純化裂解的胰島素原的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物分子純化領(lǐng)域。更確切地講，本發(fā)明涉及使用特定種類的具有內(nèi)核和外部功能化層的殼珠的色譜純化胰島素。所述方法能夠以高流速和超過90%的高純度純化。
【專利說明】純化裂解的胰島素原的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物分子純化領(lǐng)域。更確切地講，本發(fā)明涉及使用特定種類的具有內(nèi)核和外部功能化層的殼珠的色譜純化胰島素。所述方法能夠以超過90%的非常高的純度純化。
[0002]發(fā)明背景
胰島素在細菌(E.colf)或酵母中生成。在細菌的情況下，胰島素(表達為胰島素原)在內(nèi)含體中生成，經(jīng)過變性、重折疊和復(fù)性之后通過幾個步驟進行純化。通常，幾個色譜步驟與過濾步驟、胰島素原酶促裂解成胰島素、沉淀結(jié)晶和配制步驟結(jié)合。在酵母表達體系的情況下，不形成內(nèi)含體，除此之外，該過程與細菌的情況十分類似。
[0003]胰島素以每年數(shù)噸的產(chǎn)量被制造，且胰島素的使用逐年增加。越來越多的人將患糖尿病，在發(fā)展中國家同樣重要。胰島素的需求增加使得必需利用有效的制造方法和工藝。產(chǎn)率日益重要且獲得較高產(chǎn)率的方法通常給出較好的工藝經(jīng)濟性，轉(zhuǎn)變成更實惠的產(chǎn)品。承受能力是制造可為更廣泛基數(shù)的患者所用的產(chǎn)品的關(guān)鍵參數(shù)。這對于不斷飽受成本增加壓力的衛(wèi)生保健部門施加不必要的約束同樣重要。
[0004]因此，將期望具有以高產(chǎn)率獲得純產(chǎn)物的用于制造胰島素的更快更經(jīng)濟的方法。
[0005]以前并沒有提出使用殼珠色譜純化胰島素。
[0006]發(fā)明概述
本發(fā)明提供胰島素純化方法，其中，與常規(guī)方法相比較，色譜介質(zhì)的荷載(每毫升色譜介質(zhì)荷載的產(chǎn)物克數(shù))可增加三倍，`降低了色譜介質(zhì)的消耗。這可直接轉(zhuǎn)變成更加成本有效的方法。另外，在本文所述的色譜步驟中使用殼珠的方法可以較高的速度操作，使得能夠在給定的時間生成更多產(chǎn)物，即通過縮短該特定色譜步驟的時間而使得該方法更加經(jīng)濟。
[0007]本發(fā)明提供使用殼珠用于生物分子純化的方法，所述殼珠的特征在于僅在所述珠的最外層中功能化，即功能配體僅存在于所述最外層內(nèi)，而不存在于所述珠的核中?？煽刂扑龉δ芑瘜拥暮穸龋宜鲋榈奈垂δ芑暮丝捎美缙暇厶翘畛浠蚩梢允强盏?。
[0008]具有功能化層的色譜珠具有的潛能是，具有與小得多的完全功能化的珠相當?shù)姆蛛x度，同時維持較大珠的較好的壓力流動性質(zhì)。所述殼珠的容量(capacity)本質(zhì)上將由功能化的珠的體積分數(shù)所反映，因此將低于同樣大小的完全功能化珠的容量。
[0009]因此，本發(fā)明涉及由胰島素原純化胰島素的方法，所述方法包括將裂解的胰島素原樣品裝載到包含多孔殼珠的色譜介質(zhì)上，所述殼珠具有內(nèi)核和提供有離子交換配體的外部功能化層；將胰島素吸附在所述配體上；和以100-1000cm/h、優(yōu)選300-600cm/h的流速從所述色譜介質(zhì)上洗脫胰島素，其中所述洗脫的胰島素具有大于85%、優(yōu)選大于90%的純度。
[0010]在所述方法中使用的殼珠的直徑為20-100Mm，優(yōu)選為40_80Mm。
[0011]所述殼珠的功能化層包括3-9 μ m厚的層,優(yōu)選為5-7μηι厚的層。
[0012]所述離子交換配體為強陽離子交換基團，諸如磺酸基(so3_)、硫酸基(-oso3_)、磷酸基(-OPO32O和膦酸基(PO32O。
[0013]在一個實施方案中，所述殼珠的核填充有合適的極性聚合物，以使得所得核更致密，從而給出較好的分離度(窄峰)。所述極性聚合物可為瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、支鏈淀粉或完全合成的聚合物，如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(丙烯酸羥基烷基酯)。
[0014]附圖簡述
圖1為在本發(fā)明的純化方法中使用的殼珠的示意圖。
[0015]圖2為顯示使用殼珠色譜法純化胰島素的圖。
[0016]圖3為床高和流速對在充填了兩種不同介質(zhì)的管柱上的背壓的影響。
[0017]圖4為使用商品介質(zhì)和在本發(fā)明中使用殼珠介質(zhì)純化胰島素的比較。
[0018]圖5顯示流速對商品介質(zhì)和在本發(fā)明中使用的殼珠介質(zhì)的影響。
[0019]圖6顯示商品介質(zhì)和殼珠介質(zhì)的胰島素純化的結(jié)果。
[0020]發(fā)明詳述
下文將更密切地結(jié)合一些非限制性實施例描述本發(fā)明。
[0021]材料和方法
在本文中提供基于S印harose HFA 55和兩種參比原型/樹脂的三種不同殼珠構(gòu)建體的結(jié)果(圖1，表1)。
[0022]在圖1中從左至 右:原型S6:S-配體在最外層中且核保持未功能化；原型S20:像原型S6—樣，但核用葡聚糖T150 (Mp 150,000)填充；原型S26:像原型S20—樣，但S-配體偶合在葡聚糖增量劑(Mp 10，000)上；原型S12:參比原型，其中整個珠被功能化；以及，Capto SP ImpRes0前四種原型具有77Mm的粒度，而Capto SP ImpRes具有40Mm的粒度。
[0023]表1.所試驗原型的性質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.由胰島素原純化胰島素的方法，所述方法包括以下步驟:將裂解的胰島素原樣品裝載到包含多孔殼珠的色譜介質(zhì)上，所述殼珠具有內(nèi)核和提供有離子交換配體的外部功能化層；將胰島素吸附在所述配體上；和以100-1000cm/h、優(yōu)選300-600cm/h的流速從所述色譜介質(zhì)上洗脫胰島素，其中所述洗脫的胰島素具有大于85%、優(yōu)選大于90%的純度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該殼珠的直徑為20-100Mm。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述殼珠的直徑為40-80Mm。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述殼珠的功能化層包括3-9Mm厚的層。
5.上述權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述殼珠的功能化層包括5-7Mm厚的層。
6.上述權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述配體為強陽離子交換基團，諸如磺酸根(SO3-)、硫酸根(-OSO3-)、磷酸根(-OPO32-)和膦酸根(PO32-)。
7.上述權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述核用諸如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、支鏈淀粉或完全合成的聚合物的合適極性聚合物填充，其中所述完全合成的聚合物如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(丙烯酸羥基烷基酯)。
8.上述權(quán)利要求中一項或多項的`方法，其中所述胰島素在細菌中生成。
【文檔編號】C07K14/62GK103827136SQ201280047751
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】E.布雷坎, K.埃里克斯森, B-L.約翰遜, 沙納加 J 申請人:通用電氣健康護理生物科學(xué)股份公司