本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、受損骨軟骨組織的修復(fù)，由于關(guān)節(jié)微環(huán)境的無血管性導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)和祖細(xì)胞的供應(yīng)受限，及關(guān)節(jié)軟骨有限的自我再生能力，具有極大挑戰(zhàn)性?；?d打印支架的方法可用于輔助骨軟骨組織再生，更易設(shè)計(jì)支架仿生結(jié)構(gòu)，根據(jù)骨軟骨特性定制的生物材料用于修復(fù)缺陷。骨軟骨支架的主要設(shè)計(jì)策略包括單層(均質(zhì))、雙層、多層(超過兩層)和梯度支架。3d打印直接墨水書寫技術(shù)(diw)通過簡單擠壓的方式滿足了對(duì)支架的孔道層次化需求，采用合適的打印墨水，可以便捷地定制從微米到毫米的孔結(jié)構(gòu)，并精確控制支架形狀。3d打印技術(shù)研究的重點(diǎn)是開發(fā)具有生物相容性、力學(xué)強(qiáng)度、剪切變稀性能的打印墨水，此外，墨水還應(yīng)具備打印適配性(包括形狀保真度、結(jié)構(gòu)分辨率、細(xì)胞存活率等)。

2、多材料擠壓技術(shù)普遍表現(xiàn)出較低的機(jī)械性能，一些研究已經(jīng)探索了將其他材料(如羥基磷灰石)與生物墨水結(jié)合起來，以增強(qiáng)3d打印支架的機(jī)械強(qiáng)度。有研究人員報(bào)道了一種組合3d生物打印策略，使聚合物-納米顆粒復(fù)合墨水和水凝膠生物墨水的多材料共擠出成為可能，該策略被認(rèn)為有希望以其當(dāng)前形式應(yīng)用于非承重骨。abudurehemanmaihemuti提出了一種基于冷水魚皮明膠的3d打印多孔多層支架用于骨關(guān)節(jié)軟骨再生，將冷水魚皮明膠與海藻酸鈉結(jié)合，以增加粘度、可打印性和機(jī)械強(qiáng)度。但這些支架需要交聯(lián)才能在室溫下保持穩(wěn)定，而且它們?cè)隗w內(nèi)仍不是完全替代骨組織的理想材料。

3、pickering乳液是一種采用具有界面潤濕性的納米膠體顆粒為穩(wěn)定劑制備的乳液，具有高穩(wěn)定性和低成本的優(yōu)點(diǎn)。pickering乳液穩(wěn)定性可達(dá)數(shù)年之久，且穩(wěn)定劑含量僅為1％，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)表面活性劑的用量(10％-40％)，因而避免了大量表面活性劑產(chǎn)生的毒副作用。用作穩(wěn)定劑的固體顆粒材料可采用天然高分子為基質(zhì)材料。pickering乳液具有天然剪切變稀能力，乳液模板會(huì)形成多級(jí)微結(jié)構(gòu)，可作為3d打印墨水，孔道結(jié)構(gòu)多層次，更加利于骨軟骨缺損修復(fù)。通過改變?nèi)橐哼B續(xù)相構(gòu)成，調(diào)節(jié)墨水粘度，延長打印時(shí)間，應(yīng)用于3d打印梯度支架促進(jìn)骨軟骨一體修復(fù)。

4、為了解決上述技術(shù)問題，一種粘度高、可打印性好、機(jī)械強(qiáng)度高，且打印時(shí)間更長的3d打印墨水及其制備方法是本領(lǐng)域急需的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于上述不足，本發(fā)明提出了一種以明膠復(fù)配pickering乳液制備3d打印墨水的方法，采用本發(fā)明制得的3d打印墨水具有更好的可打印性、打印時(shí)間窗口較長、成型性好、制備工藝簡單、條件溫和。原料魚、牛明膠、羥基磷灰石用量低，來源廣泛，成本低廉。由該墨水進(jìn)行3d打印制備的梯度生物支架安全無毒，孔道結(jié)構(gòu)多樣，有良好的穩(wěn)定性和可降解性，利用便捷的打印后交聯(lián)法可調(diào)節(jié)支架力學(xué)性能，可用于骨組織工程促進(jìn)骨軟骨一體修復(fù)。

2、本發(fā)明還提供了一種高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水的制備方法，以明膠納米顆粒與羥基磷灰石共為穩(wěn)定劑，形成雙顆粒穩(wěn)定的液滴界面，提高pickering乳液墨水的穩(wěn)定性。魚明膠的加入可調(diào)節(jié)墨水粘度，滿足打印時(shí)間窗口需求，其3d打印得到的梯度生物支架的孔壁表面形成雙納米粒子組成的微納形貌，可賦予生物支架孔壁表面促成骨、促軟骨生成等功能，具有良好的應(yīng)用前景。

3、本發(fā)明是通過如下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的：

4、本發(fā)明首先公開了一種高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水的制備方法，包括如下步驟：

5、將內(nèi)相體積比為75％-85％的連續(xù)相與分散相在10000～15000rpm條件下攪拌混合，即得高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水；其中：

6、所述連續(xù)相由蒸餾水、明膠分子、明膠納米顆粒(gnps)以及羥基磷灰石(ha)混合制得；

7、所述分散相為正己烷，苯，甲苯，對(duì)二甲苯和苯乙烯中的任一種。

8、進(jìn)一步地，所述羥基磷灰石(ha)由如下方法制得：

9、取0.74g?ca(oh)2溶于200ml去離子水中制成懸液，水浴鍋中磁力攪拌10min，緩慢滴加120ml?85％的磷酸溶液攪拌，同時(shí)測量混合溶液ph，待磷酸滴加完畢且ph保持不變后混合溶液室溫下陳化24h，烘干、燒結(jié)研磨，即得羥基磷灰石(ha)。

10、進(jìn)一步地，所述明膠納米顆粒(gnps)由如下方法制得：

11、取1.25g?b型明膠(即牛明膠)溶于25ml蒸餾水中，于50℃恒溫?cái)嚢栊纬擅髂z溶液，加入25ml丙酮，去掉上清液，將沉淀復(fù)溶于15ml蒸餾水中，并調(diào)節(jié)ph值為12.0，再次滴加丙酮直至產(chǎn)生沉淀物，然后向溶液中加入56mg京尼平繼續(xù)于50℃恒溫反應(yīng)3h，將反應(yīng)后的溶液在10000g的條件下冷凍離心30min，即得明膠納米顆粒(gnps)。

12、進(jìn)一步地，所述明膠分子由魚明膠與牛明膠混合而成；所述連續(xù)相中的魚明膠與牛明膠質(zhì)量比為1:3-4:0。

13、本發(fā)明還公開了一種根據(jù)任一上述的制備方法制得的高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水。

14、本發(fā)明還公開了一種根據(jù)上述高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水在梯度生物支架打印中的應(yīng)用，包括：

15、(1)設(shè)定3d打印模型及打印參數(shù)后，將高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水倒入注射器，在室溫下進(jìn)行3d打印，打印墨水從針頭擠出的過程中，pickering乳液墨水發(fā)生凝膠-溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)變，下層支架打印完成后更換墨水繼續(xù)進(jìn)行上層打印，得到成品；

16、(2)打印完成后，將成品浸泡在交聯(lián)劑中，浸泡6～24h，即得3d打印梯度生物支架。

17、進(jìn)一步地，步驟(1)所述打印參數(shù)包括：擠出速度和打印速度均為7～15mm/s、絲間距0.8～2mm、層高0.5～1.2mm、絲徑0.6～1.2mm，打印時(shí)擠出針頭的溫度控制在25～28℃，底板溫度控制在4～10℃。

18、進(jìn)一步地，步驟(2)所述交聯(lián)劑選自：京尼平或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺-n-羥基丁二酰亞胺中任意一種。

19、進(jìn)一步地，所述京尼平占明膠質(zhì)量的1％～5％，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞-n-羥基丁二酰亞胺占明膠質(zhì)量的15％～80％；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞-n-羥基丁二酰亞胺中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺質(zhì)量比為(1～2)：1。

20、本發(fā)明在整個(gè)連續(xù)相中以3-10mg/ml的明膠納米顆粒(gnps)和0-7mg/ml的羥基磷灰石(ha)共為穩(wěn)定劑，制備出具有優(yōu)異穩(wěn)定性的高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水。明膠分子鏈中具有豐富的羥基、羧基和氨基，可賦予pickering乳液墨水凝膠化特性，有助于其進(jìn)行功能化改性，但明膠分子在沒有交聯(lián)的情況下力學(xué)強(qiáng)度較差，無法與環(huán)境組織力學(xué)性能相匹配。因此，經(jīng)過打印后再進(jìn)行交聯(lián)，將基于明膠分子構(gòu)建的梯度支架進(jìn)行浸泡處理后，可顯著提升支架的力學(xué)性能。

21、本發(fā)明連續(xù)相中同時(shí)引入魚明膠和牛明膠，有利于調(diào)節(jié)墨水粘度，調(diào)控打印時(shí)間、延長打印窗口。通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)魚明膠與牛明膠的使用質(zhì)量比達(dá)到1:1時(shí)，乳液墨水的可打印性能更佳、同時(shí)成型性良好，形狀保真度強(qiáng)，在骨組織工程具有很好的應(yīng)用前景。

22、本發(fā)明的有益效果在于：

23、(1)本發(fā)明制備的高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水連續(xù)相中引入動(dòng)物明膠，可調(diào)控墨水粘度，延長可打印時(shí)間，滿足梯度打印所需時(shí)間要求。乳液墨水穩(wěn)定性好，具有優(yōu)異的可擠出特性、良好的成型性及形狀保真度。

24、(2)本發(fā)明制備的高內(nèi)相pickering乳液3d打印墨水以gnps和ha為穩(wěn)定劑，形成雙顆粒穩(wěn)定的液滴界面，提高pickering乳液墨水的穩(wěn)定性。明膠納米顆粒(gnps)具有良好的可潤濕性和穩(wěn)定性，pickering乳液的形成只需少量的明膠納米顆粒，ha的加入使墨水具有良好的剪切變稀特性，滿足可打印性需求。

25、(3)本發(fā)明制備的3d打印梯度生物支架是由所述pickering乳液3d打印墨水在室溫下進(jìn)行3d打印得到，改變魚明膠濃度、穩(wěn)定劑用量和打印參數(shù)可以精確調(diào)節(jié)支架的形狀保真度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

26、(4)本發(fā)明制備的3d打印梯度生物支架利用pickering乳液模板在支架內(nèi)部形成多級(jí)互通的孔道結(jié)構(gòu)，更有利于細(xì)胞的增殖和黏附。ha在凍干后沉積在內(nèi)部孔道表面，可與細(xì)胞直接接觸，促進(jìn)成骨分化。結(jié)合3d打印技術(shù)賦予支架從微米到毫米級(jí)的孔結(jié)構(gòu)，并達(dá)到個(gè)性化定制且快速成型的目的。

27、(5)本發(fā)明采用天然生物交聯(lián)劑京尼平對(duì)梯度支架進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)生物體有害的物質(zhì)，利用京尼平緩慢交聯(lián)的特性，提高3d打印梯度支架穩(wěn)定性和力學(xué)性能。

28、(6)本發(fā)明將pickering乳液墨水進(jìn)行3d打印得到梯度生物支架，具有良好的可打印性、打印時(shí)間窗口較長、成型性好、制備工藝簡單、條件溫和，原料用量低，來源廣泛，成本低廉；材料的毒性風(fēng)險(xiǎn)低，具有良好的穩(wěn)定性和可降解性；還具有較高的孔徑和可調(diào)的力學(xué)性能，能有效的促進(jìn)細(xì)胞向支架內(nèi)部增殖和粘附，具有較大的應(yīng)用推廣價(jià)值。