專利名稱：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG1及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)、農(nóng)藥學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一個(gè)來(lái)源于稻瘟病菌的、在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生、附著胞形成與致病性中起重要作用的新基因mgATG1的啟動(dòng)子與編碼區(qū)的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明提供的核苷酸序列和氨基酸序列可以作為靶標(biāo)應(yīng)用于抗真菌藥劑的篩選與設(shè)計(jì)中，也可以利用該核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或利用該蛋白制備的抗體應(yīng)用于稻瘟病菌及其他真菌的與該序列具有一定同源性的基因的克隆中。
背景技術(shù)：
由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失在10～30％之間。我國(guó)幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發(fā)。最近的2005年，四川省和重慶市遭受到10年來(lái)最嚴(yán)重的稻瘟病，四川省共有20個(gè)市、127個(gè)縣的230萬(wàn)畝稻田發(fā)生稻瘟病，重慶市共有100多萬(wàn)畝稻田發(fā)生稻瘟病菌；這次稻瘟病流行迅速、危害程度重、發(fā)病水稻品種多、對(duì)水稻產(chǎn)量影響嚴(yán)重。除了水稻外，稻瘟病菌也能侵染其它50多種禾本科植物，也對(duì)小米(Eleusine coracana)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(Triticum aestivum)等重要農(nóng)作物造成嚴(yán)重的危害。稻瘟病菌也是一種研究植物病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環(huán)，包括孢子產(chǎn)生、萌發(fā)、附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長(zhǎng)等致病過(guò)程；許多發(fā)達(dá)國(guó)家正在進(jìn)行研究其致病分子機(jī)制，期望通過(guò)此類研究設(shè)計(jì)出新型農(nóng)藥篩選的藥靶，從而開(kāi)發(fā)、設(shè)計(jì)新型抗真菌藥物。
稻瘟病菌的生活史包括有性階段和無(wú)性階段。有性階段由2個(gè)不同交配型的菌株交配后產(chǎn)生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MAT1-1和MAT1-2控制。無(wú)性階段為營(yíng)養(yǎng)菌絲分化產(chǎn)生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通過(guò)無(wú)性階段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。
稻瘟病菌無(wú)性孢子落到水稻葉片表面后，侵染過(guò)程開(kāi)始。當(dāng)孢子與水相遇后，孢子頂端分隔內(nèi)的粘膠釋放出來(lái)，使孢子緊緊粘附在水稻葉片表面。水稻葉片表面具有一層蠟質(zhì)角質(zhì)膜，該膜具有很大的疏水性，而粘膠使孢子粘附在這一疏水的排斥性表面。粘附后2小時(shí)內(nèi)，孢子萌發(fā)并產(chǎn)生芽管。芽管通常從孢子的一個(gè)頂端細(xì)胞伸出并生長(zhǎng)。芽管頂端也分泌一種粘膠物質(zhì)，使芽管緊緊粘附在植物葉片表面，防止被水滴沖走。4小時(shí)內(nèi)，芽管生長(zhǎng)停止，頂端鉤狀體形成并膨大形成附著胞?；|(zhì)的硬度是芽管分化的一個(gè)重要因子，如稻瘟病菌孢子僅在硬的固體表面形成附著胞，而不能在液體表面或軟基質(zhì)表面形成附著胞。而基質(zhì)疏水表面也通過(guò)類似于水稻葉片表面的蠟質(zhì)的作用激發(fā)附著胞的形成。在孢子萌發(fā)后不久，產(chǎn)生芽管的細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂。一個(gè)細(xì)胞核留在孢子內(nèi)，而另一個(gè)細(xì)胞核通過(guò)芽管移動(dòng)，與孢子和芽管的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物一起轉(zhuǎn)移到形成中的附著胞。這些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物包括儲(chǔ)存在正在發(fā)育的附著胞中央大液泡的脂滴。然后，在附著胞和芽管之間形成隔膜。隨著附著胞成熟，附著胞細(xì)胞壁出現(xiàn)黑色素沉積，最終形成黑色素層。黑色素層允許水分子自由通過(guò)，但溶解于水的物質(zhì)不能自由通過(guò)，從而讓附著胞建立并維持一個(gè)很大的細(xì)胞內(nèi)膨壓。附著胞的黑色素化過(guò)程完成后，附著胞產(chǎn)生一根狹小的菌絲--侵染栓。侵染栓對(duì)水稻葉片的穿透由于附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓而得以完成。膨壓只要稍微降低就會(huì)阻止附著胞在人工表面或水稻葉片表面穿透。測(cè)量結(jié)果表明附著胞膨壓達(dá)到8.0Mpa，相當(dāng)于40倍汽車輪胎的壓力。附著胞黑色素層的作用在于限制了細(xì)胞壁的滲透性，有利于細(xì)胞內(nèi)滲透物質(zhì)的積累和膨壓的產(chǎn)生。甘油是一種可溶性物質(zhì)，產(chǎn)生的滲透勢(shì)足以使附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓。在膨壓產(chǎn)生過(guò)程中，甘油在細(xì)胞內(nèi)累積濃度超過(guò)3M。
侵入后，侵染栓分化成侵染菌絲，迅速在水稻葉片內(nèi)生長(zhǎng)并侵染其它細(xì)胞。侵入72小時(shí)后，病原菌生物量已經(jīng)達(dá)到感染葉片的10％。5～7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并從病斑釋放出來(lái)。這些新形成的孢子被潮濕的空氣帶到鄰近的植物開(kāi)始新的侵染過(guò)程。在冬天，稻瘟病菌以菌絲和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循環(huán)。
稻瘟病菌的致病過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的分子過(guò)程。目前已經(jīng)克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關(guān)的基因，如MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多數(shù)與附著胞形成有關(guān)，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分參與黑色素的形成和積累(ALB1、RSY1、BUF1等)以及甘油合成相關(guān)(ICL1等)；少數(shù)與稻瘟病菌的穿透相關(guān)(MPS1、PLS1、PDE1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一種疏水蛋白，由MPG1基因編碼，參與菌絲和水稻葉表的互作，為形成正常的附著胞所必須(Talbot，1999)。MAGB基因編碼的異源三聚G蛋白的α亞單位和MAC1編碼的cAMP環(huán)化酶也是形成附著胞所必需的(Liu and Dean，1997；Choiand Dean，1997；Kulkarni and Dean，2004)。CPKA基因編碼的cAMP依賴性蛋白激酶A的催化亞單位PKA-c是附著胞穿透所必須的(Mitchell & Hamer，1995；Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性對(duì)于形成正常的附著胞也非常關(guān)鍵(Adachi & Hamer1998)。同樣，有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)基因PMK1是附著胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也證明是附著胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent，1990；Motoyama等，1998)。在各種突變子庫(kù)中也發(fā)現(xiàn)了一些突變子缺失致病性，如編碼一種與ATP運(yùn)輸體(ATP-bindingcassette transporters)相關(guān)的蛋白的ABC1基因(Urban等，1999)、編碼P-型ATP酶的PDE1基因(Balhadere等，1999，2001)和編碼tetraspannin樣蛋白的PLS1基因(Clergeot等，2001)。盡管如此，稻瘟病菌的分子致病機(jī)制還是不清楚。
鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過(guò)程相關(guān)的基因，可以為設(shè)計(jì)、篩選抗真菌藥物提供有用的靶標(biāo)位點(diǎn)。目前已經(jīng)在包括稻瘟病菌在內(nèi)的一些真菌中證明了一些藥物的靶點(diǎn)，如三環(huán)唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑，其作用是抑制黑色素的合成，靶點(diǎn)是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphen A的作用靶點(diǎn)是青霉的的脫甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定、克隆新的在稻瘟病菌的致病過(guò)程中具有重要功能的致病性基因，可以為設(shè)計(jì)、篩選新的抗真菌藥物提供有用的藥物靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的、對(duì)稻瘟病菌等真菌的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)生、分生孢子發(fā)芽、附著孢形成和侵染栓形成以及致病性有重要影響的基因mgATG1及其用途。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG1，該基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述基因mgATG1編碼的cDNA序列，該cDNA序列具有SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述基因mgATG1編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述基因mgATG1的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了利用上述基因mgATG1的表達(dá)作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了利用上述蛋白質(zhì)的表達(dá)與修飾作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了結(jié)合利用上述蛋白質(zhì)以及啟動(dòng)子作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的基因mgATG1及該基因編碼的蛋白質(zhì)序列，以其全長(zhǎng)核苷酸為探針，通過(guò)雜交分離源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR分離源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以其編碼的蛋白質(zhì)，雜交分離源于其它病原真菌的具有相同功能的蛋白。上述真菌包括小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、番茄灰霉病菌(Botryotinia Fuckeliana)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)或玉米黑粉病(Ustilago maydis)。
本發(fā)明所稱的抗真菌藥物包括抗稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、番茄灰霉病菌(Botryotinia Fuckeliana)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)或玉米黑粉病(Ustilago maydis)的藥物。
本發(fā)明利用基因敲除和基因互補(bǔ)證明了稻瘟病菌中一個(gè)對(duì)稻瘟病菌附著胞的穿透過(guò)程以及致病力具有關(guān)鍵性作用的基因mgATG1。該基因的啟動(dòng)子、編碼蛋白的表達(dá)和修飾可以作為新農(nóng)藥設(shè)計(jì)和篩選的藥物靶點(diǎn)。
本發(fā)明的基因mgATG1是通過(guò)cDNA差減文庫(kù)從稻瘟病菌中克隆的。具體過(guò)程包括通過(guò)篩選稻瘟病菌cDNA的SSH差減文庫(kù)獲得在菌絲或附著孢中差異表達(dá)的EST序列。通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證目的基因在稻瘟病菌菌絲、孢子、附著孢中的存在情況。通過(guò)高保真長(zhǎng)距離PCR從稻瘟病菌基因組DNA中獲得目的基因。通過(guò)PCR或以該基因的EST序列為探針從稻瘟病菌cDNA文庫(kù)驗(yàn)證和分離目的基因的完整的cDNA。目的基因的功能驗(yàn)證和注釋通過(guò)目的基因的敲除和互補(bǔ)恢復(fù)來(lái)完成。目的基因在稻瘟病菌內(nèi)的作用位點(diǎn)通過(guò)目的基因與報(bào)告基因GFP的融合蛋白在細(xì)胞的位置來(lái)確定?；騿?dòng)子的測(cè)定是將啟動(dòng)子與報(bào)告基因GFP連接，通過(guò)觀察GFP在啟動(dòng)子指導(dǎo)下在稻瘟病菌的各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)來(lái)進(jìn)行的。
本發(fā)明所涉及的稻瘟病菌SSH差減文庫(kù)是指利用SSH技術(shù)(Suppression subtractivehybridization，SSH)構(gòu)建的、含有若干獨(dú)立克隆的稻瘟病菌cDNA文庫(kù)。本發(fā)明所涉及的RT-PCR分析是指根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因缺失突變子和互補(bǔ)恢復(fù)突變子的mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別驗(yàn)證基因缺失突變子和基因互補(bǔ)恢復(fù)突變子中基因缺失和恢復(fù)后的轉(zhuǎn)錄本等情況。
本發(fā)明所涉及的目的基因克隆是指根據(jù)SSH文庫(kù)中獲得的EST序列，以此設(shè)計(jì)探針從cDNA文庫(kù)中篩選cDNA克隆，對(duì)獲得的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序；并利用cDNA序列比對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中DNA序列，以此設(shè)計(jì)引物從稻瘟病菌基因組DNA擴(kuò)增獲得基因的DNA序列，克隆到T載體中，進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)獲得的DNA序列利用程序分析其轉(zhuǎn)錄序列，并以此設(shè)計(jì)引物從稻瘟病菌cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得基因的cDNA序列，連接到T載體中，進(jìn)行測(cè)序分析。
本發(fā)明所涉及的Shouthern雜交分析是指利用基因側(cè)翼的DNA序列作為探針，對(duì)所獲得的基因敲除轉(zhuǎn)化子和基因恢復(fù)轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行Southern雜交，以分析基因敲除轉(zhuǎn)化子的基因缺失情況和敲除載體的插入拷貝數(shù)，以及分析基因互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子基因插入拷貝數(shù)等情況。
本發(fā)明所涉及的目的基因的功能確定是通過(guò)mgATG1的敲除和恢復(fù)進(jìn)行的。具體的mgATG1基因的敲除過(guò)程包括敲除載體的構(gòu)建，將敲除載體轉(zhuǎn)入稻瘟病菌，得到基因敲除突變子；mgATG1的基因敲除突變子的互補(bǔ)恢復(fù)過(guò)程包括互補(bǔ)載體的構(gòu)建，互補(bǔ)載體導(dǎo)入基因敲除突變子菌株，得到基因恢復(fù)的轉(zhuǎn)化子?；蚯贸d體的構(gòu)建是指將待敲除基因的兩側(cè)翼的一段DNA片段各自連接到含潮霉素抗性基因載體的潮霉素抗性基因的兩側(cè)?；蚧パa(bǔ)載體的構(gòu)建是指將含有目標(biāo)基因的全長(zhǎng)的DNA片段與帶有一個(gè)不同于潮霉素抗性基因的篩選標(biāo)記(本發(fā)明中是草胺磷抗性基因)的載體連接。在本發(fā)明中將外源載體導(dǎo)入稻瘟病菌的優(yōu)選方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)者也可以根據(jù)自己的情況選用其它方法如ATMA法、基因槍法等。本發(fā)明中，基因敲除載體所導(dǎo)入的稻瘟病菌菌株是野生型菌株Guy-11，實(shí)驗(yàn)者也可以選用其它稻瘟病菌野生型菌株，基因缺失使突變子的表型發(fā)生不同于原來(lái)野生型的變化，對(duì)水稻等植物的致病性喪失。本發(fā)明中，基因互補(bǔ)載體所導(dǎo)入的菌株是本發(fā)明所得到的基因缺失突變子，互補(bǔ)載體在該基因缺失突變子基因組中的異位整合使該突變子的表型恢復(fù)正常。
本發(fā)明所提供的mgATG1的cDNA克隆過(guò)程包括從SSH差減文庫(kù)中篩選含有目標(biāo)基因mgATG1的cDNA克隆，獲得其EST序列，利用其EST序列從稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相對(duì)應(yīng)的一段DNA序列，在根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物從稻瘟病菌基因組DNA中擴(kuò)增到目標(biāo)基因的DNA片段，測(cè)序獲得其DNA序列，利用GenScan(http://genes.mit.edu/genscan.html)進(jìn)行啟動(dòng)子、編碼區(qū)和加尾點(diǎn)的預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)PCR從稻瘟病菌cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得，其序列如SEQ IDNO2所示。本發(fā)明還提供了mgATG1編碼的蛋白質(zhì)，其具有如SEQ ID NO3所示氨基酸序列或與SEQ IDNO2所示的序列具有35％以上的序列一致性的并具有相似功能的氨基酸序列。該蛋白可以源于稻瘟病菌，也可以源于其它病原真菌。本發(fā)明提供了小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、番茄灰霉病菌(Botryotinia Fuckeliana)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)的中具有與mgATG1蛋白具有35％以上氨基酸序列一致性的同源蛋白的氨基酸序列。
本發(fā)明所涉及的基因因?yàn)橥粗亟M造成的基因缺失突變導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)孢量下降、孢子萌發(fā)延遲、附著胞膨壓降低和侵入栓形成率降低，并且在感病水稻品種上的致病力缺失。因此，本發(fā)明最重要的用途是應(yīng)用上述成果，設(shè)計(jì)和篩選能夠破壞該基因的表達(dá)、剪切及其編碼蛋白的表達(dá)的化合物，或設(shè)計(jì)和篩選能對(duì)該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行修飾的化合物，從而開(kāi)發(fā)出新的抗真菌藥物。此外，本發(fā)明的用途還包括利用該基因的DNA或cDNA序列作為探針在其它真菌中分離與該基因具有一定序列同源性的序列。
以上述所克隆基因編碼蛋白的表達(dá)、修飾為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)、篩選新型抗真菌藥物，或者以具有如SEQ ID No3所示序列或與SEQ ID No3具有35％以上序列一致性的并具有相似功能的蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)多肽，并制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下蛋白的表達(dá)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上述所克隆基因的啟動(dòng)子為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)和篩選新型抗真菌藥物，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
因此，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、附著胞是稻瘟病菌侵入寄主植物的重要結(jié)構(gòu)，附著胞膨壓是稻瘟病菌穿透寄主植物表皮角質(zhì)層的主要機(jī)械力量，mgATG1基因參與稻瘟病菌附著胞膨壓的產(chǎn)生，mgATG1基因與稻瘟病菌的致病性密切相關(guān)，mgATG1失活或缺失，導(dǎo)致稻瘟病菌附著胞膨壓下降，致病性喪失。因此mgATG1基因在稻瘟病菌致病過(guò)程中作用重大。
2、mgATG1為開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物提供了特異的藥物作用靶標(biāo)，針對(duì)mgATG1作為藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)藥靶，通過(guò)對(duì)大量化合物進(jìn)行篩選，可以找到能夠與藥靶起作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以被用做阻止真菌侵染。由于藥靶的特異性，篩選到的抗真菌藥物一般對(duì)于動(dòng)物和植物的毒性較小。


圖1是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24在水稻感病品種CO39上的致病性比較圖。Guy11為野生型菌株，s197-4為mgATG1基因缺失突變子，HB24為mgATG1基因互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子，明膠為0.2％(w/v)的明膠對(duì)照溶液。噴霧接種的孢子濃度為1×105/ml，接種后7天拍照。
圖2是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24在大麥表皮上侵入栓形成比較圖。A為野生型菌株Guy11，B為mgATG1基因缺失突變子s197-4，C為mgATG1基因互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子HB24；24h、48h、72h、96h為接種后拍照時(shí)間。離體點(diǎn)接種的孢子濃度為1×105/ml。
圖3是基因敲除載體構(gòu)建示意圖。
圖4是基因互補(bǔ)載體構(gòu)建示意圖。
圖5是基因敲除位置和過(guò)程示意圖。
圖6是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24形成的附著胞膨壓(附著胞塌陷率)大小比較圖。上圖為孢子接種24h后附著胞在不同甘油濃度溶液中的細(xì)胞塌陷率，下圖為孢子接種48h后附著胞在不同甘油濃度溶液中的細(xì)胞塌陷率。
圖7是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4在缺氮培養(yǎng)基中自噬泡形成的比較圖。左上(A)和左下(C)圖為野生型菌株Guy11菌株自噬泡形成的電鏡照片，右上(B)和右下(D)圖為mgATG1基因缺失突變子s197-4菌株自噬泡形成的電鏡照片。
圖8是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24形成的孢子中的糖原顆粒比較圖。上圖(A)為野生型菌株Guy11，中圖(B)為mgATG1基因缺失突變子s197-4，下圖(C)為mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24。
圖9是mgATG1基因編碼蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位圖。mgATG1-GFP融合蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中，左側(cè)為明視場(chǎng)下拍攝，右側(cè)為暗視場(chǎng)下拍攝。左上(A)為普通光鏡下的孢子照片，右上(B)為熒光顯微鏡下的孢子照片，左中(C)為普通光鏡下的菌絲照片，右中(D)為熒光顯微鏡下的菌絲照片，左下(E)為普通光鏡下的附著胞照片，右下(F)為熒光顯微鏡下的附著胞照片。
圖10是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24的產(chǎn)孢量比較圖。
圖11是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24在完全培養(yǎng)基、缺氮培養(yǎng)基、缺炭培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度比較圖。CM為完全培養(yǎng)基，MM-N為缺氮培養(yǎng)基，MM-C為缺炭培養(yǎng)基。
圖12是野生型菌株Guy11與mgATG1基因缺失突變子s197-4及mgATG1互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子HB24的孢子萌發(fā)率比較圖。
圖13是mgATG1基因在孢子和菌絲中的表達(dá)情況圖。左側(cè)(A)為明視場(chǎng)下拍攝，右側(cè)(B)為暗視場(chǎng)下拍攝。
圖14是幾種病原真菌中ATG1蛋白的序列比較圖。圖示說(shuō)明mgATG1、gzATG1、bfATG1、ciATG1、pnATG1、clATG1、umATG1分別為來(lái)自稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、番茄灰霉病菌(Botryotinia Fuckeliana)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)的ATG1蛋白。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1與稻瘟病菌致病性相關(guān)的基因的克隆1、SSH文庫(kù)篩選稻瘟病菌附著胞cDNA與產(chǎn)孢菌絲cDNA差減后獲得的差減cDNA，克隆到T載體，測(cè)序獲得cDNA序列，將獲得的序列與稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)比較，確定獲得的差異表達(dá)基因，并用RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)特異性。
2、mgATG1 cDNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的附著胞cDNA文庫(kù)，根據(jù)預(yù)測(cè)的基因cDNA序列設(shè)計(jì)合成PCR引物，擴(kuò)增包含整個(gè)基因編碼區(qū)在內(nèi)的基因cDNA片段，克隆到T載體，測(cè)序獲得mgATG1 cDNA的序列，其序列如SEQ ID NO2所示。
3、mgATG1基因組DNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的基因組DNA，根據(jù)預(yù)測(cè)的基因DNA序列設(shè)計(jì)合成PCR引物，擴(kuò)增包含整個(gè)全長(zhǎng)基因的DNA片段，克隆到T載體，測(cè)序獲得mgATG1基因組DNA的序列，其序列如SEQ ID NO1所示。
實(shí)施例2mgATG1基因缺失突變子的獲得和鑒定1、基因敲除載體的構(gòu)建將mgATG1基因上游和下游的長(zhǎng)約500～2000bp的DNA片段分別插入到含有潮霉素抗性基因的載體中潮霉素抗性基因的兩側(cè)，如圖3和圖5所示。具體如下采用高保真PCR的方法分別從稻瘟病菌DNA基因組中擴(kuò)增mgATG1基因上游和下游的長(zhǎng)約500～2000bp的DNA片段，先連接到T載體上；然后上游DNA片段用限制性內(nèi)切酶Xhol和Sall從T載體上切下，插入到含有潮霉素抗性基因的pBSHPH1載體的同樣酶切位點(diǎn)上；接著下游DNA片段也從T載體上用限制性內(nèi)切酶Hindlll和Xbal從T載體上切下，插入到上述已經(jīng)插入上游DNA片段的pBSHPH1載體的Hindlll和Xbal位點(diǎn)上，即獲得mgATG1基因敲除載體。含有潮霉素抗性基因的pBSHPH1載體的構(gòu)建過(guò)程先采用高保真PCR的方法從pCB1003質(zhì)粒中擴(kuò)增到潮霉素抗性基因(HPH或HygBr)，連接到T載體上；然后用限制性內(nèi)切酶Hindlll和Sall切下，并插入到pBS質(zhì)粒的同樣酶切位點(diǎn)中，即獲得pBSHPH1載體。
2、稻瘟病菌原生質(zhì)載體的制備和DNA轉(zhuǎn)化稻瘟病菌菌株先在CM平板上生長(zhǎng)6天左右。切取兩個(gè)直徑約3cm的菌落，置于150mL CM液體培養(yǎng)基中，用搗碎器將其搗碎；然后均勻分裝到兩瓶200mL CM液體培養(yǎng)基中，28℃，125rpm，培養(yǎng)48小時(shí)。四層紗布過(guò)濾收集菌絲，用無(wú)菌水沖洗兩遍，將水分壓干。菌絲在酶解液(Glucanex，酶液濃度7.5mg/mL，0.7M NaCl溶液)酶解2-3hr中30℃，80rpm。取出酶解液，三層濾紙過(guò)濾，0.7M NaCL洗滌，除去殘?jiān)瑸V液收集到50mL的離心管中。4℃，3000rpm，離心10min。用10-20mL STC(1.2M Sorbitol，10mM Tris-HCL PH7.5，20mM CaCL2)懸浮沉淀。4℃，3000rpm，離心10min；重復(fù)兩次。取適量的STC懸浮沉淀，使終濃度為0.5～1.0×108個(gè)/mL。每個(gè)50ml離心管分裝150μl原生質(zhì)體，加入2μg線性化DNA，室溫下放置25min。逐滴加入1mL PTC(60％PEG4000，10mM Tris-HCL PH7.5，20mMCaCL2)，混勻，室溫放置25min。緩慢加入5mL OCM液體培養(yǎng)基(CM液體培養(yǎng)基中加入1.2M Sorbitol/1M Sucrose)，輕輕搖勻，置于28℃，100rpm，搖過(guò)夜。每管過(guò)夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體中加入含有200μg/mL潮霉素的固體OCM Top培養(yǎng)基(GM液體培養(yǎng)基中加入20％Sucrose，瓊脂粉1g)，混勻，倒入已鋪有OCM Bottom培養(yǎng)基(CM液體培養(yǎng)基中加入20％Sucrose，瓊脂粉1.5g)的平板，每管鋪三個(gè)平板。黑暗，28℃，培養(yǎng)約一周左右，挑取轉(zhuǎn)化子，接種到含有200μg/mL潮霉素的固體CM上。
3、mgATG1基因缺失突變子的鑒定提取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子DNA，用PCR、Southern雜交等方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例3、mgATG1基因缺失突變子的互補(bǔ)恢復(fù)將mgATG1基因的全長(zhǎng)DNA序列連接到帶有草胺磷抗性基因的載體中，如圖4所示。具體為采用高保真長(zhǎng)片段PCR方法(LD PCR)從稻瘟病菌基因組DNA中擴(kuò)增得到含有mgATG1基因全長(zhǎng)編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)域和終止區(qū)區(qū)域的DNA片段，先插入到pCR-XL-TOPO載體中，然后再用限制性內(nèi)切酶EcoRI從TOPO載體中切下該DNA片段，插入到含有草胺磷抗性基因的pBARKS1載體的EcoRI位點(diǎn)，即構(gòu)建成mgATG1基因的互補(bǔ)恢復(fù)載體——pBARATG1載體。在進(jìn)行DNA的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化前，pBARATG1載體在用限制性內(nèi)切酶Notl酶切線性化。
然后按照實(shí)施例2的方法，將線性化的此mgATG1基因的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化mgATG1基因缺失菌株原生質(zhì)體。挑取具有草胺磷抗性的轉(zhuǎn)化子接種到含有草胺磷的固體CM上。提取具有草胺磷抗性的轉(zhuǎn)化子DNA和RNA，用RT-PCR、Southern雜交等方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。
通過(guò)以下方法比較了基因恢復(fù)后表型的變化狀況在完全培養(yǎng)基上比較mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量變化(見(jiàn)圖10)；比較了mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子孢子的萌發(fā)變化(見(jiàn)圖12)；比較了mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的附著孢的膨壓變化(見(jiàn)圖6)；比較了mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的菌絲自噬泡形成情況(見(jiàn)圖7)；比較了mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的孢子的糖原含量變化(見(jiàn)圖8)；在完全培養(yǎng)基、缺氮培養(yǎng)基、缺碳培養(yǎng)基上比較mgATG1基因突變子和互補(bǔ)恢復(fù)轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)變化(見(jiàn)圖11)；互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子致病性的恢復(fù)見(jiàn)圖1。
實(shí)施例4mgATG1基因缺失突變子和互補(bǔ)突變子的致病性測(cè)定1、噴霧接種大麥或水稻CO39種子種于花缽泥土中，培養(yǎng)8天(大麥)或14天(3～4葉期的水稻CO39植株)。從培養(yǎng)12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突變子和互補(bǔ)轉(zhuǎn)變子的孢子，孢子濃度用0.2％(wt/v)的明膠稀釋至1×105/ml。用微型的油漆噴霧器將孢子懸浮液噴霧接種到植株葉片表面。同時(shí)，以0.2％的明膠作為陰性對(duì)照噴霧接種。接種植物放在一個(gè)潮濕箱子內(nèi)，于25℃黑暗環(huán)境中保濕培養(yǎng)24小時(shí)(大麥)或48小時(shí)(水稻)。然后接種植物放入人工氣候箱(25℃，80％以上濕度，12小時(shí)光照周期)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至第4天(大麥)或第7天、第14天(水稻)，使植物病癥充分顯示。拍照記錄植物葉片的稻瘟病癥狀，并根據(jù)Bonman等(1986)報(bào)道的方法記錄和評(píng)價(jià)植物的病癥嚴(yán)重程度。同時(shí)，從每株受試植物中挑選一片受感染最嚴(yán)重的葉片，記錄葉片上5cm長(zhǎng)的一段區(qū)域內(nèi)的稻瘟病菌病斑。結(jié)果見(jiàn)圖1。
2、離體接種大麥種子種于花缽泥土中，培養(yǎng)7～10天。從培養(yǎng)12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突變子和互補(bǔ)轉(zhuǎn)變子的孢子，稀釋至孢子濃度為5×104/ml或1×105/ml。孢子液20μl一滴點(diǎn)接種于離體大麥葉片上表面。在人工氣候箱內(nèi)保濕光照培養(yǎng)(光照/黑暗，12h12h)，25℃。分別在培養(yǎng)24h，48h，72h和96h后，取出部分葉片觀察。先觀察病斑形成情況，并拍照記錄。然后剪取部分病斑放入甲醇溶液中固定并脫去葉綠素。病斑葉片在甲醇溶液中固定24小時(shí)(室溫)后，移入乳酚油固定透明液(乳酚油∶95％乙醇＝1∶2)室溫固定1小時(shí)。乳酚油配方為乳酸20ml、苯酚20ml、20％甘油40ml、蒸餾水20ml。病斑葉片再用苔酚藍(lán)/苯胺藍(lán)(0.01％苔酚藍(lán)/0.06％苯胺藍(lán)，乳酚油)染色5～10分鐘。染色葉片在乳酚油中脫色。在顯微鏡下觀察病斑發(fā)展情況，統(tǒng)計(jì)24h和48h的附著胞穿透率、以及侵入菌絲的生長(zhǎng)和次生孢子的產(chǎn)生情況，并拍照記錄。結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例5mgATG1的亞細(xì)胞定位將GFP基因的完整編碼區(qū)序列連接到不帶終止密碼子的mgATG1基因編碼區(qū)的下游，構(gòu)建成融合基因并連接到帶有潮霉素抗性基因的載體中。按照實(shí)施例2的方法，將線性化的此載體轉(zhuǎn)化野生型Guy11菌株原生質(zhì)體。挑取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察mgATG1-GFP融合蛋白在稻瘟病菌細(xì)胞中的分布。結(jié)果表明mgATG1定位于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)果見(jiàn)圖9。
實(shí)施例6mgATG1啟動(dòng)子的界定和表達(dá)分析將GFP基因的完整編碼區(qū)序列連接到mgATG1基因編碼區(qū)上游(不含編碼區(qū)序列)的一段DNA序列后，構(gòu)建成融合基因并連接到帶有潮霉素抗性基因的載體中。按照實(shí)施例2的方法，將線性化的此載體轉(zhuǎn)化野生型Guy11菌株原生質(zhì)體。挑取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察mgATG1啟動(dòng)子指導(dǎo)下的GFP蛋白在稻瘟病菌不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖13。mgATG1啟動(dòng)子序列見(jiàn)SEQ ID NO4所示。
實(shí)施例7真菌ATG1蛋白的生物信息學(xué)分析為了明確ATG1蛋白在其他病原真菌中是否保守，針對(duì)下列病原真菌小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、番茄灰霉病菌(Botryotinia Fuckeliana)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis，將mgATG1蛋白的氨基酸序列對(duì)這些真菌的蛋白序列進(jìn)行Blastp檢索，獲得上述病原真菌的同源蛋白的氨基酸序列，其序列分別如SEQ ID NO5、6、7、8、9和10所示；具體為SEQ ID NO5表示gzATG1 Gibberellazeae小麥赤霉菌，SEQ ID NO6表示bfATG1 Botryotinia Fuckeliana番茄灰霉病菌，SEQ ID NO7表示ciATG1 Coccidioides immitis粗球孢子菌，SEQ ID NO8表示pnATG1Phaeosphaeria nodorum小麥穎枯病菌，SEQ ID NO9表示clATG1 Colletotrichumlindemuthianum菜豆炭疽病菌，SEQ ID NO10表示umATG1 Ustilago maydis玉米黑粉病。并將這些蛋白分別命名為gzATG1、bfATG1、ciATG1、pnATG1、clATG1和umATG1。序列分析表明上述真菌的ATG1蛋白在氨基酸序列上與mgATG1蛋白的一致性分別達(dá)到59％，51％，50％，47％，44％，36％。利用PAUP*4.0b10程序繪制的上述真菌的ATG1蛋白的同源性關(guān)系圖見(jiàn)圖14。
實(shí)施例8利用mgATG1蛋白的表達(dá)或修飾作為靶標(biāo)，篩選抗真菌的藥物。
把稻瘟病菌在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，然后在缺氮培養(yǎng)基中(同時(shí)也加入待篩選的化合物或候選藥物)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)左右，取菌絲在相差顯微鏡下觀察菌絲的自噬泡形成狀況，或者菌絲利用常規(guī)電鏡制片方法制成超薄切片后在電子顯微鏡下觀察自噬泡的形成狀況。如果mgATG1蛋白發(fā)生被候選藥物修飾事件而失去活性，則菌絲不形成自噬泡。獲得的化合物再利用實(shí)施例4的方法，測(cè)定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對(duì)水稻的致病性有沒(méi)有減弱，進(jìn)一步確定化合物的抗真菌效果。
實(shí)施例9利用mgATG1的表達(dá)作為靶標(biāo)，篩選抗真菌的藥物。
把稻瘟病菌在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，然后在缺氮培養(yǎng)基中(同時(shí)也加入待篩選的化合物或候選藥物)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)左右，提取菌絲的RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)mgATG1的表達(dá)狀況。如果mgATG1的表達(dá)被候選藥物抑制，則菌絲細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有mgATG1的轉(zhuǎn)錄本。獲得的化合物再利用實(shí)施例4的方法，測(cè)定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對(duì)水稻的致病性有沒(méi)有減弱，進(jìn)一步確定化合物的抗真菌效果。
實(shí)施例10利用mgATG1的啟動(dòng)子作為靶標(biāo)，篩選抗真菌的藥物。
把mgATG1的啟動(dòng)子與熒光蛋白GFP構(gòu)建成融合蛋白載體，或把mgATG1的啟動(dòng)子與熒光蛋白GFP以及mgATG1蛋白一起構(gòu)建成融合蛋白載體，通過(guò)實(shí)施例2的方法轉(zhuǎn)入到稻瘟病菌中，然后把在mgATG1的啟動(dòng)子調(diào)控下的GFP表達(dá)的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子菌株在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，取菌絲在熒光顯微鏡下觀察菌絲的GFP的綠色熒光表達(dá)情況。如果mgATG1的啟動(dòng)子的被化合物抑制而失去活性，則GFP蛋白不表達(dá)從而菌絲失去綠色熒光。獲得的化合物再利用實(shí)施例4的方法，測(cè)定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對(duì)水稻的致病性有沒(méi)有減弱，進(jìn)一步確定化合物的抗真菌效果。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO1aagaagatgg aggggacgct aaatggtacc gatctggcta aagcctgcca agcagccacc 60aactcgtgac agaggaacag aatggcatct gtgcgaagtc tcttggttgc ttctcaacga 120atgcagtcgt tcatcaggcg ttctatttgc tgcctcacat aggcgagttt gggtaggcag 180cttaccttat ctgtcgtgtt gtcatttcgc aaggaaagtc gcaacaggtt gtcatggatc 240gtctaatcaa ttacgtctat cagttccaag ctatcatcat ctcaacctga ctaagtgtgt 300agtacccatc tatgtatctt tgggcatggc atgcctaccg cgtatcacac cctcgaaatc 360cacagtgcca caattatcat ccccaactat gcagggcact gtcgtttctc atttacccat 420cttatctgct ctctgcgtcg taaatctccg tctttattgc ctagtgcctt tacacttctt 480ttattagaca ccgcgttggg ggttctggaa taacttactc cgtacaatag atagctttct 540ttttgttctt tctttctttc tttttttttt tttttttaaa aaaaaaagat aggaaaaaga 600aagaaagaaa gaaaagactg cacttaatat ctgaaatctc agttcagtcc aaggcaaggt 660ctctaaaggt acctacctag ataggtacct accaggtacg taccttacgt acctcactga 720ctccgccaaa ccccacactg gtgtcgtcaa cccaagttcc gatcacgcac cagtctttgc 780ccattgctat ggagctcacc agacctgaca cgccggggac agtgcaggcg tcacggttga 840cgccaaatta ggcatcccgg acatgaagtt tatgttacgg tgttgtaaat aattattaca 900ctgacacgaa tgcagccttt tgacagaagt caaccttcct aggccacaaa actcttatta 960ctctgcttgc tcggtcctag atctggacgt acagtaggta attggtaggt acctagttag 1020gtaggtaggt tactgtattg taatggaggt gaggtgatga ccgtacagta ccggtggtga 1080ttgtgcagcc agttcagtgg catccgcccg cccagtgccg ttaaaaaaaa aaaaaaccac 1140ccgctcatta gaccgcccac ccccagctgc cacctgccca cgtcttacac aaactccgaa 1200aaacgaacga cttaccctgt ttgttaccac tttcaattgc cttatcttct catcaaagcc 1260gtcacgagtt ggggatcaaa ctcgaaaaaa atcgaggcct tcaaagacac gtcttgaaag 1320aggcttggcc catttgcgaa tagaaaaagg tcggtatgtc ttgtggtgac gtcgttttcg 1380ctttcaacct gtcgccccct taaactattg tttacttctc ggtcgcaggc tatgcagcgg 1440agcgctaggc gcgtggaacc ccctgccaca agtcacttgc gctccacatc caatccccac 1500acatgatcca gaacctcgtc gtgaatcctg ggcctatcgg agccgtgcca gagaccaggc 1560ggcggaccag ttcctaccat tcgtgacctt gcctgcctgc ctccccggcc tagcgatcca 1620ggcaccttgt tgactgcttt gaactgtgct tgctcatcat cacccaactt ttctcttacc 1680tatctttttt ctgtttttcc ctcccgagtc ttttcatccc atcccaccca cccacctatt 1740aaccgcacct acctacctac ttacctacct atccttcatc gacctgcatc aaaccgccgc 1800ctcgacagac agacgcccga ctccatgaag ctaacgtctc cctcgcttcg aggaacagct 1860gtgttcatgc ccgctccaac aaggttctcc atccgtcttt catagaccct gcccctttag 1920ggggccaacc gtctcgcttg catctacgta cacttcctcg aaccgataac cactgccagg 1980aattatggcg gaccgatcag cacgccgtgc gcgccctggc gacgactctg taggacagtt 2040tgtcatcggg gcggagatcg gaaagggcag cttcgcccaa gtttacatgg gcaagcacaa 2100ggtcagcata cattgacctc ttcggattac atgccatggc aagcacccgt tttagatcat 2160attcgagacg agctcgcgga gcgaaatgca ctagaacgat gtgacaccgt ccacgatggc 2220tccccttcga ctattggctg tgccattcca cagaaacatt agtttgacga ccgagtagct 2280
aacataacat ttgcaccttg acaggtatct ggtgccgccg ttgccatcaa gtctgtcgag 2340ctggcaagac tcaataagaa actcaaggag aacctatacg gggagataaa tatcctgaag 2400actctccgac accctcatat tgttgccctc catgactgcg tcgagtcggc aacacacata 2460aacctcatga tggagtattg cgagctaggg gacctgtcgc tattcattaa gaagagggag 2520aagctgtcga cgaacccagc aacacacgat atggcccgca agtaccccaa cgtgccaaac 2580tctggtctaa acgaggtggt cattcgacac tttctcaaac agctcagcag cgctctgaaa 2640ttccttagag agagcaatct tgtacaccga gatgtgaagc cgcagaacct tctcctgctt 2700ccctcgcccg agttccggga ggtaaacaaa ttagcccgcc ctatccttac agcaagtcag 2760gactccctcg tcccagtcgc cggccttgca tcgcttccca tgctgaagct ggccgacttt 2820ggctttgcga gagtcctgcc gtcaacgtca ctggctgaga ctctttgcgg ctcaccattg 2880tatatggccc cagaaatcct ccgttatgag cggtacgatg ccaaggcaga cctctggtct 2940gtcgggactg tgttattcga gatgatagtg ggcaggccgc ccttccgcgc cagcaatcat 3000gttgagctgc tgaggaagat cgaagccgct gaggatgtga tcaagttccc ccgagagacc 3060acgataagct cagagatgaa gggtcttaca agggcacttc tcaaacggaa tcctgttgag 3120cgcatcagct tcgagaattt ctttgctcac ccagttatta ttagttcgat accgggcttg 3180gttgaggatg atatacccaa gcctgaagct agcgagcagc gtagcagcag caaggatacc 3240agggcggcat ccaaaagtga tgacccaatc gcttccccta gaaagtattc tttccgacgc 3300cacccaacag ataacgacca aatcagggac cagtttcgaa gggtggaacc gccgtcttct 3360gctgcagaga gcgccccttc acggcaaaca tcagctttta gcggtattgc cgcggaggct 3420agaaaacaag cagccgctga agcatcagca cgaaccggcc agtcatcacg caatgagcct 3480ggagacaact tggtccctcg caggccgcaa gcgcagcctt ctacatcggc tccgagcaag 3540ccggggttgt acgaagaacg tcgccgtgga atatcgaacg catcgctgaa tcgatccaac 3600cgcgaatcat catccccaac tagtgcagct ttggccaatg attctgcaag agcgccaccg 3660cagcaaactt ctaggagagt gcaggcggag gagagagaga aggccgcgca ggatgtagcc 3720tttgagcggg actacgtcgt tgtagagaag aagcatgtcg aggtcaacgc tttcgcagat 3780gagatggctg ccaatcctag gctgggcggc caaggcacgc cactgtcgcc caagtctggg 3840cagattgtcc gaagagcaac ccagcaggga aatcctactt ctaccactgg cgcaattcct 3900gcagcgccat cgcgcacaat gcagatcgcg caaggcactc agagacacta tcacgagcgc 3960ggaacttctc tctcagccag tccaggctca accgcttcct tcattaccaa ggctatccaa 4020gatgcaagct tacgactgct cggaattaag tacccggccg gtctgacaaa gggtgcatcg 4080ccacccgagt tatataaccc ctaccctgcc taccctaccc catccccacc ggttggcctc 4140ataagcagcg gaaagcagag tactcccgta gacgaggatg cgcgggttgc gcagctgatc 4200gaggagcacg ccactcgcag tgacgtcgtt tatggctttg cagaggtcaa gtacaaacag 4260ctggttcctc tcgcaccatc ggcggaacat gggctaggag gaacaacgct cgaagacatg 4320cccaccggcg aggaagatgt tctcacggtt gaggccatag tctctctgtc tgaagaggca 4380ctggtgctat acgtaaaagc cttgactctc cttgcgaagt cgatggatat tgcaagcctg 4440tggtgggcta ggaagaaccg aggtgatcaa gcaaacaacg ctctttcgtc gacgagggac 4500tctgtgaaca cgcagacact atcattgaga ataaattcgg ccgttcagtg ggtccgctca 4560agattcaatg aggtgctcga aaaggccgaa gtagtcaggc tccggttgat ggacgcacag 4620aagcgacttc cagatgatca tccgagtcat cctagcaatc acccacaagg atctgaatca 4680gtaaacggcg caagcgcaga aggagtcttc ttgacagtcg gtgtgaccgc ggagaagctc 4740
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aagaagatgg aggggacgct aaatggtacc gatctggcta aagcctgcca agcagccacc 60aactcgtgac agaggaacag aatggcatct gtgcgaagtc tcttggttgc ttctcaacga 120atgcagtcgt tcatcaggcg ttctatttgc tgcctcacat aggcgagttt gggtaggcag 180cttaccttat ctgtcgtgtt gtcatttcgc aaggaaagtc gcaacaggtt gtcatggatc 240gtctaatcaa ttacgtctat cagttccaag ctatcatcat ctcaacctga ctaagtgtgt 300agtacccatc tatgtatctt tgggcatggc atgcctaccg cgtatcacac cctcgaaatc 360cacagtgcca caattatcat ccccaactat gcagggcact gtcgtttctc atttacccat 420cttatctgct ctctgcgtcg taaatctccg tctttattgc ctagtgcctt tacacttctt 480ttattagaca ccgcgttggg ggttctggaa taacttactc cgtacaatag atagctttct 540ttttgttctt tctttctttc tttttttttt tttttttaaa aaaaaaagat aggaaaaaga 600aagaaagaaa gaaaagactg cacttaatat ctgaaatctc agttcagtcc aaggcaaggt 660ctctaaaggt acctacctag ataggtacct accaggtacg taccttacgt acctcactga 720ctccgccaaa ccccacactg gtgtcgtcaa cccaagttcc gatcacgcac cagtctttgc 780ccattgctat ggagctcacc agacctgaca cgccggggac agtgcaggcg tcacggttga 840cgccaaatta ggcatcccgg acatgaagtt tatgttacgg tgttgtaaat aattattaca 900ctgacacgaa tgcagccttt tgacagaagt caaccttcct aggccacaaa actcttatta 960ctctgcttgc tcggtcctag atctggacgt acagtaggta attggtaggt acctagttag 1020gtaggtaggt tactgtattg taatggaggt gaggtgatga ccgtacagta ccggtggtga 1080ttgtgcagcc agttcagtgg catccgcccg cccagtgccg ttaaaaaaaa aaaaaaccac 1140ccgctcatta gaccgcccac ccccagctgc cacctgccca cgtcttacac aaactccgaa 1200aaacgaacga cttaccctgt ttgttaccac tttcaattgc cttatcttct catcaaagcc 1260gtcacgagtt ggggatcaaa ctcgaaaaaa atcgaggcct tcaaagacac gtcttgaaag 1320aggcttggcc catttgcgaa tagaaaaagg tcggtatgtc ttgtggtgac gtcgttttcg 1380ctttcaacct gtcgccccct taaactattg tttacttctc ggtcgcaggc tatgcagcgg 1440agcgctaggc gcgtggaacc ccctgccaca agtcacttgc gctccacatc caatccccac 1500acatgatcca gaacctcgtc gtgaatcctg ggcctatcgg agccgtgcca gagaccaggc 1560ggcggaccag ttcctaccat tcgtgacctt gcctgcctgc ctccccggcc tagcgatcca 1620ggcaccttgt tgactgcttt gaactgtgct tgctcatcat cacccaactt ttctcttacc 1680tatctttttt ctgtttttcc ctcccgagtc ttttcatccc atcccaccca cccacctatt 1740aaccgcacct acctacctac ttacctacct atccttcatc gacctgcatc aaaccgccgc 1800ctcgacagac agacgcccga ctccatgaag ctaacgtctc cctcgcttcg aggaacagct 1860gtgttcatgc ccgctccaac aaggttctcc atccgtcttt catagaccct gcccctttag 1920ggggccaacc gtctcgcttg catctacgta cacttcctcg aaccgataac cactgccagg 1980aatt 1984SEQ ID NO5Met Ala Gly Pro Gln Glu Ser Ser Thr Ser Ser Gly Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg AlaVal Gly Gln Phe Asn Ile Gly Ser Glu Ile Gly Lys Gly Ser Phe Ala Gln Val Tyr LeuGly Trp His Lys Glu Thr Lys Ala Ala Val Ala Ile Lys Ser Val Glu Leu Glu Arg LeuAsn Lys Lys Leu Arg Glu Asn Leu Tyr Ser Glu Ile Gln Ile Leu Lys Thr Leu Arg HisPro His Ile Val Ala Leu His Asp Cys Ile Glu Ser Thr Ser His Ile Asn Leu Ile MetGlu Tyr Cys Glu Leu Gly Asp Leu Ser Leu Phe Ile Lys Lys Arg Glu Lys Leu Ala Thr
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權(quán)利要求
1.一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG1，其特征是該基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG1編碼的cDNA序列，其特征是所述cDNA序列具有SEQID NO2所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG1編碼的蛋白質(zhì)，其特征是所述蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG1的啟動(dòng)子，其特征是所述啟動(dòng)子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.利用如權(quán)利要求1所述的基因mgATG1的表達(dá)作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
6.利用如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
7.結(jié)合利用如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)以及如權(quán)利要求4所述的啟動(dòng)子作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG1，該基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。該基因mgATG1編碼的cDNA序列具有SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。該基因mgATG1編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。該基因mgATG1的啟動(dòng)子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述基因mgATG1的表達(dá)作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了結(jié)合利用上述蛋白質(zhì)以及啟動(dòng)子作為靶標(biāo)，在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/37GK1995353SQ20061015536
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者盧建平, 林福呈, 劉小紅, 章初龍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)