胰島素的純化的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)公開(kāi)一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含一種胰島素肽和一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，該胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟：a)將所述含有蛋白的溶液裝載于固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0g(g/LCV)；和b)用pH不超過(guò)8.5的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集對(duì)應(yīng)于裝填于步驟(a)中柱上至少75%重量胰島素肽的胰島素肽匯集液。
【專(zhuān)利說(shuō)明】胰島素的純化
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及從含有蛋白的溶液中分離蛋白組分的色譜方法，特別是從相關(guān)雜質(zhì)中分離胰島素肽的色譜方法。
[0002]發(fā)明背景
藥用重組蛋白和肽的純化主要采用液相色譜方法進(jìn)行。色譜方法的特征在于其固定相的屬性，例如疏水性色譜樹(shù)脂的的反相色譜，然而，許多參數(shù)影響分離，如流動(dòng)相的組成。離子交換色譜(IEC)的特征在于固定相的帶電荷表面和流動(dòng)相組成中的緩沖劑、鹽的運(yùn)用以及PH的控制。IEC已證明在分離相關(guān)和非相關(guān)雜質(zhì)兩者中非常有效，然而某些雜質(zhì)可能仍然極其難以除去，例如，靶向多肽和雜質(zhì)存在相同電荷時(shí)。
[0003]GB 694530和GB 729670分別描述在喹啉或吖啶樣物質(zhì)和天然酚類(lèi)物質(zhì)的存在下，以及鋅的存在下，胰島素的結(jié)晶。
[0004]US 5，504，188描述在鋅離子存在下，在pH 5.5_6.5下胰島素類(lèi)似物晶體(LysPro)的制備。
[0005]WO 98/34953描述在含鋅離子的溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)晶，所述蛋白質(zhì)帶有攜帶親脂性取代基的賴(lài)氨酸側(cè)鏈(地特胰島素(detemir))，所述結(jié)晶通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值從酸性至pH 7-10 完成。
[0006]US 3，907，676公開(kāi)一種降低從馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物胰腺(特別是豬和牛的胰腺)中回收的胰島素的抗原性的方法，以及獲得具有約6000的分子量的抗原性胰島素樣類(lèi)似物和分子量在6000以上的胰腺源的某些抗原蛋白的方法。抗原性降低通過(guò)將胰島素經(jīng)通過(guò)優(yōu)選為強(qiáng)堿性的陰離子交換劑的柱色 譜，同時(shí)采用含水的脂族一元醇作為洗脫劑，并收集不含或基本上不含相關(guān)雜質(zhì)的含有胰島素的洗脫物部分來(lái)獲得。
[0007]EP I 071 703公開(kāi)與常規(guī)RPC相比(采用一價(jià)離子)，向流動(dòng)相中添加鈣離子已顯示在糖基化和非糖基化物質(zhì)(特別是胰島素)之間提供一種改善的選擇性。
[0008]US 3，649，456基本上描述在RPC-樣固定相上多肽的緩沖液更換，即在各種鹽(包括氯化鈣)存在下，從水溶液更換為含有有機(jī)溶劑的溶液，。
[0009]US 5，633，350描述在鈣離子存在下，在離子交換樹(shù)脂上從非_K_維生素依賴(lài)性蛋白中分離維生素K-依賴(lài)性蛋白的方法。
[0010]GB 2173503Α描述一種使用弱酸性陽(yáng)離子交換劑，優(yōu)選帶有疏水性基質(zhì)，純化胰島素的方法。胰島素的部分通過(guò)在酸性PH范圍內(nèi)分步或連續(xù)改變?nèi)軇┑臐舛葋?lái)獲得。
[0011]US 4，129，560描述一種純化具有締合傾向的高分子量多肽的方法，其通過(guò)在酸性或堿性離子交換劑上在水性緩沖溶劑中的離子交換色譜進(jìn)行，該方法包括將非離子型去污劑溶解在緩沖溶劑中。
[0012]US 2005-080000Α公開(kāi)一種色譜法純化前胰島素原的方法，其中通過(guò)第一個(gè)陰離子交換柱色譜以流通模式和隨后的第二個(gè)陽(yáng)離子交換柱色譜以吸附模式，從前胰島素原的水溶液中除去較高分子量的物質(zhì)，還公開(kāi)一種制備胰島素的方法，其包括制備前胰島素原的方法。[0013]US 2006-167221A公開(kāi)提取和分離重組來(lái)源的胰島素(特別是表達(dá)在酵母中和通過(guò)酵母分泌的那些)的方法。有機(jī)溶劑被用于提取宿主表面束縛型的胰島素肽。另外，公開(kāi)將介質(zhì)澄清、溶劑萃取和色譜法各步驟結(jié)合的程序，以使得同時(shí)分離和純化可溶的和膜束縛型的胰島素。
[0014]US 5，278，284描述一種從一復(fù)雜的溶液中移出有價(jià)值的蛋白的方法，和回收所述純化形式的有價(jià)值的蛋白的方法，該方法包括向含有所述蛋白的溶液中加入孔徑大小接近蛋白質(zhì)分子大小的硅膠吸附劑，使蛋白質(zhì)被吸附到吸附劑上，從該溶液中分離吸附劑，然后從吸附劑中回收所述蛋白。
[0015]US 6，451，987公開(kāi)一種從含有肽和相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的離子交換色譜法，以及一種包括這種離子交換色譜法的工業(yè)方法。
[0016]某些(通常是相關(guān)的)雜質(zhì)往往由于峰形緣故難以消除或減少，例如前沿峰或拖尾峰中的雜質(zhì)的洗脫。因此，可產(chǎn)生純度不足的所關(guān)注蛋白。
[0017]發(fā)明概述
本申請(qǐng)?zhí)峁┛刂粕V峰 形的方法，以改進(jìn)雜質(zhì)的除去，例如在向色譜固相材料柱上施加高載量的所關(guān)注的蛋白質(zhì)時(shí)而難于除去的相關(guān)雜質(zhì)。色譜峰形通過(guò)在施加(即加載)于色譜柱上含有蛋白溶液中存在的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，并結(jié)合對(duì)洗脫液的PH的調(diào)節(jié)來(lái)控制，例如考慮到所關(guān)注蛋白的等電點(diǎn)(Pl)，從而使得能夠收集到純化形式的所關(guān)注蛋白的高度濃縮的匯集液。
[0018]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)所控制的峰形可允許增加所關(guān)注蛋白的載量，并由此使要純化的蛋白的量容量增大并運(yùn)行縮短，正如可獲得更高蓄積濃度一樣。
[0019]因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含胰島素肽和一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，所述胰島素肽在二價(jià)或者多價(jià)金屬離子存在下，能夠自締合(self-association)和/或結(jié)構(gòu)改變,該方法包含以下步驟:
a.將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和
b.用pH不超過(guò)8.5的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少75%重量胰島素肽的胰島素肽匯集液。
[0020]在第二方面，本發(fā)明涉及一種分離含有胰島素溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含胰島素肽，其在鋅和二價(jià)鋅離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟:
a.將所述含有胰島素的溶液施加于陰離子交換的固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和
b.用pH不超過(guò)6.8的洗脫液從該固相材料中洗脫所關(guān)注的胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少90%重量所關(guān)注的胰島素肽的胰島素肽匯集液。
[0021]在第三方面，本發(fā)明涉及一種在胰島素肽的離子交換色譜中控制峰形的方法，該胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法采用
a.能獲得胰島素肽和相關(guān)雜質(zhì)最佳分離的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，其中已加入二價(jià)金屬離子以確保胰島素肽的前峰形狀，而相關(guān)雜質(zhì)在胰島素肽之前洗脫。
[0022]附圖簡(jiǎn)述圖1-3:在高pH下從拖尾峰處胰島素峰形曲線的變化(圖3中的細(xì)虛線，pH =7.2)，對(duì)應(yīng)在設(shè)定的pH點(diǎn)處某些拖尾的正常的Langmuirian輪廓(圖2中的實(shí)細(xì)曲線，pH = 6.8)，對(duì)應(yīng)在低pH下(圖1中的粗虛線I，pH= 6.4)，流動(dòng)相中(即含蛋白質(zhì)的溶液)Zn2+離子存在下的前沿峰的曲線。
[0023]圖4鋅平衡實(shí)驗(yàn)的色譜圖 發(fā)明詳述
如上所述，本發(fā)明涉及一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法。特別是，其目的是提供一種工業(yè)化應(yīng)用過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程可將所關(guān)注的蛋白從有關(guān)雜質(zhì)中分離出來(lái)，同時(shí)獲得高回收率的所關(guān)注的蛋白。這些相關(guān)雜質(zhì)一般是非抗原性的。
[0024]一方面，本發(fā)明提供一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含胰島素肽和一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，該胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟:
a.將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和
b.用pH不超過(guò)8.5的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少75%重量胰島素肽的胰島素肽匯集液。
[0025]另一方面，本發(fā)明提供一種分離含有胰島素溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含胰島素肽，其在鋅和二價(jià)鋅離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟:
a.將所述含有胰島素的溶液施加于陰離子交換固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和 b.用pH不超過(guò)6.8的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少90%重量所關(guān)注胰島素肽的所關(guān)注胰島素肽匯集液。
[0026]另一方面，本發(fā)明提供一種在胰島素肽的離子交換色譜中控制峰形的方法，該胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法采用
a.能獲得胰島素肽和相關(guān)雜質(zhì)最佳分離的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，其中已加入二價(jià)金屬離子以確保胰島素肽的前峰形狀，而相關(guān)雜質(zhì)在胰島素肽之前洗脫。
[0027]蛋白質(zhì)可源于酵母表達(dá)系統(tǒng)。在蛋白制造過(guò)程中，色譜純化的使用非常廣泛。蛋白質(zhì)通常要進(jìn)行化學(xué)修飾和一系列的色譜純化步驟，特別是柱色譜法，包括高效液相色譜法(或高壓液相色譜法，HPLC)，例如反相色譜(RPC)，疏水性相互作用色譜(HIC)和離子交換色譜法(IEC)(例如陰離子交換色譜法(AIEC)或陽(yáng)離子交換色譜法(CIEC))，親和色譜法，排阻色譜法(size exclusion chromatography),金屬螯合色譜法,假親和色譜法,和/或混合模式色譜法。
[0028]采用柱色譜法純化蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)要分離的蛋白質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的平衡差異。利用固定相和流動(dòng)相的適當(dāng)組合，蛋白質(zhì)將以不同的時(shí)間間隔離開(kāi)柱。在本發(fā)明的上下文中，已發(fā)現(xiàn)，最初裝載于柱中的流動(dòng)相借助于二價(jià)或多價(jià)金屬離子的修飾對(duì)峰形控制提供了改善，從而將所關(guān)注的蛋白從密切相關(guān)的雜質(zhì)中分離出。
[0029]色譜法純化的一個(gè)重要參數(shù)是柱容量，其定義為可結(jié)合到柱中的(靶向)蛋白質(zhì)的量。柱容量取決于流動(dòng)相中蛋白質(zhì)的濃度，并且將作為流動(dòng)相中蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)的固定相中蛋白質(zhì)濃度的描述稱(chēng)為結(jié)合等溫線。結(jié)合等溫線可能是凹面的(色譜峰在前面)或者是凸面的(色譜峰在后面 / 尾隨)[J.M.Mollerup, Chem.Eng.Technol.31 (2008)864-874]。在罕見(jiàn)的情況下，得到S-形的等溫線，其中在低流動(dòng)相濃度下為峰前而在高流動(dòng)相濃度下為峰尾[J.M.Mollerup et al., J.Liq.Chromatogr.Rel.Technol.32(2009) 1577-1597]。
[0030]Mollerup (J.M.Mollerup, Chem.Eng.Technol.31 (2008) 864-874)先前已表明協(xié)同效應(yīng)，其中促進(jìn)另一個(gè)分子吸附的一個(gè)分子的吸附能導(dǎo)致色譜峰前移。
[0031]在色譜法中，具有接近于等溫線的初始斜率的高濃度的斜率，能獲得一種小蓄積體積和高蓄積濃度，這一點(diǎn)是引人注目的。
[0032]發(fā)現(xiàn)某些相關(guān)參數(shù)為:
?二價(jià)或多價(jià)金屬離子(如Zn2+)設(shè)法(is trying to)使等溫線曲率向上。(dq/dc在增加一q是指結(jié)合到固相材料上的蛋白質(zhì)的濃度和c是指溶液中蛋白質(zhì)的濃度)；
?增加樹(shù)脂上的裝載將使曲率下行(dq/dc在減少)；
?在接近于等電點(diǎn)的pH下，凈電荷很小，蛋白質(zhì)之間的排斥力很??；
?接近于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度通常下降。然而自締合可能導(dǎo)致等電點(diǎn)附近的溶解度明顯增加。
[0033]所關(guān)注的蛋白
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”涵蓋蛋白質(zhì)、多肽和由至少十個(gè)通過(guò)肽鍵連接的組分氨基酸殘基所組成的肽。組分氨基酸可以是經(jīng)基 因密碼編碼的氨基酸，并且它們可以是通過(guò)遺傳密碼未編碼的天然氨基酸以及合成氨基酸。
[0034]因此，術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”是一種氨基酸，其在形式上從羧基中除去一個(gè)羥基和/或其在形式上從氨基上脫去一個(gè)氫原子。
[0035]不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸是例如Y-羧基谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基酸包括由化學(xué)合成制備的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib ( α -氨基異丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和鄰氨基苯甲酸。
[0036]22個(gè)產(chǎn)生蛋白的氨基酸:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
[0037]因此，非產(chǎn)生蛋白的氨基酸是可通過(guò)肽鍵并入肽中的部分，但不是產(chǎn)生蛋白的氨基酸。實(shí)例是(但不限于)Y-羧基谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲氨酸、D-型氨基酸，如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非產(chǎn)生蛋白的氨基酸包括化學(xué)合成制備的氨基酸，即經(jīng)遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨基異丁酸)、Abu (α-氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、3_氨基甲基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、脫氨基組氨酸、氨基酸的β類(lèi)似物，如丙氨酸等，D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Ν°-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸、α -甲基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸和4，5，6，7_四氫-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-羧酸-β - (1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
[0038]當(dāng)本文提及時(shí)，術(shù)語(yǔ)“所關(guān)注的蛋白”指與存在于所述含有蛋白的溶液(見(jiàn)下文)中的蛋白質(zhì)相比，獲得一種分離的、濃縮的或純化的形式的理想蛋白質(zhì)。在某些情況下，關(guān)注蛋白在色譜過(guò)程中可經(jīng)歷某些充分限定的變化；當(dāng)然應(yīng)理解的是，在這些情況下，所述含有蛋白質(zhì)溶液中和得到的形式上的所關(guān)注蛋白在化學(xué)或結(jié)構(gòu)上可能不一致。
[0039]現(xiàn)認(rèn)為所述色譜過(guò)程特別適合于在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的實(shí)例是胰島素肽、胰高血糖素樣肽、毒蜥外泌肽、胰高血糖素、hGH、抑肽酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子_2、抑胃肽、生長(zhǎng)激素釋放因子、腦垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽、胰泌素、腸促胃泌素(enterogastrin)、生長(zhǎng)激素抑制素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、甲狀旁腺素、促血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內(nèi)啡肽、腦啡肽、加壓素、催產(chǎn)素、阿片類(lèi)、GIP、肽組氨酸-蛋氨酸酰胺、毒蜥肽、毒蜥皮肽、腦垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽相關(guān)肽、血管活性腸多肽，包括其變體(見(jiàn)下文)。
[0040]目前最值得關(guān)注的蛋白選自胰島素肽、胰高血糖素樣肽和毒蜥外泌肽，包括其變體。
[0041]在某些特別有趣的實(shí)施方案中，所關(guān)注的蛋白選自胰島素多肽，包括其變體。
[0042]一組特別值得關(guān)注的蛋白是由那些在二價(jià)金屬離子(Zn2+)存在下能夠自締合的蛋白質(zhì)所代表的蛋白。
[0043]本文所用的與蛋白質(zhì)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變體”指修飾過(guò)的蛋白，其是所述母體蛋白的類(lèi)似物、所述母體蛋白的衍生物(包括DPP-1V保護(hù)的形式)或所述母體蛋白的類(lèi)似物的衍生物(包括DPP-1V保護(hù)的形式)。
[0044]本文所用的與蛋白質(zhì)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”指修飾過(guò)的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)的一或多個(gè)氨基酸殘基被其它氨基 酸殘基代替和/或其中一或多個(gè)氨基酸殘基從蛋白質(zhì)中缺失和/或其中一或多個(gè)氨基酸殘基從蛋白質(zhì)中缺失和/或其中一或多個(gè)氨基酸殘基被添加到蛋白質(zhì)中。氨基酸殘基的這樣的添加或缺失可以發(fā)生在蛋白質(zhì)的N-末端和/或蛋白質(zhì)的C-末端。通常用兩個(gè)不同且簡(jiǎn)單的系統(tǒng)描述類(lèi)似物:例如Arg34-GLP-1 (7-37)或K34R-GLP-1 (7-37)指一種GLP-1類(lèi)似物，其中天然存在的賴(lài)氨酸在34位被精氨酸代替(氨基酸按IUPAC IUB命名法使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫(xiě))。
[0045]本文所用的與母體蛋白質(zhì)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“衍生物”指經(jīng)化學(xué)修飾的母體蛋白質(zhì)或其類(lèi)似物，其中至少一個(gè)取代基不存在于所述母體蛋白質(zhì)或其類(lèi)似物中，即已被共價(jià)修飾的母體蛋白質(zhì)。典型修飾有酰胺化、碳水化合物化、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等。GLP-1(7-37)衍生物的實(shí)例為 Arg34，Lys26(NE-U-Glu(N°-十六烷酰基)))-GLP-l(7-37)。衍生物還包括所討論的蛋白質(zhì)的DPP-1V保護(hù)形式。
[0046]本文所用的與蛋白質(zhì)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“DPP-1V保護(hù)的”是指一種蛋白質(zhì)，其被化學(xué)修飾以使得該化合物能抵抗血漿肽酶二肽基氨基肽酶-4 (DPP-1V)。已知血漿中的DPP-1V酶與數(shù)種蛋白(如肽激素)的降解有關(guān)，例如GLP-l、GLP-2、毒蜥外泌肽-4等。因此，目前正進(jìn)行相當(dāng)大的努力來(lái)研制易受DPP-1V介導(dǎo)水解的蛋白質(zhì)類(lèi)似物和衍生物，以降低DPP-1V降解速率。在一實(shí)施方案中，DPP-1V保護(hù)的蛋白質(zhì)比GLP-1 (7-37)或唾液素-4 (1_39)對(duì)DPP-1V更具抵抗力。[0047]本文所用的術(shù)語(yǔ)“人胰島素”指人胰島素激素，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是眾所周知的。人胰島素具有兩條多肽鏈，命名為A鏈和B鏈。A鏈?zhǔn)且环N21個(gè)氨基酸的肽，B鏈?zhǔn)且环N30個(gè)氨基酸的肽，兩條鏈通過(guò)二硫化物橋鍵連接:第一橋在A鏈7位的半胱氨酸和B鏈7位的半胱氨酸之間，第二橋在A鏈20位的半胱氨酸和B鏈19位的半胱氨酸之間。第三橋存在于A鏈的6位和11位的半胱氨酸之間。
[0048]在人體內(nèi)，將所述激素合成為由24個(gè)氨基酸的前肽組成的單鏈前體胰島素原(前胰島素原)，接著為在構(gòu)型中含有86個(gè)氨基酸的胰島素原:前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A,其中C是一種31個(gè)氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是A鏈和B鏈的連接肽的斷裂的斷裂位點(diǎn)。
[0049]在此可將“胰島素”理解為人胰島素或來(lái)源于另一物種的胰島素，例如豬或牛胰島素。
[0050]本文所用的術(shù)語(yǔ)“胰島素肽”指肽(蛋白質(zhì))，它或者是胰島素或者是具有胰島素活性的類(lèi)似物或衍生物，即它可激活胰島素受體。
[0051]本文所用的術(shù)語(yǔ)“胰島素類(lèi)似物”是指修飾過(guò)的胰島素，其中胰島素中的一或多個(gè)氨基酸殘基被其它 氨基酸殘基取代和/或其中一或多個(gè)氨基酸殘基被從胰島素中缺失和/或其中向胰島素中添加和/或插入一或多個(gè)氨基酸殘基。所述氨基酸優(yōu)選為可被核苷酸的三重態(tài)(“密碼子”)編碼的氨基酸，參見(jiàn)基因工程。在此，氨基酸可以由它們一般的三個(gè)字母代碼表示，優(yōu)選 Gly、Pro、Ala、Val、Leu、lie、Met、Cys> Phe> Tyr> Trp> His、Lys> Arg、Gin、Asn、Glu、Asp、Ser和Thr?；蛘?，可使用一個(gè)字母代碼。
[0052]在一實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物包括相對(duì)于所述母體胰島素少于8個(gè)的修飾(替換、缺失、添加(包括插入)及其任意組合)，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于7個(gè)的修飾，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于6個(gè)的修飾，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于5個(gè)的修飾，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于4個(gè)的修飾，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于3個(gè)的修飾，或者相對(duì)于所述母體胰島素少于2個(gè)的修飾。
[0053]說(shuō)明胰島素分子中的修飾時(shí)，要敘述氨基酸殘基取代天然氨基酸殘基的鏈(A或B)、位置和一或三個(gè)字母的代碼。
[0054]“連接肽”或“C-肽”指單鏈胰島素原分子的B-C-A多肽序列的連接部分“C”。在人胰島素鏈中，C-肽連接B鏈的30位和A鏈的I位，并且是長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸的殘基。連接肽包括兩個(gè)終端二元氨基酸序列，例如，Arg-Arg和Lys-Arg,其用作切斷A和B鏈的連接肽以形成兩鏈胰島素分子的切割位點(diǎn)。
[0055]“desB30”或“B(l_29) ”指一種缺少B30氨基酸的天然胰島素B鏈或其類(lèi)似物，“A (1-21)”指天然胰島素A鏈。因此，如A21Gly，B28Asp，desB30人胰島素是人胰島素類(lèi)似物，其中A鏈中的21位的氨基酸被甘氨酸取代，B鏈中的28位的氨基酸被天冬氨酸取代，和B鏈中的30位的氨基酸被缺失。
[0056]本文中類(lèi)似“A1”、“A2”和“A3”等的術(shù)語(yǔ)分別表示在胰島素的A鏈的位置1、2和3等中的氨基酸(從N末端計(jì)數(shù))。同樣地，類(lèi)似Β1、Β2和Β3等的術(shù)語(yǔ)分別表示在胰島素的B鏈的位置1、2和3等中的氨基酸(從N末端計(jì)數(shù))。使用氨基酸一個(gè)字母代碼，術(shù)語(yǔ)如Α21Α、A21G和A21Q分別指在Α21位置中的氨基酸是A、G和Q。使用氨基酸三個(gè)字母代碼，對(duì)應(yīng)的表達(dá)式分別是A21Ala，A21Gly和A21Gln。[0057]本文中術(shù)語(yǔ)“A (O) ”或“B (O) ”分別指Al或BI的N-末端的氨基酸的位置。術(shù)語(yǔ)A(-l)或B(-l)分別表示A (O)或B (O)的N-末端的第一個(gè)氨基酸的位置。因此，A (-2)和B(-2)分別表示A(-l)和B(-l)的N-末端的氨基酸的位置，A(-3)和B(_3)分別表示A(_2)和B (-2)的N-末端的氨基酸的位置，依此類(lèi)推。
[0058]本文中術(shù)語(yǔ)“A (O) ”或“B (O) ”分別指Al或BI的N-末端的氨基酸的位置。術(shù)語(yǔ)A(-l)或B(-l)分別表示A (O)或B (O)的N-末端的第一個(gè)氨基酸的位置。因此，A (-2)和B(-2)分別表示A(-l)和B(-l)的N-末端的氨基酸的位置，A(-3)和B(_3)分別表示A(_2)和B (-2)的N-末端的氨基酸的位置，依此類(lèi)推。術(shù)語(yǔ)A22或B31分別表示A21或B30的C-末端的氨基酸的位置。術(shù)語(yǔ)A23或B32分別表示A22或B31的C-末端的第一個(gè)氨基酸的位置。因此，A24和B33分別表示A23或B32的C-末端的氨基酸的位置，依此類(lèi)推。
[0059]胰島素類(lèi)似物的實(shí)例是這些，其中B鏈的28位上的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代,和/或B29位上 的Lys被Pro、Glu或Asp取代。此外，B3位上的Asn可被Thr、Lys、Gln、Glu或Asp取代。在A21位上的氨基酸殘基可以被Gly取代。也可將一或多個(gè)氨基酸添加到A鏈和/或B鏈的C-末端，例如Lys。位置BI上的氨基酸可被Glu取代。位置B16上的氨基酸可被Glu或His取代。胰島素類(lèi)似物的其它實(shí)例是缺失性類(lèi)似物，例如，其中人胰島素中B30氨基酸被缺失的類(lèi)似物(des(B30)人胰島素)，其中人胰島素中BI氨基酸被缺失的胰島素類(lèi)似物(des (BI)人胰島素)，des (B28-B30)人胰島素和des(B27)人胰島素。胰島素類(lèi)似物的實(shí)例還有其中A鏈和/或B鏈具有N-末端延長(zhǎng)的胰島素類(lèi)似物，和其中A鏈和/或B鏈具有C-末端延長(zhǎng)的胰島素類(lèi)似物，如將兩個(gè)精氨酸殘基添加到在B鏈的C-末端。其它實(shí)例是包括上述的突變的組合的胰島素類(lèi)似物。其中A14位上的氨基酸是Asn、Gin、Glu、Arg、Asp、Gly或His, B25位上的氨基酸是His,且其任選還包括一或多個(gè)其它突變的胰島素類(lèi)似物，為胰島素類(lèi)似物的其它實(shí)例。人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中A21位上的氨基酸殘基是Gly，且其中所述胰島素類(lèi)似物在C-末端進(jìn)一步延伸了兩個(gè)精氨酸殘基的人胰島素的胰島素類(lèi)似物，也是胰島素類(lèi)似物的實(shí)例。
[0060]胰島素類(lèi)似物的其它實(shí)例包括:DesB30人胰島素；AspB28人胰島素；AspB28，desB30 人胰島素；LysB3, GluB29 人胰島素；LysB28, ProB29 人胰島素；GlyA21, ArgB31,ArgB32 人胰島素；GluA14, HisB25 人胰島素；HisA14, HisB25 人胰島素；GluA14, HisB25,desB30 人胰島素；HisA14, HisB25, desB30 人胰島素；GluA14, HisB25, desB27, desB28,desB29, desB30 人胰島素；GluA14, HisB25, GluB27, desB30 人胰島素；GluA14, HisB16,HisB25, desB30 人胰島素；HisA14, HisB16, HisB25, desB30 人胰島素；HisA8, GluA14,HisB25, GluB27, desB30 人胰島素；HisA8, GluA14, GluBl, GluB16, HisB25, GluB27, desB30人胰島素；和 HisA8, GluA14, GluB16, HisB25, desB30 人胰島素。
[0061]本文所用的術(shù)語(yǔ)“胰島素衍生物”指化學(xué)修飾的母體胰島素或其類(lèi)似物，其中修飾是附接酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、PEG基化等的形式。人胰島素的衍生物的實(shí)例是人胰島素B30蘇氨酸甲酯，GlyA21, ArgB31, Arg-酰胺B32人胰島素，ΝεΒ29_十四烷酰基desB30人胰島素，ΝεΒ29_十四烷?；艘葝u素，Neb29-癸酰基desB30人胰島素，Nε Β29-十二燒酸基desB30人膜島素,?'-29---]---甲氧基-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基)_丙酸基人膜島素，LysB29 (N ε -十六燒二酸基-Y-Glu) des (Β30)人膜島素)；Neb29-(Na- (Sar-OC (CH2) 13C0) - Y -Glu) desB30 人膜島素，NεΒ29- ω -羧基-十五燒酸基-y -L-谷氨酸基酸胺desB30人膜島素，ΝεΒ29_十六燒二酸基_氨基_ 丁酸基desB30人膜島素，NεΒ29-十六燒二酸基_ Y -L-Glu-酸胺desB30膜島素。
[0062]本文所用的術(shù)語(yǔ)“胰高血糖素樣肽”指同源肽胰高血糖素樣肽I (GLP-1)、胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)和胃泌酸調(diào)節(jié)素(OXM),其源于前胰高血糖素原(preproglucagon)基因、毒蜥分泌肽及其類(lèi)似物和衍生物。發(fā)現(xiàn)于毒蜥中的毒蜥分泌肽是GLP-1的同系物，并且也發(fā)揮促胰島素的作用。毒蜥分泌肽的實(shí)例是毒蜥分泌肽-4和毒蜥分泌肽-3。
[0063]本文所用的術(shù)語(yǔ)“GLP-1肽”意欲指定GLP-1 (7-37) ,GLP-1 (7_36)酰胺及其類(lèi)似物和衍生物，其能夠通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)以及常規(guī)的合成方法制備。這樣的GLP-1肽包括但不限于天然胰高血糖素樣 肽-1，例如WO 87/06941中公開(kāi)的這些包含GLP-1 (7-37)及其功能性衍生物的肽碎片；W0 90/11296中公開(kāi)的這些包含GLP-1 (7-36)及其功能性衍生物的肽碎片；W0 91/11457中公開(kāi)的活性GLP-1肽7-34、7_35、7_36和7-37這些類(lèi)似物；WO 98/08871中公開(kāi)的這些GLP-1衍生物，其中親脂性取代基連接在至少一個(gè)氨基酸殘基上；EP 0699686-A2中公開(kāi)的這些GLP-1的N-末端截短的片段；和EP 0708179-A2公開(kāi)的這些包括N-末端咪唑基團(tuán)的GLP-1類(lèi)似物和衍生物。
[0064]本文所用的術(shù)語(yǔ)“GLP-2 肽”意欲指定 GLP-2 (1-35)、GLP-2 (1-34)、GLP-2(1-33)及其類(lèi)似物和衍生物，其能夠通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)以及常規(guī)的合成方法制備。這些GLP-2肽包括但不限于天然胰高血糖素樣肽-2，如在WO 98/08872中公開(kāi)的GLP-2衍生物，其中親脂性取代基連接在至少一個(gè)氨基酸殘基上，人胰高血糖素樣肽-2 (hGLP-2), GLP-2 (1-30) ；GLP-2(1-31) ；GLP-2(l-32) ;GLP-2(1_33) ;GLP_2 (1—34)，GLP-2 (1-35) , Lys20GLP-2(l-33) , Lys20Arg30GLP-2 (1-33) , Arg30Lys34-GLP-2 (1-34),Arg30Lys35GLP-2(l-35), Arg30, 35Lys20GLP-2 (1-35), Arg35 GLP-2 (1-35), Lys20 (NE-十四烷?；?GLP-2 (1-33) ;Lys2°’3°-雙(Νε -十四烷?；?GLP-2 (1-33) ;Lys2° (Νε -十四烷?；?Arg30GLP-2(l-33) ;Arg3°-Lys35 (Νε -十四烷酰基)GLP-2 (1-35) ;Arg3tu5Lys2° (Νε-十四烷?；?-GLP-2(l-35) ;Arg35Lys3°(NE-十四烷?；?GLP-2 (1-35) ;Arg3°Lys34(Νε-十四烷酰基)GLP-2 (1-34) ;Lys2°(NE-(co-羧基十九烷酰基))GLP-2(1_33) ;Lys2°’3°-雙(Νε-(ω-羧基十九烷?；?)GLP-2 (1-33) ;Lys2°(NE-(co-羧基十九烷酰基))Arg3°GLP-2(l-33)；Arg3°Lys35(NE-(co-羧基十九烷?；?)-GLP-2(1_35) ;Lys3°(Νε-U -谷?；?Ν°_十四烷酰基)))hGLP-2 ;Lys3° (Ne-U-谷?；?N° -十六烷?；?))hGLP-2 ;Arg30'35Lys20 (Nε - (ω -羧基十九烷酰基))GLP-2 (1-35) ；Arg35Lys30 (Nε - (ω -羧基十九烷?；?)GLP-2 (1-35);和 Arg3ciLys34 (Νε-(ω-羧基十九烷?；?)GLP-2 (1-34)。
[0065]本文所用的術(shù)語(yǔ)“毒蜥外泌肽”意欲指定毒蜥外泌肽及其同系物、衍生物和碎片，例如毒蜥外泌肽-3和-4。毒蜥外泌肽及其同系物、衍生物和片段在例如WO 99/43708中有描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容全文結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
[0066]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種除去針對(duì)所關(guān)注蛋白的一或多種相關(guān)雜質(zhì)的方法。
[0067]本文所用的術(shù)語(yǔ)“相關(guān)雜質(zhì)”指具有與所關(guān)注蛋白的結(jié)構(gòu)性相似的雜質(zhì)。相關(guān)雜質(zhì)比所關(guān)注蛋白具有不同的化學(xué)或物理結(jié)構(gòu)，例如截短的形式、延長(zhǎng)的形式(額外的氨基酸、各種衍生物等)、脫去酰胺基的形式、錯(cuò)誤折疊的形式、不需要的(例如過(guò)量、不正確或不足的)糖基化形式、包括唾液酸化作用(sialylation)、氧化形式、外消旋作用得到的形式、其中酰基化發(fā)生在不是要求基團(tuán)而是另一殘基上的形式，以及其它形式。[0068]在一實(shí)施方案中，這樣的相關(guān)雜質(zhì)在所關(guān)注蛋白之前洗脫。
[0069]隨后接下來(lái)的本文所用的術(shù)語(yǔ)“非相關(guān)雜質(zhì)”，意欲涵蓋不同于相關(guān)雜質(zhì)的雜質(zhì)。
[0070]與相關(guān)雜質(zhì)相反，非相關(guān)雜質(zhì)可以具有抗原性。
[0071]含有蛋白的溶液
所述色譜過(guò)程的原料可以是任何含有蛋白的溶液，其包含所關(guān)注的蛋白，如選自下列的蛋白:胰島素肽、胰高血糖素樣肽和毒蜥外泌肽，包括其變體(見(jiàn)上文)。所述原料可以是直接從酵母表達(dá)系統(tǒng)或者直接化學(xué)合成的得到的中間物(medium)，或者可將所述原料在進(jìn)行本發(fā)明過(guò)程之前進(jìn)行數(shù)次純化或化學(xué)修飾步驟。
[0072]在某些值得關(guān)注的實(shí)施方案中，所述含有蛋白的溶液包含一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子。不受任何特定的理論的束縛，目前認(rèn)為這樣的二價(jià)或多價(jià)金屬離子能促進(jìn)所關(guān)注蛋白的自締合和/或結(jié)構(gòu)變化，由此色譜過(guò)程中的峰形將會(huì)改善，使得相近的相關(guān)雜質(zhì)，特別是所關(guān)注蛋白之前洗脫的雜質(zhì)，能與所關(guān)注的蛋白分離。
[0073]胰島素的顯著特性是其締合成六聚體的能力，以這種形式激素在生物合成和儲(chǔ)存過(guò)程中免受化學(xué)或物理降解。胰島素的X-射線晶體學(xué)研究表明六聚體由三個(gè)與3倍旋轉(zhuǎn)軸相關(guān)的二聚體組成。這些二聚體通過(guò)與處于3倍軸上核芯 位置處的兩個(gè)鋅離子的相互作用而緊密締合。
[0074]二價(jià)或多價(jià)金屬離子(包括過(guò)渡金屬離子)的適合實(shí)例為那些選自下列的離子:Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+，優(yōu)選Zn2+。所述含有蛋白的溶液中可存在兩種或更多種類(lèi)型的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，或者僅一種類(lèi)型。
[0075]所述含有蛋白的溶液中的二價(jià)或多價(jià)金屬離子的濃度范圍一般為0.01-200 mM,如 0.1-100 mM 或者 0.5-75 mM。
[0076]所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子和所關(guān)注蛋白的電荷當(dāng)量之間的比例(即每個(gè)所關(guān)注的蛋白分子的當(dāng)量負(fù)載)一般為0.1:1 -50:1，如0.3:1 - 20:1，例如0.4:1 - 15:1或者0.5:1 - 10:1。
[0077]在其中所關(guān)注的蛋白是胰島素肽的情況下，所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子(如Zn2+離子)和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例一般為1:6 - 20:6，如2:6 - 15:6，例如3:6 -10:6,或者3:6 - 5:6或7:6 - 9:6。例如，可將每個(gè)胰島素分子兩個(gè)鋅離子理解為4:1的二價(jià)或多價(jià)金屬離子(如Zn2+離子)和胰島素的電荷當(dāng)量之間的比例(即(2個(gè)鋅*每個(gè)鋅2個(gè)電荷):I)。在Zn2+存在下，胰島素能夠通過(guò)形成六聚物、二 -六聚物或者甚至更大的胰島素肽復(fù)合物的自締合，所述更大的胰島素肽復(fù)合物仍是可溶性的，其可用于胰島素的結(jié)晶中。因此，在某些實(shí)施方案中，含蛋白質(zhì)的溶液可從用鋅結(jié)晶的胰島素肽中獲得。
[0078]還可能要求或必須通過(guò)將水加入到所述含有蛋白的溶液中來(lái)調(diào)節(jié)任何溶劑的濃度或者降低離子強(qiáng)度。PH可通過(guò)適合的緩沖劑進(jìn)行調(diào)節(jié)，可加入溶劑(如乙醇)以增加所關(guān)注蛋白的溶解度。因此，所述含有蛋白的溶液還可包含溶劑、鹽、緩沖劑、改性劑/賦形劑(有機(jī)或無(wú)機(jī)的)。所述有機(jī)溶劑可以是但不限于任何單羥基脂肪醇(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)，例如甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇和己二醇。用于色譜純化的任何部分的任選的鹽組分可以是任何鹽，包括但不限于=NaCl、KC1、NH4C1、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨等?？墒褂萌魏尉彌_劑組分，包括但不限于:檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、TRIS緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、銨鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖劑等。在一實(shí)施方案中，溶劑是PH范圍為5-9的pH-緩沖劑。
[0079]所述含有蛋白溶液的離子強(qiáng)度(以25°C的電導(dǎo)率表示)也可發(fā)揮作用。因此，在某些實(shí)施方案中，所述含有蛋白溶液的電導(dǎo)率范圍為0-100 mS/cm，如0-50 mS/cm，例如0_30mS/cm，或者 0.01-100 mS/cm，如 0.05-50 mS，例如 0.1-30 mS/cm。
[0080]所述含有蛋白溶液的pH—般保持在0-14、1-13、2-12、3-11或4-10的范圍。然而在很多情況下，所述含有蛋白溶液的PH都與洗脫劑的pH大致相同。
[0081]色譜方法
所述色譜方法的目的是從含有蛋白的溶液的其它組分中分離出所關(guān)注的蛋白，或者獲得高純度的所關(guān)注的蛋白，或者至少降低與所關(guān)注蛋白相關(guān)的一或多種雜質(zhì)的存在。
[0082]以下將詳細(xì)說(shuō)明所述色譜方法。
[0083]步驟(a)
在依據(jù)本發(fā)明的方法的第一步驟中，將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱上。
[0084]所述固相材料根據(jù)色譜方法的類(lèi)型選擇，例如反相色譜法(RPC)、離子交換色譜法(IEC)，如陰離子交換色譜法(AIEC)或陽(yáng)離子交換色譜法(CIEC)疏水性相互作用色譜法(HIC)、親和力色譜法、排阻(size exclusion)色譜法、金屬螯合色譜法、假親和力色譜法、混合式色譜法等。因此，所述固相材料可選自離子交換色譜材料(IEC)、反相色譜材料(RPC)、疏水性相互作用色譜材料(HIC)等。優(yōu)選使用離子交換色譜材料，尤其是陰離子交換色譜材料。
[0085]對(duì)于需要離子交換色譜法而論，固相材料的選擇可依據(jù)要純化的特定肽和所用的條件而定，如pH、緩沖劑、離子強(qiáng)度等，這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是已知的(即，一般地，對(duì)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，PH低于肽的等電點(diǎn)(pi)，對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂，pH高于肽的P〗，保持所要求PH的足夠的緩沖劑強(qiáng)度，以及可能由所述鹽濃度引起的足夠低的離子強(qiáng)度)。適合的固相材料的非限定實(shí)例是瓊脂糖(Sepharose)樹(shù)脂、交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)樹(shù)月旨、Streamline樹(shù)脂、和源于Amersham-Pharmacia Biotech的樹(shù)脂、HyperD樹(shù)脂、得自BioSepra的Trisacryl樹(shù)脂和多孔微球娃膠(Spherosil)樹(shù)脂、得自TosoHaas的TSKgel樹(shù)脂和 Toyopearl 樹(shù)脂、得自 Merck 的 Fractogel EMD 樹(shù)脂、得自 Perseptive Biosystems的粗?；?guī)r(Poros)樹(shù)脂、得自BioRAD的Macro-Prep樹(shù)脂、得自Whatman的Express-離子(Express-1on)樹(shù)脂等。
[0086]對(duì)于反相色譜法，固相材料可以選擇任何任選帶有任何種類(lèi)取代的色譜反相樹(shù)脂，包括但不限于:娃膠基樹(shù)脂，如Kromasil 100 C18,聚合物基樹(shù)脂，如AmershamBiosciences來(lái)源的樹(shù)脂,來(lái)源于Applied Biosystems的粗粒灰?guī)r(Poros)材料,如PorosRl、R2和R3反相樹(shù)脂，來(lái)源于Ciphergen的陶瓷性樹(shù)脂，金屬氧化物基樹(shù)脂和其它樹(shù)脂。優(yōu)選使用硅膠基樹(shù)脂。施用的平衡溶液(在步驟(a)前平衡該固相材料的溶液)和含有蛋白質(zhì)溶液可以包含或可以不包含有機(jī)溶劑。所述有機(jī)溶劑可以是但不限于任何單羥基脂肪醇(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)，例如甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丙醇和己二醇。用于色譜純化的任何部分的任選鹽組分可以是任何鹽，包括但不限于:NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨等?？墒褂萌魏尉彌_劑組分，包括但不限于:檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、TRIS緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、銨鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖劑等。在一實(shí)施方案中，溶劑是范圍為pH 5-pH 9的pH-緩沖劑。
[0087]在一實(shí)施方案中，反相高效液相色譜法采用硅膠基色譜樹(shù)脂進(jìn)行，例如取代的硅膠，如c4-、C6-, C8-, C12-, C16-, C18-, c2(l-、苯基或苯-取代的硅膠。在另一實(shí)施方案中，反相高效液相色譜法采用為聚合物基材料的色譜樹(shù)脂進(jìn)行。
[0088]對(duì)于疏水相互作用色譜法，固相材料為用疏水配體取代的基質(zhì),疏水配體為例如乙基、丁基、苯基或己基(其明顯用于結(jié)合所述蛋白)。優(yōu)選的材料是那些被丁基和/或苯基配體取代的材料。
[0089]使用的固相材料常常以珠粒形式存在，例如具有平均粒徑范圍為0.1-1000 μπι,例如1-100 Mm范圍的微粒材料。固相材料適宜于安排在用泵等排列的HPLC柱中，這對(duì)于技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。
[0090]將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱中一般可根據(jù)常規(guī)的方案進(jìn)行，即所述含有蛋白的溶液的濃度、溫度、離子強(qiáng)度等可以是常規(guī)的(此處建議進(jìn)行修改)，施加前，可按常規(guī)對(duì)該疏水相互作用的色譜材料進(jìn)行洗滌和平衡。
[0091]已發(fā)現(xiàn)所關(guān)注蛋白的裝載量可以非常高，例如每升柱體積(g/Lcv)至少6.0 g的所關(guān)注蛋白，并且由于在該方法中改善了峰形，與常規(guī)方法相比，匯集液體積也有所降低。在某些實(shí)施方案中，所關(guān)注蛋白的裝載量為至少7.0 8/1-，或至少8.0 g/LCT，或至少8.5 g/Lcv,或 6.0-50 g/Lcv,或 7.0-40 g/Lcv,或 8.0-30 g/Lcv,例如 8.5-25 g/Lcv,例如 9.0-20 g/1?或9.5-15 g/Lcvo所關(guān)注蛋白的裝載量可最大裝載至高達(dá)柱的容積。柱容積一般相當(dāng)于填充的膨脹色譜固相材料的體積。
[0092]雖然那里沒(méi)有限定，但本發(fā)明的方法特別適宜于“大規(guī)?！?或者“工業(yè)規(guī)模”)的目的。因此，在某些重要的實(shí)施方案中，所述過(guò)程為大規(guī)模過(guò)程，其中柱容積為至少I(mǎi) L，或者至少10 L，或者至少20 L，或者至少50 L，或者至少100 L，例如至少500 L，例如至少1000 L，或者至少5000 L0
[0093]雖然不特別嚴(yán)格，但可能希望調(diào)節(jié)柱和含蛋白的溶液的溫度，以進(jìn)一步改善峰形。一般地，所述溫度為0-70°C，0-50°C，如2 - 30°C?？赏ㄟ^(guò)采用冷卻套和控溫的溶液，將柱溫保持在特定的徂圍。
[0094]步驟(b)
在本方法的第二步驟中，其一般無(wú)需中斷整個(gè)過(guò)程來(lái)進(jìn)行，將所關(guān)注的蛋白通過(guò)洗脫劑從固相材料中洗脫。
[0095]工業(yè)化純化過(guò)程中離子交換色譜法中洗脫的典型原理是或者以不連續(xù)梯度或者線性梯度，在恒定PH的緩沖水溶液中鹽組分的梯度洗脫。也可能是等度洗脫。可向洗脫液中加入有機(jī)溶劑或改性劑以保持所要求形式的所述蛋白或者僅保持在溶液中。并且，有時(shí)可用PH的改變來(lái)洗脫所關(guān)注的蛋白。
[0096]對(duì)于疏水相互作用的色譜過(guò)程，洗脫的類(lèi)型并不特別嚴(yán)格，因此，可能采用包含一種分級(jí)降低鹽和/或兩性離子的梯度的洗脫緩沖液洗脫，用線性降低鹽的梯度(或梯度-保持梯度特性或者其它變體)洗脫，或者用PH梯度洗脫，或者用溫度梯度洗脫，或者以上提及的組合形式洗脫?；蛘?，可用鈣螯合劑化合物(如EDTA、檸檬酸鹽、丙二酸鹽等)或者極性小于水的溶劑(如含有乙醇、PEG, 2-丙醇等的水溶液)的梯度作為洗脫緩沖劑。在一實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含一種起始濃度范圍為0.7-2.2 M的鹽。因此，在一實(shí)施方案中，洗脫緩沖劑是關(guān)于銨鹽的梯度緩沖劑，其中梯度緩沖液的銨鹽的起始濃度范圍為1.7-2.2M，梯度緩沖液的銨鹽的終濃度范圍為0.0-1.6 M。最終洗脫緩沖液的電導(dǎo)率優(yōu)選低于步驟(a)中含有蛋白的溶液的電導(dǎo)率。在很多情況下，步驟(b)中的洗脫緩沖液具有與步驟(a)中相同的pH。
[0097]對(duì)于反相高效液相色譜法，洗脫用溶劑一般為范圍從pH 4至pH 10的pH緩沖液。洗脫液可包含濃度從10 %w/w至80 %w/w的醇?？蓪⑺P(guān)注蛋白和雜質(zhì)在一有機(jī)溶劑中經(jīng)一步驟、漸近或線性變化梯度或等度或這些方式的組合進(jìn)行洗脫和分離。有機(jī)溶劑組分梯度將從較低到較高濃度。也可通過(guò)改變洗脫過(guò)程中的PH和/或溫度進(jìn)行洗脫。
[0098]起始pH、緩沖液和離子強(qiáng)度的選擇可根據(jù)熟知的技術(shù)進(jìn)行，例如常規(guī)的試管法，可參見(jiàn)例如 Amersham-Pharmacia Biotech 手冊(cè)或者 Fundamentals of preparative andnonlinear chromatography (制備和非線性色譜法原理)，Georges Guiochon, Dean G.Shirazij Attila Felingerj Anita M.Kattij Academic Press, 2006。
[0099]在一實(shí)施方案中，洗脫液包含選自任何有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽的鹽組分，優(yōu)選NaCl、KC1、NH4C1、CaCl2、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、乙酸鈣及其混合物，最優(yōu)選乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、NaCl、NH4C1、KCl。
[0100]所述鹽組分一般以0.1 mM - 3000 mM，優(yōu)選I mM - 1000禮，更優(yōu)選5 mM - 500,最優(yōu)選20 mM - 300 mM的濃度存在。
[0101]洗脫液也可包含緩沖劑，例如選自檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、三羥基甲基氨基甲烷(tris)緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、乳酸鹽緩沖劑、甘氧?；拾彼峋彌_劑、精氨酸緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、乙酸鹽 緩沖劑、谷氨酸鹽緩沖劑、銨鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、烷基胺緩沖劑、氨基乙醇緩沖劑、乙二胺緩沖劑、三-乙醇緩沖劑、咪唑緩沖劑、吡啶緩沖劑和巴比妥酸鹽緩沖劑及其混合物，優(yōu)選檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸鈉、磷酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、碳酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸鉀、谷氨酸鉀、碳酸鉀、三羥基甲基氨基甲烷和硼酸及其混合物。
[0102]緩沖劑一般以0.1 mM - 500 mM，優(yōu)選 I mM - 200 禮，更優(yōu)選 5 mM - 100 mM，最優(yōu)選10 mM - 50 mM的濃度存在。
[0103]洗脫液的pH —般不超過(guò)8.5，如不超過(guò)8.0,或者不超過(guò)7.5，或者不超過(guò)7.0，或者不超過(guò)6.9,或者至少6.8,或者至少6.7,或者至少6.6,或者至少6.5,例如范圍為4.5-8.5，或者 4.5-8.0,或者 4.5-7.5，或者 4.5-7.0,例如 4.6-8.0,或者 4.6-7.5，或者4.6-7.0，或者 4.6-6.9，或者 4.7-7.5，或者 4.7-7.0，或者 4.7-6.7，或者 4.8-7.5，或者4.8-7.0,或者 4.8-6.6，或者 4.9-6.5，或者 5.0-6.4。
[0104]已發(fā)現(xiàn)如果洗脫液的pH高于所關(guān)注蛋白的pi不超過(guò)2.1個(gè)單位，例如高于不超過(guò)1.9個(gè)單位,如高于不超過(guò)1.7個(gè)單位,則可甚至進(jìn)一步改善該過(guò)程。
[0105]此處所用的術(shù)語(yǔ)“pi”或“等電點(diǎn)”指其中所述蛋白的總凈電荷為O時(shí)的pH值。
[0106]在某些實(shí)施方案中，洗脫液還可包括一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，例如以上對(duì)所述含有蛋白溶液進(jìn)一步提及的那些。
[0107]不受任何特定的理論的束縛，目前認(rèn)為洗脫液中這樣的二價(jià)或多價(jià)金屬離子的存在能保護(hù)步驟(a)中誘發(fā)的所關(guān)注蛋白的自締合和/或結(jié)構(gòu)變化，由此色譜過(guò)程中的峰形將會(huì)改善，使得相近的相關(guān)雜質(zhì)，特別是所關(guān)注蛋白之前洗脫的雜質(zhì)，能與所關(guān)注的蛋白分離。[0108]二價(jià)或多價(jià)金屬離子(包括過(guò)渡金屬離子)的適合實(shí)例為那些選自下列的離子:Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+，優(yōu)選Zn2+。洗脫液中可存在兩種或更多種類(lèi)型的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，或者僅一種類(lèi)型的二價(jià)或多價(jià)金屬離子。
[0109]當(dāng)洗脫液中有二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在時(shí)，其濃度優(yōu)選范圍為0.1-200 mM，如
0.5-100 mM 或者 1.0-60 mM。
[0110]在一特別的實(shí)施方案中，洗脫液包含Zn2+離子，其濃度范圍例如為0.01-200 mM,如 0.1-100 mM,例如 0.5-75 mM。
[0111]洗脫液中所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子和所關(guān)注蛋白的電荷當(dāng)量之間的比例(即每個(gè)關(guān)注蛋白分子的當(dāng)量電荷)一般為0.1:1 - 50:1，如0.3:1 - 20:1，例如0.4:1 - 15:1或者 0.5:1 - 10:1。
[0112]在其中所關(guān)注蛋白是胰島素肽的情況下，洗脫液中所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子(如Zn2+離子)和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例一般為1:6 - 20:6，如2:6 - 15:6，例如3:6-10:6，或者 3:6 - 5:6 或 7:6 - 9:6。
[0113]在洗脫液中，收集所關(guān)注的蛋白。因此，本發(fā)明的一個(gè)特征是收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的所關(guān)注蛋白的至少75%重量的所關(guān)注蛋白的匯集液。在某些實(shí)施方案中，步驟(b)中收集所關(guān)注的蛋白匯集液相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的所關(guān)注蛋白的至少80%重量，例如至少85%重量,或者至少90%重量,或者至少91%重量,或者至少92 %重量,或者至少93 %重量,或者至少94 %重量,或者至少95 %重量,或者至少96 %重量。
[0114]通過(guò)本發(fā)明的過(guò)程，能夠從所關(guān)注蛋白 的匯集液中排除任何接近的相關(guān)蛋白。
[0115]應(yīng)清楚的是在洗脫步驟(步驟(b))之前，可能需要在步驟(a)之后但在步驟(b)之前包括一個(gè)使用洗滌緩沖液的洗滌步驟。洗滌緩沖液一般是包含緩沖劑的水溶液，緩沖劑一般包含至少一種選自以下的酸和鹽的組分:MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、組氨酸、咪唑、甘氨酸、雙甘氨肽、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸鈉)、乳酸、戊二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸和琥珀酸。應(yīng)清楚的是所述緩沖劑可包含兩種或更多種組分的混合物，其中該混合物能夠提供特定范圍的PH值?？梢蕴峒暗睦佑幸宜岷?或乙酸鈉等。應(yīng)進(jìn)一步理解洗滌步驟(b)可采用1、2或更多種不同的洗滌緩沖液進(jìn)行，或者通過(guò)應(yīng)用梯度洗滌緩沖液進(jìn)行。還應(yīng)注意的是洗滌步驟和洗脫步驟不必是分立的步驟，但可以組合，尤其是如果在所述洗脫步驟中利用梯度洗脫緩沖液時(shí)。
[0116]如果要求，可將從本發(fā)明過(guò)程(步驟(a)和(b))得到的產(chǎn)物經(jīng)歷進(jìn)一步的常規(guī)純化和分離步驟。
[0117]本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案
在一當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離含有胰島素溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含胰島素肽，該胰島素肽在鋅和二價(jià)鋅離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟:
a.將所述含有胰島素的溶液施加于陰離子交換固相材料的色譜柱上，其中所關(guān)注的胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和
b.用pH不超過(guò)6.8的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集對(duì)應(yīng)于相當(dāng)于步驟(a)中柱的至少90%重量的所關(guān)注胰島素肽的所關(guān)注胰島素肽匯集液。
[0118]在以上一實(shí)施方案中，所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子(如Zn2+離子)和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例一般為1:6 - 20:6，如2:6 - 15:6，例如3:6 - 10:6，或者3:6 - 5:6,或者 7:6 - 9:6。
[0119]現(xiàn)在以下段落中改善本發(fā)明:
1.一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法，該溶液包含一種胰島素肽和一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，該胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，該方法包含以下步驟:
a.將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和
b.用pH不超過(guò)8.5的洗脫液從該固相材料中洗脫胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少75%重量胰島素肽的胰島素肽匯集液。
[0120]2.依據(jù)段落I的方法，其中所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子選自Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+，優(yōu)選 Zn2+。
[0121]3.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述溶液中二價(jià)或多價(jià)金屬離子的濃度范圍為0.01-200 禮，如 0.1-100 禮，例如 0.5-75 mM。
[0122]4.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述二價(jià)或多價(jià)金屬離子和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例一般為0.1:1 - 50:1，如0.3:1 - 20:1，例如0.4:1 - 15:1或者0.5:1 -10:1。
[0123]5.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述含有蛋白溶液的電導(dǎo)率范圍為0-100 mS/cm，如 0-50 mS/cm，例如 0-30 mS/cm，或者 0.01-100 mS/cm，如 0.05-50 mS，例如 0.1-30 mS/cm。
[0124]6.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述固相材料選自離子交換色譜材料(IEC)、反相色譜材料(RPC)、疏水性相互作用色譜材料(HIC)，如離子交換色譜材料，尤其是陰離子交換色譜材料。
[0125]7.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述胰島素肽的裝載量至少為7.0 g/LCT，或者至少 8.0 g/Lcv,或者至少 8.5 g/Lcv,或者 6.0-50 g/Lcv,或者 7.0-40 g/Lcv,或者 8.0-30 g/Lcv,如 8.5-25 g/Lcv,如 9.0-20 g/Lcv,或者 9.5-15 g/Lcv。
[0126]8.依據(jù)任一前述段落的方法，其中洗脫液的pH不超過(guò)8.5，如不超過(guò)8.0，或者不超過(guò)7.5,或者不超過(guò)7.0,或者不超過(guò)6.9,或者至少6.8,或者至少6.7,或者至少
6.6，或者至少6.5，例如范圍為4.5-8.5，或者4.5-8.0，或者4.5-7.5，或者4.5-7.0，例如 4.6-8.0,或者 4.6-7.5，或者 4.6-7.0,或者 4.6-6.9，或者 4.7-7.5，或者 4.7-7.0,或者4.6-6.7，或者 4.8-7.5，或者 4.8-7.0,或者 4.8-6.6，或者 4.9-6.5，或者 5.0-6.4。
[0127]9.依據(jù)任一前述段落的方法，其中洗脫液的pH高于胰島素肽的pi不超過(guò)2.1個(gè)單位，例如高于不超過(guò)1.9個(gè)單位,如高于不超過(guò)1.7個(gè)單位。
[0128]10.依據(jù)任一前述段落的方法，其中步驟(b)中收集的胰島素肽匯集液量相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的胰島素肽的至少80%重量，如至少85%重量，或者至少90%重量，或者至少91%重量,或者至少92 %重量,或者至少93 %重量,或者至少94 %重量,或者至少95 %重量,或者至少96 %重量。`
[0129]11.依據(jù)任一前述段落的方法，其中洗脫液中二價(jià)或多價(jià)金屬離子的濃度范圍為0.1-200 mM,如 0.5-100 mM 或 1.0-60 mM。[0130]12.依據(jù)任一前述段落的方法，其中洗脫液中二價(jià)或多價(jià)金屬離子和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例為0.1:1 - 50:1，如0.3:1 - 20:1，例如0.4:1 - 15:1或者0.5:1 -10:1。
[0131]13.依據(jù)任一前述段落的方法，其中洗脫液包含Zn2+離子，例如，其濃度范圍為0.1-200 禮，如 0.1-100 禮，例如 0.5-75 mM。
[0132]14.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述胰島素肽選自胰島素肽類(lèi)、胰高血糖素樣肽類(lèi)和毒蜥外泌肽，包括其變體，尤其是選自胰島素肽，包括其變體。
[0133]15.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述含有蛋白的溶液由用鋅結(jié)晶的胰島素肽獲得。
[0134]16.依據(jù)任一前述段落的方法，其是大規(guī)模的過(guò)程，其中柱體積為至少I(mǎi) L，或者至少10 L，或者至少20 L，或者至少50 L，或者至少100 L，如至少500 L，例如至少1000 L，或者至少5000 L0
[0135]17.依據(jù)任一前述段落的方法，其中所述胰島素肽選自胰島素衍生物，胰島素衍生物為天然存在的胰島素或其類(lèi)似物，其具有側(cè)鏈，該側(cè)鏈與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基或與該母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε -氨基相連接，該側(cè)鏈具有以下通式:
-W-X-Y-Z 其中W是:
?在所述側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的α-氨基酸殘基，該殘基通過(guò)其羧酸基團(tuán)之一與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基一起或與該母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺基；
?包含2、3或4個(gè)通過(guò)酰胺鍵連接在一起的α-氨基酸殘基的鏈，該鏈通過(guò)酰胺鍵與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基或與該母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε -氨基相連接，所述W的氨基酸殘基選自具有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基和在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基，以使得W具有至少一個(gè)在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基；或者
?X與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者該母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基相連接的共價(jià)鍵；
X是:
【權(quán)利要求】
1.一種分離含有蛋白溶液的蛋白組分的色譜方法，所述溶液包含胰島素肽和一或多種二價(jià)或多價(jià)金屬離子，所述胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，所述方法包括以下步驟: a.將所述含有蛋白的溶液施加于固相材料的色譜柱上，其中所述胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和 b.用pH不超過(guò)8.5的洗脫液從所述固相材料洗脫胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少75%重量胰島素肽的胰島素肽匯集液。
2.一種分離含有胰島素溶液的蛋白組分的色譜方法，所述溶液包含胰島素肽，其在鋅和二價(jià)鋅離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，所述方法包含以下步驟: a.將所述含有胰島素的溶液施加于陰離子交換的固相材料的色譜柱上，其中所關(guān)注的胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和 b.用pH不超過(guò)6.8的洗脫液從所述固相材料洗脫所關(guān)注的胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少90%重量所關(guān)注胰島素肽的所關(guān)注胰島素肽的匯集液。
3.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述二價(jià)金屬離子是Zn2+，并且溶液中所述鋅離子的濃度范圍為0.01-200禮，如0.1-100禮，例如0.5-75禮。
4.依據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述鋅離子和胰島素肽的電荷當(dāng)量之間的比例一般為 0.1:1 - 50:1，如 0.3:1 - 20:1，例如 0.4:1 - 15:1 或者 0.5:1 - 10:1。
5.依據(jù)前述權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中洗脫液的pH不超過(guò)6.8，如不超過(guò)6.6,或者不超過(guò)6.4,或者不超過(guò)6.2,或者不超過(guò)6.0,或者至少4.0,或者至少4.4,或者至少4.8,或者至少5.0，例如在4.0-6.8,或者4.4-6.8,或者4.8-6.8,或者4.0-6.8,例如 4.0-6.6，或者 4.0-6.4，或者 4.0-6.2，或者 4.0-6.0,或者 4.4-6.8，或者 4.4-6.6，或者 4.4-6.4,或者 4.8-6.8,或者 4.8-6.6,或者 4.8-6.2,或者 5.0-6.8,或者 5.0-6.6 范圍內(nèi)。
6.依據(jù)前述權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)中收集的胰島素肽的匯集液為施加于步驟(a)中柱的胰島素肽的至少91%重量，或者至少92 %重量，或者至少93 %重量，或者至少94 %重量,或者至少95 %重量,或者至少96 %重量。
7.依據(jù)前述權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素肽選自胰島素衍生物，胰島素衍生物為天然存在的胰島素或其類(lèi)似物，其具有側(cè)鏈，所述側(cè)鏈與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基相連接，所述側(cè)鏈具有以下通式: -W-X-Y-Z 其中W是: ?在所述側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的α-氨基酸殘基，所述殘基以其羧酸基團(tuán)之一與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基一起或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺基； ?包含2、3或4個(gè)通過(guò)酰胺鍵連接在一起的α-氨基酸殘基的鏈，所述鏈通過(guò)酰胺鍵與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε -氨基相連接，所述W的氨基酸殘基選自具有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基和在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基，以使得W具有至少一個(gè)在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基；或者 ?X與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基相連接的共價(jià)鍵； X是:
8.依據(jù)前述權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素肽為L(zhǎng)ysB29(N ε -十六烷--酸基-Y _Glu) des (B30)人膜島素。
9.一種依據(jù)前述權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離含胰島素溶液的蛋白組分的色譜方法，所述溶液包含LysB29 (N ε -十六烷二酰基-Y -Glu) des (B30)人胰島素和二價(jià)鋅離子，所述方法包括以下步驟: a.將所述含有胰島素的溶液施加于陰離子交換固相材料的色譜柱上，其中所關(guān)注的胰島素肽的裝載量為至少每升柱體積6.0 g (g/Lcv);和 b.用pH范圍6.4-6.8的洗脫液從所述固相材料洗脫所關(guān)注的胰島素肽；并收集相當(dāng)于施加于步驟(a)中柱的至少90%重量的LysB29 (N ε -十六烷二?；?、-Glu) des (B30)人膜島素的LysB29 (Ne -十六燒二酸基-Y -Glu) des (B30)人膜島素的匯集液。
10.依據(jù)權(quán)利要求1、2或9的方法，其中在步驟(a)之后和洗脫步驟(b)之前，包括一個(gè)用包含乙醇和三乙醇胺的洗滌緩沖液洗滌的步驟。
11.依據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素肽是具有下式的胰島素衍生物及其任何Zn2+復(fù)合物:
12.—種在胰島素肽的離子交換色譜中控制峰形的方法，所述胰島素肽在二價(jià)或多價(jià)金屬離子存在下能夠自締合和/或結(jié)構(gòu)改變，所述方法采用 a.能獲得胰島素肽和相關(guān)雜質(zhì)的最佳分離的二價(jià)或多價(jià)金屬離子，其中已加入二價(jià)金屬離子以確保胰島素肽的前峰形狀，而相關(guān)雜質(zhì)在胰島素肽之前洗脫。
13.依據(jù)前述權(quán)利要求12的方法，其中所述胰島素肽選自胰島素衍生物，胰島素衍生物為天然存在的胰島素或其類(lèi)似物，其具有側(cè)鏈，所述側(cè)鏈與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε -氨基相連接，所述側(cè)鏈具有以下通式: -W-X-Y-Z 其中W是: ?在所述側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的α-氨基酸殘基，所述殘基通過(guò)其羧酸基團(tuán)之一與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基一起或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺基； ?包含2、3或4個(gè)通過(guò)酰胺鍵連接在一起的α-氨基酸殘基的鏈，所述鏈通過(guò)酰胺鍵與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α -氨基或與所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε -氨基相連接，所述W的氨基酸殘基選自具有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基和在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基，以使得W具有至少一個(gè)在側(cè)鏈中具有羧酸基團(tuán)的氨基酸殘基；或者 ?X與B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者所述母體胰島素B鏈中存在的Lys殘基的ε-氨基相連接的共價(jià)鍵； X是:

14.依據(jù)前述權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述胰島素肽是LysB29(Ne-十六燒二酸基-Y-Glu) des (B30)人膜島素。
15.通過(guò)任一項(xiàng) 前述權(quán)利要求的過(guò)程或方法制備的純胰島素肽。
【文檔編號(hào)】C07K14/62GK103459417SQ201280007328
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月1日
【發(fā)明者】J.M.莫勒魯普, S.S.弗雷德里克森 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克有限公司