具有阻斷新生血管形成功能的多肽化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有阻斷新生血管形成功能的多肽化合物。該多肽化合物為SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。該小分子多肽化合物可以通過阻斷新生血管的形成而抑制實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明基于該小分子多肽化合物能夠抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)，抑制裸鼠皮下接種基底膜基質(zhì)中血管的生成，抑制裸鼠皮下接種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)；并且與傳統(tǒng)的抗瘤藥物順鉑相比，該小分子多肽化合物對(duì)小鼠的體重?zé)o明顯影響，因此具有低副作用的優(yōu)勢(shì)，可作為治療腫瘤的潛在的高效低副作用的藥物。
【專利說明】具有阻斷新生血管形成功能的多肽化合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有阻斷新生血管形成和抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)功能的多肽化合物。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類死亡的主要病因。在中國(guó)，惡性腫瘤死亡率占總疾病死亡率的28.53%，僅次于心腦血管疾病。所以，尋求高效低副作用的新型預(yù)防和治療腫瘤的藥物有著重要的現(xiàn)實(shí)和社會(huì)意義。
[0003]傳統(tǒng)的治療腫瘤的方法包括物理治療與化學(xué)治療。物理治療主要指放射療法和手術(shù)摘除等。放射治療對(duì)身體其他正常組織損害較大，手術(shù)摘除亦存在物理損傷和提高癌細(xì)胞釋放和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。化學(xué)治療又稱化療，采用化學(xué)藥物直接破壞或殺傷癌細(xì)胞，如順鉬，抗生素類(絲裂霉素、平陽霉素、博來霉素等)，植物類(長(zhǎng)春新堿、托泊替康等)，激素類(地塞米松、法樂通等)等藥物。順鉬通過阻斷DNA復(fù)制來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的?？股仡愐职┧幬镏饕饔糜谶z傳信息傳遞的不同環(huán)節(jié)，通過干擾DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。植物類藥物多作用于細(xì)胞分裂的M期，阻止有絲分裂，使癌細(xì)胞致死。激素類抗癌藥，一般通過改變體內(nèi)激素水平，對(duì)激素依賴性的腫瘤進(jìn)行抑制?；煹娜秉c(diǎn)是選擇性差，毒性大，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常體細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用，所以傳統(tǒng)的抑瘤藥物都會(huì)對(duì)癌癥患者帶來諸多副作用，例如食欲下降，嘔吐，頭暈，脫發(fā)等等。實(shí)體瘤在患者體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移主要依賴新生血管的形成。當(dāng)實(shí)體瘤體積超過數(shù)個(gè)_3時(shí)，如果沒有足夠的新生血管為其提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，排除代謝產(chǎn)物，腫瘤將無法繼續(xù)生長(zhǎng)并會(huì)進(jìn)而壞死。因此，抑制腫瘤內(nèi)的血管生成為治療腫瘤的一個(gè)重要方向。新生血管的形成是指從已有的血管增殖形成新的血管，是促血管形成因子(VEGF、TOGF等)和抑制血管形成因子協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。首先，血管內(nèi)皮細(xì)胞上的促血管形成因子受體被激活；其次，活化的內(nèi)皮細(xì)胞開始釋放蛋白酶來降解基底膜；然后，內(nèi)皮細(xì)胞遷移并繁衍形成周圍基質(zhì)及萌芽狀機(jī)構(gòu)；進(jìn)而芽狀機(jī)構(gòu)擴(kuò)大形成環(huán)形，最后形成完整的血管腔。新生血管的形成在生長(zhǎng)，發(fā)育和不同的病理和生理過程中扮演重要的角色，例如在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育，傷口愈合、女性經(jīng)期恢復(fù)等。而在腫瘤惡化病變中，新生血管的形成是實(shí)體瘤增值的必要條件。所以，抑制新生血管的形成成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。近年來，以促血管形成因子為靶位點(diǎn)開發(fā)了多種抑制劑藥物。其中以拮抗VEGF及其受體為主。但因?yàn)樾律艿男纬墒芏喾N分子的調(diào)控，所以單一位點(diǎn)的抑制藥物常常達(dá)不到理想的結(jié)果。所以采用多位點(diǎn)，多途徑的方案來抑制新生血管形成成為一個(gè)新的研究突破點(diǎn)。
[0004]整合素(integrin)家族是一類介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間以及細(xì)胞和基質(zhì)之間相互識(shí)別的跨膜粘連蛋白分子。每個(gè)整合素成員是由α和β兩亞基組成的異二聚體。目前，在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)18種α亞基和8種β亞基，它們相互組合可形成24種不同的整合素分子。幾乎所有不同組織的細(xì)胞上都有一種或幾種整合素分子表達(dá)。整合素的活性由穿膜雙向信號(hào)通路調(diào)控。整合素激活后可以識(shí)別并結(jié)合胞外配基，介導(dǎo)細(xì)胞的粘附和遷移；而配基的結(jié)合可以誘導(dǎo)胞內(nèi)多種調(diào)控信號(hào)，從而進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)，分化和凋亡等。整合素ανβ 3受體在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤組織中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高表達(dá)，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常器官中微量或不表達(dá)。該蛋白分子作為內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的橋梁，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、增殖等功能，在腫瘤血管生成的過程中發(fā)揮著重要的作用。
[0005]基于整合素在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，以整合素為靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤藥物的研發(fā)及相應(yīng)治療方法的開發(fā)已成為近幾年來腫瘤治療的熱點(diǎn)。當(dāng)前的整合素靶向抗腫瘤藥物主要分為以下幾類:整合素抗體類藥物、含有與整合素高親和力結(jié)合序列的抗腫瘤藥物、以整合素為靶點(diǎn)的其他類藥物等，其中一部分藥物已順利進(jìn)入臨床研究階段。盡管到目前為止，還未見此類藥物上市的報(bào)道，但良好的療效使其顯示出巨大的應(yīng)用前進(jìn)和市場(chǎng)潛力。
[0006]目前針對(duì)整合素ανβ3受體而開發(fā)的抗體類藥物主要包括:(I)Vitaxin(MED1-523或LM609)，是由Medlmmune公司研究開發(fā)的整合素α νβ 3的人源化單克隆抗體，在臨床研究中顯現(xiàn)抗腫瘤血管生成的活性；(2)Abegrin (MED1-522或Etaracizumab),是對(duì)Vitaxin的改進(jìn)；(3)CNT095是一種完全人源的整合素α V亞基單克隆抗體，起作用靶位點(diǎn)是整合素ανβ3和ανβ 5，在臨床前異種移植瘤模型中表現(xiàn)出抗腫瘤與抗血管生成的雙重活性；(4) IMGN388是一種新穎的抗體-藥物復(fù)合物，由整合素α V亞基的完全人源化抗體與具有殺傷癌細(xì)胞作用的DM4共價(jià)連接而成，其作用靶位點(diǎn)分布廣泛。臨床前研究表明，具有抗血管生成和細(xì)胞毒雙重效應(yīng)，目前正處于晚期實(shí)體瘤I期臨床試驗(yàn)階段。
[0007]含有與整合素高親和力結(jié)合序列的抗腫瘤藥物:整合素能與多種保守氨基酸序列高親和力結(jié)合，其中，RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)最為典型。含有RGD序列的化合物或多肽能與ανβ3、ανβ5、α5β1等識(shí)別RGD序列的整合素特異性結(jié)合并抑制其生物學(xué)功能，目前以RGD序列為基礎(chǔ)開發(fā)的小肽類整合素拮抗分子主要有:(1) Cilengitide(EMD121974)，是一種具有環(huán)狀多肽(RGDfV)結(jié)構(gòu)的小分子化合物，其作用靶位點(diǎn)為整合素ανβ3和ανβ5，目前正進(jìn)行肺癌和前列腺癌的臨床II期試驗(yàn)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的III期試驗(yàn)；(2) S247是整合素ανβ3的阻斷劑，目前處于臨床前研究；(3)ΗΜ-3和EDSM-Y的作用靶位點(diǎn)為整合素ανβ3。這些多肽在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出抗血管生成與抗腫瘤活性。另外，也有一些不含RGD序列的多肽類整合素抑制劑，如ΑΤΝ-161 (針對(duì)α5β1)等。
[0008]除此之外，一些非肽類整合素拮抗劑也顯示具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，如PSK1404
坐寸ο
[0009]與傳統(tǒng)腫瘤治療方法相比，整合素靶向抗腫瘤藥物表現(xiàn)出明顯的高特異性和低毒副作用等特點(diǎn)。但同時(shí)整合素錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控和多重的功能機(jī)制在一定程度上也給整合素靶向治療帶來了挑戰(zhàn)。
[0010]以上針對(duì)整合素的抗體或小分子拮抗劑都是針對(duì)整合素胞外區(qū)域而設(shè)計(jì)的，整合素ανβ 3受體位于細(xì)胞表面，直接與血液接觸，這些藥物易達(dá)到靶位點(diǎn)。但整合素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路是雙向的(由內(nèi)至外和由外至內(nèi))，雙向信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過整合素胞內(nèi)序列介導(dǎo)的。比如整合素β3亞基胞內(nèi)段部分，它自身含有與多種胞內(nèi)信號(hào)分子結(jié)合的位點(diǎn)，如kindlin, β 3-endonexin, Src, talin等,而這些信號(hào)分子在新生血管形成中可能起到重要的調(diào)控作用。所以，針對(duì)β 3型整合素胞內(nèi)端肽段與胞內(nèi)不同信號(hào)分子結(jié)合的特點(diǎn)來開發(fā)新型抗新生血管形成和抗腫瘤生長(zhǎng)的特效藥物有著很強(qiáng)的可行性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供了一種阻斷新生血管形成功能的多肽化合物。
[0012]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種具有阻斷新生血管形成的多肽化合物，其特征在于該多肽化合物為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0013]上述的具有阻斷新生血管形成的多肽化合物在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。
[0014]上述的具有阻斷新生血管形成的多肽化合物在制備抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明基于該小分子多肽化合物能夠抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)，抑制裸鼠皮下接種基底膜基質(zhì)中血管的生成，抑制裸鼠皮下接種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)；并且與傳統(tǒng)的抗瘤藥物順鉬相比，該小分子多肽化合物對(duì)小鼠的體重?zé)o明顯影響，因此具有低副作用的優(yōu)勢(shì)，可作為治療腫瘤的潛在的高效低副作用的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明的小分子多肽化合物Mibtide3.1的氨基酸序列和組成。穿膜多肽為具有11個(gè)氨基酸的序列(稱為Tat序列)，可以介導(dǎo)與之偶聯(lián)的多肽或分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；目的多肽為含有12個(gè)氨基酸的多肽序列，其自身不具有穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的功能；Mibtide3.1多肽序列是Tat序列與目標(biāo)多肽的復(fù)合體，可穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功倉泛。
[0017]圖2為本發(fā)明的小分子多肽化合物Mibtide3.1抑制臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外形成血管樣小管效果對(duì)比圖。
[0018]圖3為本發(fā)明的小分子多肽化合物Mibtide 3.1抑制皮下種植基底膜基質(zhì)(Matrigel)團(tuán)塊中血管的形成。
[0019]圖4為本發(fā)明的小分子多肽化合物抑制裸鼠皮下實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。
[0020]圖5為本發(fā)明的小分子多肽化合物Mibtide3.1抑制實(shí)體瘤內(nèi)血管的形成。

【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例一:合成并純化Mibtide 3.1多肽分子
該多肽合成于公司，采用手動(dòng)固相Fmoc法，以Fmoc-Gly-Wang樹脂為起始原料,從C端向N端方向合成。純化采用HPllOO型(美國(guó)安捷倫公司)反相高效液相色譜儀，其純度可達(dá)99.62%。
[0022]實(shí)施例二:臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)管道形成的實(shí)驗(yàn):
體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在含生長(zhǎng)因子的基底膜基質(zhì)上能自行組裝成類似血管的管道結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Mibtide 3.1 (終濃度20 μ M)，觀察其抑制HUVEC組裝管道的能力。參見圖1和圖2，結(jié)果顯示，與無藥處理組相比較，添加Mibtide 3.1的能夠有效的抑制管道的形成；而加入相同濃度的未加修飾的目標(biāo)多肽或單獨(dú)的穿膜多肽分子不具有抑制作用，說明Mibtide3.1多肽(20μΜ)對(duì)HUVEC體外形成血管樣管道結(jié)構(gòu)起到顯著的抑制作用(# P < 0.01)。
[0023]實(shí)施例二:小鼠體內(nèi)基底I旲基質(zhì)中血管形成實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)材料為裸鼠(BALB/C)，6周齡，雄性，皮下注射500 μ I基底膜基質(zhì)(Matrigel，含250ng/ml bFGF 和 60U/ml heparin), Mibtide 3.1 處理組添加 Mibtide 3.1 (50 MM),歷時(shí)7-10天。取出填充物,測(cè)定血紅蛋白含量,發(fā)現(xiàn)相同重量的基質(zhì)中,Mibtide 3.1處理組相對(duì)與無藥對(duì)照組所含血紅蛋白含量明顯降低。同時(shí)進(jìn)行組織化學(xué)分析(HE染色)，發(fā)現(xiàn)Mibtide 3.1處理組新生血管量比無藥對(duì)照組顯著減少。參見圖3, (A) Matrigel放在冰上融化為液態(tài)后分別添加生長(zhǎng)因子bFGF (250 ng/ml),肝素(60U/ml)和所列不同多肽化合物(50 μΜ)，并在液體狀態(tài)下注射到實(shí)驗(yàn)小鼠(BALB/c裸鼠)背部皮下。Matrigel進(jìn)入小鼠體內(nèi)迅速固態(tài)化并誘導(dǎo)新生血管的生長(zhǎng)，十天后固態(tài)Matrigel塊小心從小鼠皮下剝離取出并經(jīng)固定和H&E染色后，然后顯微鏡下觀察。紅色團(tuán)塊為血管內(nèi)紅細(xì)胞染色，淺粉色背景為Matrigel染色。圖示標(biāo)尺為lOOMm。(B)不同組別Matrigel中形成的血管(直徑>100 Mffl)在顯微鏡下計(jì)數(shù)。無藥物處理組和單純穿膜多肽處理組每個(gè)視野一般含有4 一 6個(gè)血管，兩者沒有明顯差別，而Mibtide3.1多肽處理組每個(gè)視野一般只形成I 一 2個(gè)血管，相對(duì)于前兩組有顯著的區(qū)別(** P < 0.01)。(C)從小鼠皮下剝離出的固態(tài)Matrigel團(tuán)塊先用PBS清洗并稱重。取相同質(zhì)量的Matrigel團(tuán)塊，加入適量組織蛋白萃取液(RIPA)，勻漿后離心取上清，然后用利用ELISA Kit測(cè)定血紅蛋白的含量。結(jié)果顯示Mibtide3.1處理組Matrigel團(tuán)塊中血紅蛋白含量明顯低于對(duì)照組(** p < 0.01),說明Mibtide3.1處理可以有效抑制Matrigel中血管的形成。以上結(jié)果證明Mibtide 3.1對(duì)新生血管的形成具有明顯的抑制作用。
[0024]實(shí)施例四:比較Mibtide 3.1與臨床抗癌藥物順鉬對(duì)小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用:
實(shí)驗(yàn)材料為裸鼠(BALB/C)，6周齡，雄性，皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 (2xl07 /只)，并添加1%基底膜基質(zhì)。在5天左右成瘤后，隨機(jī)分3組，第一組連續(xù)7天皮下注射Mibtide3.1 (20μΜ；100μ I);第二組皮下注射等量PBS緩沖液作為對(duì)照；第三組腹腔注射順鉬(給藥量2.5mg/kg);記錄小鼠腫瘤大小與體重變化。
[0025]參見圖4，(A) BALB/c裸鼠背部皮下注射結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞。第三天開始每天給藥，歷時(shí)7天。Mibtide3.1組局部給藥(藥物濃度為20μΜ，局部注射ΙΟΟμΙ);順鉬組腹腔注射順鉬溶液(2.5mg/kg);對(duì)照組腫瘤周圍皮下注射100 μ I PBS。第五天起每天記錄腫瘤體積(V)大小(V=LXWX 0.52 ;其中L為腫瘤測(cè)量長(zhǎng)度，W為腫瘤測(cè)量寬度)，每組小鼠n=7。相對(duì)于對(duì)照組，Mibtide3.1對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，其效果與順鉬相當(dāng)。(B)皮下注射腫瘤后每天記錄荷瘤小鼠的體重。對(duì)照組、Mibtide3.1處理組與順鉬處理組的裸鼠初始體重?zé)o明顯差異。連續(xù)給藥后，對(duì)照組與Mibtide3.1處理組小鼠體重?zé)o明顯變化；而順鉬處理組小鼠體重明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，順鉬和Mibtide 3.1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)都有明顯的的抑制作用。在體重變化方面，順鉬造成小鼠體重明顯下降，而Mibtide
3.1處理組小鼠體重?zé)o明顯變化。在實(shí)驗(yàn)過程中亦可發(fā)現(xiàn)順鉬組小鼠的進(jìn)食與進(jìn)水量相對(duì)于其他兩組減半，說明Mibtide 3.1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起明顯的抑制作用，而同時(shí)造成的副作用明顯小于順鉬。
[0026]實(shí)施例五:比較Mibtide 3.1與臨床抗癌藥物順鉬對(duì)小鼠實(shí)體瘤內(nèi)血管形成的作用:
經(jīng)以上處理的小鼠皮下種植生長(zhǎng)的HT-29腫瘤于接種兩周后取出，經(jīng)PBS清洗，4%中性甲醛固定，然后制做蠟切片并進(jìn)行CD31免疫組化檢測(cè)。參見圖5，(A)結(jié)果顯示，無藥物處理對(duì)照組與順鉬處理組腫瘤內(nèi)有明顯的血管的生成；雖然Mibtide3.1處理組的腫瘤內(nèi)有CD31陽性細(xì)胞，但大多不能形成血管樣結(jié)構(gòu)。紅色箭頭所指為血管，圖示標(biāo)尺為100 μ m。(B)相對(duì)于無藥物處理對(duì)照組，Mibtide3.1處理對(duì)腫瘤內(nèi)血管的形成具有明顯的抑制作用；而順鉬處理組腫瘤內(nèi)血管的數(shù)目與對(duì)照組類似。(** P < 0.01)。(C)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)腫瘤組織中⑶31陽性染色分值(組織內(nèi)相對(duì)陽性面積)可發(fā)現(xiàn)順鉬處理組和Mibtide3.1處理組腫瘤內(nèi)CD31陽性染色分值顯著低于無藥物處理組，這可能是由于無藥物處理的腫瘤內(nèi)含有更多小血管或血管內(nèi)皮細(xì)胞的緣故^MMibtide3.1處理組相對(duì)于順鉬處理組顯示更弱的⑶31陽性染色，說明Mibtide3.1處理可以更顯著的降低腫瘤組織中血管的含量(** P <
0.01)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Mibtide 3.1對(duì)腫瘤內(nèi)新生血管的形成有著特異的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種具有阻斷新生血管形成的多肽化合物，其特征在于該多肽化合物為SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有阻斷新生血管形成的多肽化合物或任何其他含有SEQID N0.1中所包含的核心氨基酸序列(ATSTFTNITYRG)的化合物在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有阻斷新生血管形成的多肽化合物或任何其他含有SEQID N0.1中包含的核心氨基酸序列(ATSTFTNITYRG)的化合物在制備抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104231087SQ201410473491
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】馬衍青, 許禎, 苗春曉, 張瑩瑩, 楊超, 高娟, 鄧文鋒 申請(qǐng)人:上海大學(xué)