質(zhì)體A，所述脂質(zhì)體A為下述脂質(zhì)體：含有以前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子 及被覆該復(fù)合粒子的脂雙層膜的脂質(zhì)體，該脂雙層膜的構(gòu)成成分可溶于極性有機(jī)溶劑，該 脂雙層膜的構(gòu)成成分及該復(fù)合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機(jī)溶劑的液體中； 或者含有以含有陽離子性物質(zhì)的前導(dǎo)粒子和下述RNA為構(gòu)成成分的復(fù)合粒子及被覆該復(fù) 合粒子的脂雙層膜，該脂雙層膜以中性脂質(zhì)及水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物為構(gòu)成成分。其中，上述RNA含有與腫瘤或炎癥相關(guān)的靶基因mRNA的連續(xù) 15~30個(gè)堿基的序列（記為序列X1)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列（記為互補(bǔ)序列X/)， 并且與序列X1及互補(bǔ)序列X/的堿基鍵合的糖的總計(jì)1~90%為2'位上被修飾基團(tuán)取代 的核糖，。
[0216] 接下來，根據(jù)實(shí)施例及試驗(yàn)例，更具體地說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明不限于這些實(shí) 施例及試驗(yàn)例。
[0217][實(shí)施例1]
[0218] 實(shí)施例1中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的連續(xù)19個(gè)堿基的序列（以下記 為序列X2)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列（以下記為序列X2'）的雙鏈RNA[有義鏈：5' 一 GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdTdT- 3'（與帶有d的喊基鍵合的糖為脫氧核糖， 與從5'一端開始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的前綴為m的堿基鍵合的糖為2'一 0 - 甲基取代核糖）（序列號 1)、反義鏈；5' 一mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAHiCdTdT- 3'（與前綴為d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5' 一端開始的第1、3、5、7、9、11、13、15、 17、19個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列號2)](以下稱作2' 一OMeBCL2siRNAExp. 1)，與序列X2及互補(bǔ)序列X2'的堿基鍵合的核糖的總計(jì)50%為2' 一 0-甲基取代核糖。有義鏈及反義鏈均從Eurogentec公司（Belgium)獲得，通過退火制備 雙鏈RNA0
[0219]將DOTAP(AvantiPolarLipids公司制）/PEG-DSPE(日本油脂公司制）/蒸餾 水（大塚制藥公司制）按40mg/16mg/lmL混合，用禍流混合器振動(dòng)攪拌。將該懸池液于 70°C下通過0. 4ym的聚碳酸酯微孔濾膜（Costar公司制）10次、0. 2ym的聚碳酸酯微孔 濾膜（Whatman公司制）3次、0.Iym的聚碳酸酯微孔濾膜（Corning公司制）10次、再通過 0. 05ym的聚碳酸酯微孔濾膜（Whatman公司制）20次。采用動(dòng)態(tài)光散射法（DLS)測定所得 的前導(dǎo)粒子的平均粒徑，結(jié)果為73.Olnm。
[0220] 另一方面，將EPC(日本油脂公司制）/PEG-DSPE(日本油脂公司制）/乙醇（和 光純藥公司制）/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制備脂雙層膜的構(gòu)成成分的 溶液。
[0221] 將 0? 2917mL以 24mg/lmL混合 2' 一OMeBCL2siRNAExp. 1/ 水所得的水溶液混合 在0. 875mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加 到4. 667mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加I. 459mL蒸餾水，添加0. 4667mL脂雙 層膜的構(gòu)成成分的溶液后，緩緩加入54. 31mL蒸餾水，將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5%以下。對所 得的脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心（80分鐘，110,OOOXg，25°C)，除去上清液。用約5mL的生理 鹽水（大塚制藥公司制）使生成的沉淀再次懸濁。
[0222] 采用DLS測定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為92. 89nm。另外，進(jìn)行脂質(zhì)體內(nèi)2'一OMe BCL2siRNAExp. 1的定量，結(jié)果濃度為I. 2460mg/mL，相對于加入的2' 一OMeBCL2siRNA Exp. 1的量，回收率為88. 02%。最后添加3. 270mL生理鹽水將2' 一OMeBCL2siRNAExp. 1 濃度調(diào)節(jié)至〇? 75mg/mL，得到制劑。
[0223] 比較例1
[0224] 比較例1中使用的RNA是含有序列X2及互補(bǔ)序列X2'的雙鏈RNA[有義鏈：5' 一 GUGAAGUCAACAUGCCUGCdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖）（序列號 3)、反義鏈：5' 一GCAGGCAUGUUGACUUCACdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫 氧核糖）（序列號4)](以下稱為BCL2siRNACom. 1)。有義鏈及反義鏈均從Eurogentec公 司（Belgium)獲得，通過退火制備雙鏈RNA。
[0225] 與實(shí)施例1同樣地在0.5mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中混合24mg/mL的 BCL2siRNACom. 1水溶液0. 1667mL，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加到 2. 667mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加0. 8334mL蒸餾水，添加0. 2667mL脂雙層 膜的構(gòu)成成分的溶液后，緩緩加入31. 03mL蒸餾水將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5%以下。對所得的 脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心（80分鐘，110, 000Xg，25°C)，除去上清液。用約2mL的生理鹽 水（大塚制藥公司制）使生成的沉淀再次懸濁。
[0226] 采用DLS測定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為88. 31nm。另外，對脂質(zhì)體內(nèi)的BCL2siRNA Com. 1進(jìn)行定量，結(jié)果濃度為I. 7332mg/mL，相對于加入的BCL2siRNACom. 1的量，回收率為 90. 09%。最后添加0. 3232mL生理鹽水將BCL2siRNACom. 1濃度調(diào)節(jié)至I. 5mg/mL，得到制 劑。
[0227] 試驗(yàn)例1
[0228] 將200yL含有實(shí)施例1及比較例1中得到的制劑的藥液（siRNA濃度750yg/mL) 以7天的間隔通過尾靜脈給與雄性Balb/c小鼠（6周齡、日本CLEA) 2次（給藥量為150yg/ mouse)。第2次給藥后，通過尾動(dòng)脈在給藥0. 5、3、7及24小時(shí)后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血10yL， 添加90yL變性溶液（4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、0.lv/v% 2 -巰基乙醇、0. 5w/ v%N-月桂酰肌氨酸鈉；以下稱為D溶液）進(jìn)行混合，得到10v/v%血液。
[0229] 在實(shí)施例1中所得的制劑的給藥組的10v/v%血液的10yL中添加焦碳酸二乙酯 水溶液（以相對于超純水為〇.lv/V%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合）10yL、I.S.溶 液（將濃度為〇. 3ymol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I.S.) 10yL、D溶液100yL、 2mmol/L乙酸鈉（pH4. 0) 10yL及TE(IOmMTris-HClpH8. 0,ImMEDTA)飽和苯酚 / 氯仿溶 液（使用以1/1的容量比混合TE飽和苯酚和氯仿后的下層）150yL進(jìn)行混合，于4°C下、 以132000Xg離心10分鐘。在65yL上清液中添加15yLGenTLE溶液（被上述焦碳酸二 乙酯水溶液稀釋15倍的GenTLEprecipitationcarrier(TakaraBio))進(jìn)行混合后，添加 200yL乙醇進(jìn)行混合，于室溫下靜置10分鐘以上。于4°C下、132000Xg離心10分鐘后， 丟棄上清液，在沉淀中添加75v/v%乙醇200yL。于4°C下、以132000Xg離心15分鐘，丟 棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在100yL再溶解液（將焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇 /水以0. 1/0. 4/30/1000的容量比混合得到）中。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，將 上清液作為分析樣品，用HPLC法定量。結(jié)果示于圖1。
[0230] < 裝置 >
[0231] HPLC裝置：ACQUITYUPLC系統(tǒng)（Waters)
[0232]質(zhì)譜儀：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0233]分析軟件：AnalystI. 4. 2(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0234] <HPLC條件 >
[0235] 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（I.S.)
[0236] 5' 一GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖 為脫氧核糖，與從5' 一端開始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖 為2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列號5)
[0237] 5' 一mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的 糖為脫氧核糖，與從5' 一端開始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19個(gè)的帶有111的堿基鍵合 的糖為2' 一O-甲基取代的核糖）（序列號6)
[0238]柱：XbridgeC18 (3. 5ym、2.ImmI.D.X50mm、Waters)
[0239]預(yù)濾器：Xbridgeguardcartridge(3. 5um、2.ImmI.D.X10mm、Waters)
[0240]柱溫：65°C
[0241] 流動(dòng)相：三乙胺/六氟異丙醇/水（0.4/30/1000):甲醇=93:7~75:25
[0242]注入量：25yL
[0243] 檢測：質(zhì)譜儀（離子化法：電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度：500°C)
[0244] 在比較例1中得到的制劑給藥組的10v/v%血液的10yL中添加焦碳酸二乙酯水 溶液（以相對于超純水為〇.lv/V%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合）l〇yL、I.S.溶 液（將濃度為〇. 3ymol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I.S.) 10yL、D溶液100yL、 2mmol/L乙酸鈉（pH4. 0) 10yL及酸性飽和苯酚/氯仿溶液（使用以1/1的容量比混合酸 性飽和苯酚和氯仿后的下層）150yL進(jìn)行混合，于4°C下、以132000Xg離心10分鐘。在 65yL上清液中添加GenTLE溶液（用上述焦碳酸二乙酯水溶液將GenTLEprecipitation carrier(TakaraBio)稀釋15倍）15yL進(jìn)行混合，之后添加200yL乙醇混合，于室溫下靜 置10分鐘以上。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘后，丟棄上清液，在沉淀中添加75v/ v%乙醇200yL。于4°C下、以132000Xg離心15分鐘，丟棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在 100yL再溶解液（將焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇/水以0. 1/0. 4/30/1000的容 量比混合得到）中。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，以上清液作為分析樣品，用HPLC 法定量。結(jié)果示于圖2。
[0245]〈裝置〉
[0246]HPLC裝置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)
[0247]質(zhì)譜儀：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0248]分析軟件：AnalystI. 4. 2(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0249] <HPLC條件 >
[0250] 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（I.S.)
[0251] 5' 一GUGAAGUCAACAUGCCUGdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核 糖）（序列號7)
[0252] 5' 一CAGGCAUGUUGACUUCACdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核 糖）（序列號8)
[0253]柱：XbridgeC18 (3. 5ym、2.ImmI.D.X50mm、Waters)
[0254]預(yù)濾器：Xbridgeguardcartridge(3. 5um、2.ImmI.D.X10mm、Waters)
[0255]柱溫：65°C
[0256] 流動(dòng)相：三乙胺/六氟異丙醇/水（0. 4/30/1000):甲醇=93:7~75:25
[0257]注入量：25yL
[0258] 檢測：質(zhì)譜儀（離子化法：電噴霧離子，負(fù)離子，離子源溫度：500°C)
[0259] 本發(fā)明還提供一種簡便且精度良好的血液中的siRNA濃度的測定方法。作為本發(fā) 明的血液中siRNA濃度的測定方法，可以舉出以通過下述方法測定siRNA濃度為特征的血 液中siRNA濃度的測定方法，所述方法正如上述的試驗(yàn)例1具體說明的那樣，優(yōu)選在共存有 與被測定的siRNA具有不同堿基數(shù)的核酸作為IS的條件下，加入與核酸形成復(fù)合體的試 劑，例如加入GenTLE溶液使試液中的siRNA形成電中性的復(fù)合體，分離該復(fù)合體后，用再溶 解液溶解，采用高效液相色譜法分析所得的溶液。
[0260] 需要說明的是，血液中的siRNA濃度的測定不限于本發(fā)明的血液中的siRNA濃度 的測定方法，也可以按照常規(guī)方法測定血液中的siRNA濃度。
[0261] 圖1及圖2顯示，給與了實(shí)施例1中所得制劑的小鼠與給與了比較例1中所得制 劑的小鼠相比，RNA的血液中濃度推移較高。即，表明了與序列X及互補(bǔ)序列X'的堿基鍵 合的糖的總計(jì)1~90%為2'位上被修飾基團(tuán)取代的核糖的本發(fā)明的組合物的血中滯留性 被進(jìn)一步改善，能夠降低副作用或者增大藥物在含有靶基因表達(dá)部位的組織或臟器中的蓄 積。
[0262] [實(shí)施例2]
[0263] 實(shí)施例2中使用的RNA是含有BCL2基因mRNA的連續(xù)19個(gè)堿基的序列（以下記為 序列X3)及與該序列互補(bǔ)的堿基的序列（以下記為互補(bǔ)序列X3'）的雙鏈RNA[有義鏈：5'一 GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖， 與從5' 一端開始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2' 一 0 - 甲基取代核糖）（序列號 9)、反義鏈：5' 一mUUmGCmUGmAAmGAmUGmUCmACmUUHiCdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖，與從5'一端開始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列號10)](以下稱為2' 一 OMeBCL2siRNAExp. 2)，與序列X3及互補(bǔ)序列X3'的堿基鍵合的核糖的總計(jì)50%為2' 一 〇 -甲基取代核糖。有義鏈及反義鏈均從北海道SystemScience獲得，通過退火制備雙鏈 RNA0
[0264] 將DOTAP(AvantiPolarLipids公司制）/PEG-DSPE(日本油脂公司制）/蒸饋 水（大塚制藥公司制）按40mg/16mg/lmL混合，用禍流混合器振動(dòng)攪拌。將該懸池液于 70°C下通過0. 4ym的聚碳酸酯微孔濾膜（Costar公司制）10次、0. 2ym的聚碳酸酯微孔 濾膜（Whatman公司制）3次、0.Iym的聚碳酸酯微孔濾膜（Corning公司制）10次、再通過 0. 05ym的聚碳酸酯微孔濾膜（Whatman公司制）20次。采用動(dòng)態(tài)光散射法（DLS)測定所得 的前導(dǎo)粒子的平均粒徑，結(jié)果為70. 71nm。
[0265] 另一方面，將EPC(日本油脂公司制）/PEG_DSPE(日本油脂公司制）/乙醇（和光 純藥公司制）/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制備脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶 液。
[0266] 在0. 225mL所得的前導(dǎo)粒子的分散液中混合0. 075mL以24mg/ImL混合2 ' 一 OMeBCL2siRNAExp. 2/水所得的水溶液，制備復(fù)合粒子。將所得的復(fù)合粒子的分散液添加 至IJI. 2mL脂雙層膜的構(gòu)成成分的溶液中，接著添加0. 375mL蒸餾水，然后添加在40vol% 乙醇中按62. 5mg/62. 5mg/mL溶解有EPC/PEG-DSPE所得的溶液0. 12mL，之后，緩緩加入 13. 965mL蒸餾水，將乙醇的濃度調(diào)節(jié)至5vol%以下。對所得的脂質(zhì)體懸濁液進(jìn)行超離心 (80分鐘，110, 000Xg，25°C)，除去上清液。用生理鹽水（大塚制藥公司制）使生成的沉淀 再次懸濁。
[0267] 采用DLS測定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為88. 52nm。另外，對脂質(zhì)體內(nèi)的2'一OMe BCL2siRNAExp. 2進(jìn)行定量，結(jié)果濃度為2. 307mg/mL，相對于加入的2' 一OMeBCL2siRNA ￡叉口.2量，回收率為87.2%。最后添加0.36611^生理鹽水，將2'一(116 8(^2811?熟￡1口.2 濃度調(diào)至I. 5mg/mL，得到制劑。
[0268][實(shí)施例3]
[0269] 實(shí)施例3中使用的RNA，為含有序列X3及互補(bǔ)序列X3'的雙鏈RNA[有義鏈：5'一 GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖， 與從5' 一端開始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18個(gè)的帶有m的堿基鍵合的糖為2' 一 0 - 甲基取代核糖）（序列號11)、反義鏈：5' 一UUGCUGAAGAUGUCACUUCdTdT- 3'（與帶 有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖）（序列號12)](以下稱作2' 一OMeBCL2siRNAExp. 3)， 與序列X3及互補(bǔ)序列X3'的堿基鍵合的核糖的24%為2' 一 0 -甲基取代核糖。有義鏈及 反義鏈分別從北海道SystemScience獲得，通過退火制備雙鏈RNA。
[0270]除了用 2' 一OMeBCL2siRNAExp. 3 代替 2' 一OMeBCL2siRNAExp. 2 之外，與實(shí) 施例2同樣地得到制劑。
[0271] 采用DLS測定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為91. 42nm。
[0272] 比較例2
[0273] 比較例2中使用的RNA為含有序列X3及互補(bǔ)序列X3'的雙鏈RNA[有義鏈：5' 一 GAAGUGACAU⑶UCAGCAAdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫氧核糖）（序列號 13)、反義鏈：5' 一UUGCUGAAGAUGUCACUUCdTdT- 3'（與帶有d的堿基鍵合的糖為脫 氧核糖）（序列號14)](以下稱為BCL2siRNACom. 2)。有義鏈及反義鏈均從北海道System Science獲得，通過退火制備雙鏈RNA。
[0274]除了用BCL2siRNACom. 2 代替 2' 一OMeBCL2siRNAExp. 2 之外，與實(shí)施例 2 同樣 地得到制劑。
[0275] 采用DLS測定脂質(zhì)體的平均粒徑，結(jié)果為96. 52nm。
[0276] 試驗(yàn)例2
[0277] 將200yL含有實(shí)施例2、3及比較例2中所得制劑的藥液（siRNA濃度750yg/mL) 通過尾靜脈以7天的間隔給與雄性Balb/c小鼠（6周齡、日本CLEA) 2次（給藥量為150yg/ mouse)。給與2次后，通過尾動(dòng)脈在給藥0. 5、3、7及24小時(shí)后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血10yL，添 加90yL變性溶液（4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、lmmol/L二硫蘇糖醇、0. 5w/v% N-月桂酰肌氨酸鈉；以下稱為D溶液）進(jìn)行混合，得到10v/v%血液。
[0278] 在各給藥組的10v/v%血液的50yL中添加焦碳酸二乙酯水溶液（以相對于 超純水為0.lv/v%的容量添加焦碳酸二乙酯并進(jìn)行混合）5yL、I.S.溶液（將濃度為 0. 3ymol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作為I.S.) 10yL、D溶液50yL、2mmol/L乙酸鈉 (pH4. 0) 10yL及酸性飽和苯酚/氯仿溶液（使用以1/1的容量比混合酸性飽和苯酚和氯 仿后的下層）150yL進(jìn)行混合，于4°C下、以132000Xg離心10分鐘。在65yL上清液中添 加15yLGenTLE溶液（被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀釋15倍的GenTLEprecipitation carrier(TakaraBio))并進(jìn)行混合后，添加200yL乙醇進(jìn)行混合，在室溫下靜置10分鐘 以上。于4°C下、以132000Xg離心10分鐘后，丟棄上清液，在沉淀中添加75v/v%乙醇 200yL。于4°C下、以132000Xg離心15分鐘，丟棄上清液，風(fēng)干沉淀后，溶解在IOOyL再 溶解液（以〇. 1/0. 4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟異丙醇/水）中。 于4°C下、以132000Xg離心10分鐘，將上清液作為分析樣品，用HPLC法定量。結(jié)果分別示 于圖3~5。
[0279] < 裝置 >
[0280]HPLC裝置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)
[0281]質(zhì)譜儀：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[02