其重組黏附素保守區(qū)蛋白占菌體總蛋白的29.6％，其中可溶性表達(dá)占上清的21.9％，包涵體占沉淀的72.6％。
體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明幽門(mén)螺桿菌四種黏附素保守區(qū)CB是安全的，無(wú)或較少有導(dǎo)致人外周血T淋巴細(xì)胞凋亡作用；具有生物活性，能促進(jìn)幽門(mén)螺桿菌感染患者外周血淋巴細(xì)胞增殖，白細(xì)胞介素4水平的升高，從而提高患者清除幽門(mén)螺桿菌的免疫能力；具有免疫原性，可使小鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體(包括IgA和IgG)，其抗血清可阻止幽門(mén)螺桿菌對(duì)于人胃黏膜上皮細(xì)胞的黏附，可用于預(yù)防和治療幽門(mén)螺桿菌感染。表達(dá)幽門(mén)螺桿菌CB的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌口服疫苗的免疫治療作用的小鼠實(shí)驗(yàn)表明其可顯著提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4/CD8的比值，小腸液中可檢測(cè)大量分泌性特特異抗CB-IgA抗體，其4周根除率為53.3％，且無(wú)毒、副作用。


圖1是本發(fā)明的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖2是本發(fā)明的重阻質(zhì)粒PET-226(+)/CB的雙酶鑒定圖譜，圖3是本發(fā)明的CB重組蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖4是序列表。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)一步的詳述如圖1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號(hào)1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號(hào)1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長(zhǎng)度至少為45個(gè)核苷酸；(a)它編碼一種能粘附人細(xì)胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個(gè)拷貝，(c)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號(hào)1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細(xì)胞。產(chǎn)生多肽的方法，載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質(zhì)的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見(jiàn)藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來(lái)診斷幽門(mén)螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門(mén)螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
實(shí)施例1利用PCR技術(shù)擴(kuò)增黏附素共同保守區(qū)(命名為CB)基因，將其定向插入pET-22b(+)載體，在BL21(DE3)大腸桿菌中表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫印跡鑒定。
1.1、材料取菌株BL21(DE3)及質(zhì)粒pET-22b(+)(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供)；幽門(mén)螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院全軍消化研究所保存；限制性內(nèi)切酶NotI、NocI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司，TaqDNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/EcoR I+Hind III購(gòu)自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購(gòu)自Promega公司，測(cè)序質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，AlpA兔抗血清由Odenbreit S制備，Hp感染患者血清來(lái)自解放軍301醫(yī)院，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2、黏附素保守區(qū)DNA序列的確定利用ANTHEPROT V4.3c軟件分析已證實(shí)的Hp黏附素babA2的DNA序列，發(fā)現(xiàn)黏附素的babA2的C-端氨基酸存在保守區(qū)，選取AlpA的C-端結(jié)構(gòu)基因序列作為模板(命名為CB)。
1.3、Hp染色體DNA的提取固體培養(yǎng)基上刮取生長(zhǎng)良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。
1.4、質(zhì)粒的提取及純化質(zhì)粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]。
1.5、目的基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物，在其5’端加上合適的限制性酶切位點(diǎn)，由上海博亞公司合成。序列如下保守區(qū)15’-TG GCC ATG GAT AAC GCG CTC AAC AAT CAG-3’NcoI保守區(qū)25’-AG TGC GGC CGC GAA TGA ATA CCC ATA AGA-3’NotI熱啟動(dòng)法進(jìn)行PCR，95°變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。
1.6、DNA片段的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的鑒定詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]。質(zhì)粒和目的基因DNA經(jīng)NotI和NocI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。
1.7、序列測(cè)定及分析堿裂解法大量抽提經(jīng)雙酶切鑒定的重組克隆質(zhì)粒，用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。
1.8、誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳CB陽(yáng)性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9、免疫印跡分析參照文獻(xiàn)[1]2.1、保守區(qū)基因的擴(kuò)增PCR結(jié)果電泳分析發(fā)現(xiàn)在588bp左右有一條帶，大小與預(yù)計(jì)相符，見(jiàn)圖1。
2.2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和NocI雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質(zhì)粒命名為pET-22b(+)/AB。重組質(zhì)粒經(jīng)NotI和NocI雙酶切后電泳初步鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。
2.3、保守區(qū)基因片段的序列分析直接以重組質(zhì)粒pET-22b(+)/AB為模板進(jìn)行測(cè)序，得到了克隆片段的DNA序列，經(jīng)ANTHEPROT V4.3c軟件分析，與alpA的C-端結(jié)構(gòu)基因序列一致，與其它三種黏附素babA、alpB和hopZ的同源性分別為53％、75％和59％。
2.4、cb基因在大腸桿菌中的表達(dá)將CB陽(yáng)性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1％轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6-0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液和菌體超聲后的沉淀和上清以及純化的CB進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達(dá)相對(duì)分子量為22500的蛋白，與預(yù)期分子量大小一致，凝膠自動(dòng)掃描分析，CB占菌體總蛋白29.6％，其中可溶性表達(dá)占上清的21.9％，包涵體占沉淀的72.6％。
2.5、cb表達(dá)蛋白的免疫印跡分析用兔抗Hp黏附素之一的AlpA作一抗，在M，約22500處出現(xiàn)條陽(yáng)性反應(yīng)帶，而對(duì)照組免疫前兔血清無(wú)。用Hp陽(yáng)性患者血清作為一抗，正常人血清作為對(duì)照，也在同一位置處出現(xiàn)反應(yīng)帶；而正常人血清對(duì)照未見(jiàn)任何條帶。
實(shí)施例2構(gòu)建質(zhì)粒型載體用PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆幽門(mén)螺桿菌粘附素保守區(qū)，將其插入裸體質(zhì)粒中，并在大腸桿菌中表達(dá)。
實(shí)施例3載體表達(dá)的蛋白制備用于治療幽門(mén)螺桿菌相關(guān)性疾病的免疫原性、生物活性用途。
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權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號(hào)1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號(hào)1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權(quán)利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長(zhǎng)度至少為45個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)它編碼一種能粘附人細(xì)胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個(gè)拷貝，(c)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化。
5.多肽，其特征在于它由權(quán)利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號(hào)1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細(xì)胞。
7.產(chǎn)生權(quán)利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權(quán)利要求1～3之一的DNA分子或權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權(quán)利要求5～6之一的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求1～3之一的DNA分子、權(quán)利要求5～6之一的多肽或者權(quán)利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見(jiàn)藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來(lái)診斷幽門(mén)螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門(mén)螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
全文摘要
重組幽門(mén)螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號(hào)1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有運(yùn)用PCR技術(shù)克隆幽門(mén)螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對(duì)其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，提高抗血清可阻止幽門(mén)螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1654475SQ0310989
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者白楊, 張亞歷, 王繼德, 張振書(shū), 周殿元 申請(qǐng)人:南方醫(yī)院