一種酚酰胺類化合物在防治腦損傷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A在制備諸如 治療缺血性腦中風(fēng)等藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦中風(fēng)(腦卒中）具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，嚴(yán)重威脅著人類的 健康。近幾年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國每年新發(fā)腦卒中病例約有200萬，死亡率約為發(fā) 病率的50%。其中缺血性腦卒中約占腦卒中總數(shù)的80%左右，是對人類健康危害最大的腦 血管疾病。目前對于缺血性腦中風(fēng)，除t-PA溶栓治療外，臨床尚無有效的治療藥物或措施， 但溶栓治療又有嚴(yán)格的時間窗限制，只有極少數(shù)患者能夠得到有效的溶栓治療。因此迫切 需要研制新型安全高效的腦中風(fēng)治療藥物。
[0003] 構(gòu)杞化ycium barbarum L.)為茄科構(gòu)杞屬植物，主要分布于我國西北、西南、華 中、華南和華東各省。構(gòu)杞子為構(gòu)杞的果實，是一種補益類中藥，W寧夏產(chǎn)的構(gòu)杞子品質(zhì)為 最佳。中醫(yī)認(rèn)為構(gòu)杞子具有性平味甘，歸肝腎經(jīng)，滋補肝腎，益精明目之功效，能緩解虛勞精 虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等癥狀。目前對其藥理活性的研究 主要集中于抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及神經(jīng)保護等。
[0004] 近年來針對構(gòu)杞子化學(xué)成分的研究較少，其主要含有多糖、黃酬等化合物。文獻(xiàn) (詳見：Gao K,et al.Three New Dimers and Two Monomers of Phenolic Amides from the Fruits of Lycium barbarum and Their Antioxidant Activities.J Agric Food 化em,2015,63:1067-1075)從構(gòu)杞子中分離得到新的酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A,并對 其抗氧化能力進行了驗證，但是并未研究該化合物在治療缺血性腦損傷方面的應(yīng)用。目前 也未見到其他關(guān)于Lyciumamide A具有防治缺血性腦損傷、腦中風(fēng)的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種酪酷胺類化合物在防治腦損傷中的應(yīng)用。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0007] 酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A在制備用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。 [000引酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A在制備用于保護腦缺血損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A在制備用于抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A在制備對腦缺血再灌注損傷具有保護作用的藥物 中的應(yīng)用。
[0011] 所述酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0013] 所述藥物的制劑包括單獨使用酪酷胺類化合物L(fēng)yciumamide A或與其他藥物的有 效成分配合制備而成的注射劑、散劑、丸劑、膠囊劑、片劑、微囊劑、軟膠囊劑、膜劑、膏劑、町 劑、顆粒劑或氣霧劑。
[0014] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0015] 本發(fā)明所述化合物L(fēng)yciumamide A為脂溶性酪酷胺類化合物，可通過血腦屏障，具 有良好的防治缺血性腦損傷效果，而且未見毒副作用，為研制新的保護腦缺血損傷的藥物 提供先導(dǎo)化合物，可W進一步作為新的治療腦中風(fēng)藥物進行研究開發(fā)，有效解決目前臨床 上缺乏治療缺血性腦中風(fēng)的有效藥物的難題。
[0016] 本發(fā)明所述化合物L(fēng)yciumamide A能夠明顯改善此化引起的甜-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡，提 高細(xì)胞存活率；同時體內(nèi)實驗證實該化合物對線栓法致大腦中動脈栓塞(MCAO)模型造成的 缺血性損傷具有明顯的保護作用，且未見毒副作用。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，但實施例僅是對本發(fā)明的解釋，而不是對 本發(fā)明保護范圍的限制。
[0018] (一)化合物的提取和分離
[0019] 采自寧夏中寧縣的構(gòu)杞子為原料，陰干，取20公斤，加入85%乙醇80升加熱回流提 取，共提取3次，每次2小時。提取液過濾并合并，濃縮干燥得總提取物556克。提取物分散于2 升水中，用石油酸萃取3次，每次2升，萃取后的水相再用乙酸乙醋萃取3次，每次2升，合并乙 酸乙醋萃取液，回收溶劑，得到乙酸乙醋萃取部位125克。將乙酸乙醋萃取部位經(jīng)硅膠柱層 析(薄層色譜用硅膠H，青島海洋化工廠），W體積比為50:1:0.1~6:3:0.3的氯仿-甲醇-水 混合溶液為洗脫劑，梯度洗脫。按150毫升為一個流份收集，并用薄層層析檢測，收集第21~ 32流份。減壓蒸干溶劑后得6.8克粗品，經(jīng)S邱hadexLH-20葡聚糖凝膠柱(GE-Healthcare公 司）色譜，體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫，合并第12~15流份，減壓蒸干溶劑后得到4.2克樣 品，再經(jīng)半制備高效液相色譜，W體積比65:35甲醇-水為流動相，流速為8mL/min進行制備， 保留時間tR = 18.4min的化合物(如式I)純品化mg。
[0021] 上述化合物(結(jié)構(gòu)如式I所示)命名為Lyciumamide A，是從構(gòu)杞子中分離的酪酷胺 類化合物。
[0022] (二)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
[0023] 化合物L(fēng)yciumamide A為黃色無定型粉末，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z647[M+ 化]+ (positive mode)和m/z 623[M-H]-(negative mode),結(jié)合Ih-醒R(500MHz，CD3〇D)和 i3C-NMR( 125MHz，CD30D )波譜數(shù)據(jù)(表1)確定其分子式為C3Q出6〇i3。
[0024] 從Ih-NMR中可W觀察到存在兩個信號區(qū)域。第一個區(qū)域在Sh 7.5至6.0,包括兩組 鄰位共輛的芳香質(zhì)子，信號出現(xiàn)在SH6.85和6.73(each2H，d，J = 8.4Hz)，SH7.07和6.61 (each 2H，d，J = 8.4Hz)，來源于兩個1，4-二取代芳環(huán)(A'和B')，屬于AA' BB'-自旋系統(tǒng)；另 外還有2組芳香質(zhì)子，信號出現(xiàn)在Sh 7.24((1，1 = 2.0化，護加），6.72((1，1 = 8.0化，護86)和 7.02((1(1，1 = 8.0曰11(12.0化，護加），^及在如7.30((1，1=1.2化，護5曰），6.73((1，1 = 8.0化， H-Sa)和7.05(dd，J = 8. Oand 1.2Hz，H-9a)，來源于2個 1，3，4-S取代芳環(huán)(A和B)，屬于ABC-自旋系統(tǒng);此區(qū)域除了芳香族質(zhì)子，還包含了2個如6.53和7.49(6曰油（1，1=15.7化記-26 and H-3b)締質(zhì)子，和一個Sh 7.26化-3a)締質(zhì)子。第二個區(qū)域的信號集中在Sh 4.0和2.0之 間，顯示存在2個A2拉自旋系統(tǒng)（Sh 3.48,4H,出-I'a和出-l'b;SH 2.77,2H,出-2'a和Sh 2.65， 2H，出-2'b)，運與2個孤立去屏蔽的亞乙基相符;另外該區(qū)域還包括2個甲氧基(? 3.67,3H， s和?3.92,3H，s)，HMBC譜顯示運2個甲氧基分別與C-6a(Scl47.5)和C-化（Scl49.1)存在 遠(yuǎn)程相關(guān)，從而確定了它們在苯環(huán)A和B上的連接位置。此外，I 3C-醒財是示二聚體中含有2個 酪酷胺結(jié)構(gòu)晰164.0，(：-1曰和如167.4，(：-化）。通過分別比較(：-1曰，(：-2曰(扣140.1，季碳原 子），C-3a和C-4a與C-化，C-2b(Sc 119.6，叔碳原子），C-3b和C-4b化學(xué)位移的變化，可推測 C-2a連接有1個活潑基團，結(jié)合分子式可判斷此基團為徑基。綜上可W確定該化合物的結(jié) 構(gòu)，命名為Lyciumamide A。
[0025] 表1化合物L(fēng)yciumamide A的1化核磁共振數(shù)據(jù)(測定溶劑:気代甲醇）
[0027] (S)化合物L(fēng)yciumamide A(式I)對出化誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞死亡的保護作用。
[002引1、細(xì)胞培養(yǎng)
[00巧]SH-SY5Y細(xì)胞株用含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素、lOOU/mL鏈霉素的DMEM/F12培 養(yǎng)基在玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C、5 %C〇2濃度、飽和濕度，待細(xì) 胞長至80%豐度后用0.25%的膜酶消化傳代1次(約2-3d)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況， 實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。進行MTT實驗前將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板用無血清培 養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0030] 2、細(xì)胞給藥處理及分組
[0031] 細(xì)胞共分為五組，無血清培養(yǎng)基接種2地后進行藥物干預(yù):①正常對照組:正常甜-SY5Y細(xì)胞;②模型組：SOOiiM此化；③化合物低劑量組：IOiiM化合物（式I )+600iiM出化;④化 合物中劑量組:化合物(式I) +600測此化;⑤化合物高劑量組:40iiM化合物(式I) +SOOiiM 出化。給藥處理1化后加入出化，化后進行檢測。
[0032] 3、MTT檢測各組細(xì)胞活力
[0033] 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，膜酶消化后Wl X IO5個/mL的細(xì)胞密度，每孔10化L接種于 96孔培養(yǎng)板中無血清培養(yǎng)2地，然后按照上述