專利名稱：用于輔助和新輔助療法以及早期腫瘤的治療的vegf特異性拮抗劑的制作方法
用于輔助和新輔助療法以及早期腫瘤的治療的VEGF特異性拮抗劑
背景技術(shù)：
癌是對(duì)人類健康最致命的威脅之一。僅在美國(guó)，癌每年侵襲近130萬名新患者并且是次于心血管疾病的死亡的第二大主要原因，占死亡的約4分之1。實(shí)體瘤是造成大多數(shù)這類死亡的原因。盡管在某些癌的醫(yī)學(xué)治療上有了顯著的進(jìn)步，但在過去的20年中，所有癌的總的5年存活率僅提高了約10%。癌或者惡性肺瘤以不受控制的方式轉(zhuǎn)移并迅速生長(zhǎng)，使得及時(shí)的檢測(cè)和治療變得非常困難。
癌治療的現(xiàn)行方法是相對(duì)非選擇性的并通常在癌已經(jīng)發(fā)展至更加惡性的階段后靶向肺瘤。手術(shù)移除患病組織；放射療法收縮實(shí)體瘤；以及化學(xué)療法迅速殺死分裂細(xì)胞。尤其是化學(xué)療法引起了大量副作用，在某些實(shí)例中如此嚴(yán)重以致限制了可提供的劑量并因此阻礙了可能有效的藥物的使用。而且，癌常常對(duì)化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥性。為了阻止向惡性或轉(zhuǎn)移性狀態(tài)的發(fā)展，借此減少與癌相關(guān)的發(fā)病率和死亡率，早期或良性腫瘤的治療是所需要的。
對(duì)于大多數(shù)新近被診斷為患有可手術(shù)的癌的患者來說，標(biāo)準(zhǔn)的治療是確定性手術(shù)以及之后的化學(xué)療法。這種治療目的在于盡可能多的除去原發(fā)的和轉(zhuǎn)移的疾病以便預(yù)防復(fù)發(fā)并提高存活率。事實(shí)上，這些患者中的大多數(shù)在手術(shù)后都不具有殘留腫瘤的可見跡象。然而，他們中許多人后來會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)并最后死于他們的疾病。這是因?yàn)樯倭看婊畹哪[瘤細(xì)胞
后變得無法檢測(cè)而發(fā)生的。
因此，為了在這些殘留的微轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞開始重新群體化并變得難
重要。在過去的幾十年中，輔助療法上的發(fā)展通常是集中于不同化學(xué)治療劑的使用而增加的。許多化學(xué)療法方案已經(jīng)在輔助地治療患有早期主要癌適應(yīng)癥例如肺，乳^^和結(jié)腸直腸癌的患者中顯示出臨床益處。
Strauss等人./ C/z.w (9腳/ 22:7019 (2004); International Adjuvant LungCancer Trial Collaboration Group (國(guó)際輔助肺癌試驗(yàn)協(xié)作組)7V五"g/ /M^/350:351-60 (2004)。 Moertel等人.^打"/"ter" 122:321-6 (1995);IMPACT345:939-44 (1995); Citron等人，《/C7/" O"co/21 :1431-9(2003)。
盡管化學(xué)基礎(chǔ)的輔助療法有公認(rèn)的益處，但與任何類型的化學(xué)療法都相關(guān)的一種主要缺陷是顯著的毒性。通?；瘜W(xué)治療藥物并不靶向肺瘤部位，并且不能分辨正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。由于漫長(zhǎng)的治療和其對(duì)患者生活質(zhì)量持久的影響，在輔助情況(setting)中的毒性問題是特別具有挑戰(zhàn)性的。而且，在具有較低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者中輔助化學(xué)療法的益處還不清楚，使得對(duì)于他們來說是否值得忍受化學(xué)療法的副作用變得有疑問。
一種在主要的確定性手術(shù)之前^是供的輔助療法即新輔助療法已經(jīng)作為癌療法的另 一個(gè)重要部分出現(xiàn)。在確定性手術(shù)之前提供新輔助治療有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一，由于肺瘤體積、腹水和胸腔積液的減少，它可以幫助改善患者在手術(shù)前的體力狀態(tài)。第二，肺瘤體積的減小可使得手術(shù)范圍變小因此保護(hù)患者的器官和其功能。這對(duì)于例如乳腺癌患者來說是特別有價(jià)值的。肺瘤體積的減小還可使本來不能手術(shù)的腫瘤能夠手術(shù)。最后，新輔助療法可提高通過手術(shù)完全除去腫瘤的機(jī)率，由此提高存活率。在過去的十年間，已有許多對(duì)使用不同化學(xué)治療劑和或放射以治療患有例如乳腺癌、頭頸癌、直腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌、食道和胃癌以及前列腺癌的癌患者的新輔助療法的臨床試驗(yàn)。綜述參見Tanvetya廳等人，So^/z細(xì)Mo/.丄98:338-344 (2005)。
如上文所講，與任何類型的化學(xué)療法都有關(guān)的一種主要的缺陷是顯著的毒性。許多新輔助化學(xué)療法方案是麻煩的，需要在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)頻繁的治療。而且，在具有較低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者中新輔助化學(xué)療法的益處，尤其是存活率益處還不清楚，使得對(duì)于他們來說是否值得等待而不是立即手術(shù)變得有疑問。
血管生成是重要的細(xì)胞事件，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、修剪(prune )并重組以從現(xiàn)存的血管網(wǎng)絡(luò)形成新的血管。令人矚目的證據(jù)是對(duì)于正常
的和病理學(xué)的增殖過程來說血管聯(lián)結(jié)(vascular supply)的發(fā)育是必須的。氧和養(yǎng)分的傳遞以及分解代謝產(chǎn)物的去除代表了多細(xì)胞生物體中發(fā)生的大部分生長(zhǎng)過程中的限速步驟。
盡管新血管的引入被認(rèn)為是腫瘤血管生成的主要方式，但近來的數(shù)據(jù)已表明有些肺瘤可通過借用(co-opting)現(xiàn)有的宿主血管生長(zhǎng)。之后被借用的血管系統(tǒng)退化，導(dǎo)致肺瘤退化，其最終被在腫瘤邊緣的缺氧誘導(dǎo)的血管生成所逆轉(zhuǎn)。
正常和非正常的血管生成的關(guān)鍵的正向調(diào)節(jié)物之一是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)陽A。 VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和P1GF的基因家族的一部分。VEGF-A主要與兩個(gè)高親和力的受體酪氨酸激酶VEGFR-l(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)結(jié)合，后者是VEGF-A的血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂信號(hào)的主要遞質(zhì)。此外，神經(jīng)氈蛋白-1已一皮確i人為肝素結(jié)合的VEGF-A同種型的受體并可在血管發(fā)育中起作用。
除了是血管生成因子外，VEGF作為多效的生長(zhǎng)因子在其他生理過程例如內(nèi)皮細(xì)胞存活和增殖、血管通透性和血管舒張、單核細(xì)胞趨化性和4丐內(nèi)流中表現(xiàn)出多種生物效應(yīng)。而且其他研究已經(jīng)報(bào)道了 VEGF對(duì)少數(shù)非內(nèi)皮細(xì)胞類型例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、胰管細(xì)胞和施萬氏細(xì)胞(Schwann cell)的促有絲分裂作用。
對(duì)于VEGF作為病理狀態(tài)中血管生成的主要調(diào)節(jié)物的認(rèn)可已引起了對(duì)在涉及病理血管生成的狀態(tài)中阻斷VEGF活性的許多嘗試。
在大多數(shù)惡性腫瘤中VEGF表達(dá)被上調(diào)并且VEGF的過表達(dá)與許多實(shí)體瘤中更晚期的階段或與更差的預(yù)后相關(guān)。因此，抑制VEGF信號(hào)通路的分子已被用于治療其中病理血管生成顯著的相對(duì)晚期的實(shí)體瘤。
盡管有證據(jù)暗示VEGF在涉及病理血管生成的疾患或者疾病(包括晚期和轉(zhuǎn)移性或擴(kuò)散性腫瘤)的發(fā)展中的作用，但是關(guān)于VEGF在早期或良性癌、休眠之后腫瘤的復(fù)發(fā)中或者在來自休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉(zhuǎn)移(micrometastase)的繼發(fā)部位的腫瘤的發(fā)展中的作用了解得少。如依據(jù)下列公開內(nèi)容的綜述明顯的，本發(fā)明解決了這些和其他需求。發(fā)明概述
與化學(xué)療法相結(jié)合的VEGF特異性拮抗劑的使用已表現(xiàn)出對(duì)患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌和非小細(xì)胞肺癌以及其他癌的患者是有益的，但關(guān)于VEGF特異性拮抗劑療法對(duì)良性或早期腫瘤；休眠、手術(shù)或其他干預(yù)后腫瘤的復(fù)發(fā)；來自休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉(zhuǎn)移的繼發(fā)性部位腫瘤的發(fā)展；或在輔助或新輔助情況中的影響知之甚少。本文中我們提供了證明VEGF特異性拮抗劑可被用于早期腫瘤包括良性的、癌前的、非轉(zhuǎn)移性的和可手術(shù)的腫瘤的治療的結(jié)果。所述結(jié)果進(jìn)一步證明了 VEGF特異性拮抗劑可被用于癌(例如良性或惡性癌)的新輔助療法或用于預(yù)防和/或減小癌復(fù)發(fā)(例如良性或惡性癌)的可能性，包括輔助療法的方法。本發(fā)明構(gòu)成了為患有癌包括良性的、早期和可手術(shù)的癌的患者提供(手術(shù)前和手術(shù)后)更有效的、毒性更小的護(hù)理的重大醫(yī)療突破。
因此，本發(fā)明以治療受治療者中良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌的方法為特征，所述方法包括對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑的施用預(yù)防了良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌變成擴(kuò)散性或轉(zhuǎn)移性癌。例如，良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌可是O期、I期或II期癌，而在某些實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑的施用預(yù)防了良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌發(fā)展為下一期例如I期、II期、III期或IV期癌。在某些實(shí)施方案中，將VEGF特異性拮抗劑以足夠治療受治療者中良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤或預(yù)防良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的肺瘤變成擴(kuò)散性或轉(zhuǎn)移性癌的量和時(shí)間施用。在某些實(shí)施方案中，施用VEGF特異性拮抗劑減小了良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的肺瘤的腫瘤大小、腫瘤負(fù)荷或腫瘤數(shù)目。還可以將VEGF特異性拮抗劑以降低良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤中的血管密度的量和時(shí)間施用。
如本文所述的，本發(fā)明的方法可被用于治療例如0期(諸如原位癌)、I期或II期癌。新輔助和輔助療法的方法可被用于治療任何類型的癌例如良性的或惡性的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述癌是上皮細(xì)胞實(shí)體瘤，包括但不限于胃腸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、
10肺癌(例如非小細(xì)胞肺癌)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、肝癌
和軟組織癌(例如，B細(xì)胞淋巴瘤諸如NHL和多發(fā)性骨髓瘤以及白血
病諸如慢性淋巴細(xì)胞性白血病)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述良性的、 癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤是息肉、腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、 胰島素瘤、軟骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腦脊膜瘤、平滑肌瘤、 橫紋肌瘤、鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、膽管嚢腺瘤
(cystanoma)、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽瘤、 錯(cuò)構(gòu)瘤、移行細(xì)胞乳頭狀瘤、唾液腺的多形性腺瘤、硬纖維瘤、皮樣嚢 乳頭狀瘤(dermoid cystpapilloma )、嚢腺瘤、局灶性結(jié)節(jié)狀增生或結(jié)節(jié) 狀再生性增生。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法被理想地用于治療腺瘤。 腺瘤的非限制性實(shí)例包括肝細(xì)胞腺瘤、腎腺瘤、后腎腺瘤、支氣管腺瘤、 肺泡腺瘤、腎上腺腺瘤、垂體腺瘤、曱狀旁腺腺瘤、胰腺腺瘤、唾液腺 腺瘤、肝細(xì)胞腺瘤、胃腸腺瘤、管狀腺瘤和膽管腺瘤。
本發(fā)明還以包括對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑以 在受治療者中預(yù)防良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)的方法 為特征。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，受治療者處于患癌、息肉或癌綜 合征的危險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，受治療者具有癌、息肉或遺傳性癌綜合征
(例如1型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MENl))的家族史。在本發(fā)明的某些方 面中，受治療者處于發(fā)展良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的胃腸腫瘤、硬纖 維瘤或腺瘤(例如胃腸腺瘤、垂體腺瘤或胰腺腺瘤)的危險(xiǎn)。在某些實(shí) 施方案中，所述方法在從未患過腫瘤的受治療者、從未患過臨床可檢測(cè) 的癌的受治療者、只患過良性腫瘤的受治療者中預(yù)防所述良性的、癌前 的或非轉(zhuǎn)移性的癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明以治療受治療者中0期、I期或II期胃腸腫 瘤的方法為特征，該方法包括對(duì)受治療者以足夠治療受治療者中0期、 I期或II期胃腸肺瘤的量和時(shí)間施用VEGF特異性拮抗劑。胃腸腫瘤可 是胃腸系統(tǒng)的任何0期、I期或II期的癌，包括肛門癌、結(jié)腸直腸癌、 直腸癌、食管癌、膽嚢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和小腸癌。在一個(gè)實(shí)施 方案中，胃腸腫瘤是0期(例如高級(jí)別腺瘤)或I期腫瘤。在一個(gè)實(shí)施 方案中，受治療者之前沒有經(jīng)歷過治療胃腸腫瘤的切除術(shù)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明以治療處于發(fā)展胃腸腫瘤危險(xiǎn)的受治療者的 方法為特征，該方法包括以足夠預(yù)防受治療者中胃腸腫瘤的發(fā)生或復(fù)發(fā) 的量和時(shí)間對(duì)受治療者施用VEGF特異性拮抗劑。所述胃腸腫瘤可是任
何胃腸肺瘤，包括但不限于腺瘤、 一種或多種息肉或者0、 I或II期癌。 在上述方法的某些實(shí)施方案中，受治療者是超過50歲的人類，患
有遺傳性癌綜合征或有結(jié)腸癌或息肉的家族史。遺傳性胃腸癌綜合征的
非限制性實(shí)例包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、加德納綜合征、胰腺 癌和遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)。在某些實(shí)施方案中，受 治療者之前可已經(jīng)歷或沒有經(jīng)歷過結(jié)腸鏡檢查。在一個(gè)實(shí)施方案中，將 VEGF特異性拮抗劑以減少患有FAP的受治療者中腺瘤性結(jié)腸直腸息 肉的數(shù)目的量和時(shí)間施用。
在另 一個(gè)方面，本發(fā)明以預(yù)防或降低受治療者中癌復(fù)發(fā)的可能性的 方法為特征，該方法包括以足夠預(yù)防或降低受治療者中癌復(fù)發(fā)的可能性 的量和時(shí)間對(duì)受治療者施用VEGF特異性拮抗劑。本發(fā)明包括預(yù)防患有 腫瘤的受治療者中癌復(fù)發(fā)的方法，該方法包括去除腫瘤(例如使用確定 性手術(shù))和之后對(duì)受治療者施用VEGF特異性拮抗劑的步驟。本發(fā)明包 括預(yù)防受治療者中腫瘤再生長(zhǎng)的方法，該方法包括去除腫瘤(例如使用 確定性手術(shù))和之后對(duì)受治療者施用VEGF特異性拮抗劑的步驟。在相 關(guān)方面，本發(fā)明包括預(yù)防受治療者中癌復(fù)發(fā)或降低受治療者中癌復(fù)發(fā)的 可能性的方法，該方法任選地包括在手術(shù)之前對(duì)受治療者施用有效量的 VEGF特異性拮抗劑，進(jìn)行確定性手術(shù)，和在手術(shù)后施用有效量的VEGF 特異性拮抗劑，其中手術(shù)后VEGF特異性拮抗劑的施用預(yù)防癌復(fù)發(fā)或降 低癌復(fù)發(fā)的可能性。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明包括預(yù)防受治療者中癌 復(fù)發(fā)或降低受治療者中癌復(fù)發(fā)的可能性的方法，該方法包括在不存在任 何其它的抗癌治療劑的情況下對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性 拮抗劑，其中所述施用預(yù)防受治療者中癌復(fù)發(fā)或降低受治療者中癌復(fù)發(fā) 的可能性。
對(duì)于上文的每一個(gè)方面來說，腫瘤可是任何類型的腫瘤，包括但不 限于本文描述的實(shí)體瘤，以及特別是腫瘤和腺瘤。受治療者可具有休眠 腫瘤或微轉(zhuǎn)移，其可是或可不是臨床上可檢測(cè)的。在這一方面的一個(gè)實(shí)
12施方案中，將VEGF特異性拮抗劑以足夠減少休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的新血 管形成的量和時(shí)間施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將VEGF特異性拮抗劑 以足夠預(yù)防臨床可檢測(cè)的腫瘤發(fā)生或其轉(zhuǎn)移或者增加受治療者生存持 續(xù)時(shí)間的量和時(shí)間施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑是單一療法。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，受治療者之前已經(jīng)治療過腫瘤，例如使用抗癌療法。在一個(gè) 實(shí)例中，抗癌療法是手術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用VEGF特異性 拮抗劑之前、之時(shí)(例如同時(shí)地)或之后用其它的抗癌療法進(jìn)一步治療 受治療者?？拱┋煼ǖ膶?shí)例包括但不限于手術(shù)、放射療法(放射線療法)、 生物療法、免疫療法、化學(xué)療法或這些療法的組合。
在受治療者已經(jīng)經(jīng)歷過確定性手術(shù)的實(shí)施方案中，通常在受治療者 已經(jīng)從手術(shù)復(fù)原一段時(shí)間后施用VEGF特異性拮抗劑。這段時(shí)間可包括 傷口愈合或手術(shù)切口愈合所需要的時(shí)間段、降低傷口裂開風(fēng)險(xiǎn)所需要的
時(shí)間段或受治療者恢復(fù)至與手術(shù)前的健康水平本質(zhì)上相似或更好的健 康水平所需要的時(shí)間段。確定性手術(shù)完成和V E GF特異性拮抗劑的首次 施用之間的時(shí)間段還可包括藥物假期所需要的時(shí)間段，其中受治療者需 要或要求在治療方案之間的一段時(shí)間。通常，確定性手術(shù)完成和VEGF 特異性拮抗劑療法開始之間的時(shí)間段可包括少于一周、1周、2周、3 周、4周(28天)、5周、6周、7周、8周、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6 個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、IO個(gè)月、ll個(gè)月、l年、2年、3年或 更久。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定性手術(shù)和施用VEGF特異性拮抗劑之間 的時(shí)間段大于2周并小于1年。
上述的每一個(gè)方面可進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)受治療者癌的復(fù)發(fā)。 本發(fā)明還提供了在受治療者例如人類患者中手術(shù)去除可手術(shù)的癌 之前的新輔助療法的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的VEGF特異 性拮抗劑例如貝伐單抗，其中患者已經(jīng)被診斷為患有腫瘤或癌。VEGF 特異性拮抗劑可單獨(dú)或與至少 一種化學(xué)治療劑結(jié)合施用。
本發(fā)明還包括治療患有可手術(shù)的癌的受治療者的方法，該方法包括 在手術(shù)前對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑并且之后進(jìn)行 手術(shù)，借以切除癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在手術(shù)后對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防癌復(fù)發(fā)的步驟。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及新輔助療法的方法，該方法包4舌在確定
性手術(shù)前對(duì)患有可手術(shù)的癌的受治療者施用有效量的VEGF特異性拮 抗劑例如貝伐單抗，以及至少一種化學(xué)治療劑。所述方法可被用于延長(zhǎng) 受治療者的無病生存期(disease free survival, DFS)或總體生存期(overall survival, OS)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療開始后約2至5年評(píng)估DFS 或OS。
在另 一個(gè)方面，本發(fā)明包括減小具有不可切除的腫瘤的受治療者中 腫瘤大小的方法，該方法包括對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮 抗劑，其中所述施用減小了肺瘤大小由此允許腫瘤的完全切除。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在完全切除腫瘤后對(duì)受治療者施用有 效量的VEGF特異性拮抗劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療受治療者中癌的方法，該方法包括 以下步驟a)包括多個(gè)治療周期的第一階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定 的間隔對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，以 及至少一種化學(xué)治療劑；b)確定性手術(shù)，借以去除癌；以及c)包括多個(gè) 維持周期的第二階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者施用 有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，但沒有任何化學(xué)治療劑。 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一階段包括第一個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用 VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第 一化學(xué)療法方案，之后是第二 個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第二 化學(xué)療法方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果待治療的癌是乳腺癌，那么第 一化學(xué)療法方案包括阿霉素和環(huán)磷酰胺而第二化學(xué)療法方案包括紫杉 酉f。
本發(fā)明提供了包括在確定性手術(shù)后對(duì)患有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性的癌 的受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗的方法。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括至少一種化學(xué)治療劑的使用。所 述方法可被用于延長(zhǎng)受治療者的DFS或OS。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治 療開始后約2至5年評(píng)估DFS或OS。在一個(gè)實(shí)施方案中，受治療者在 治療后至少1至5年是無病的。在一個(gè)方面，該方法包括以下步驟a)包括多個(gè)治療周期的第一階 段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者施用有效量的VEGF 特異性拮抗劑例如貝伐單抗，以及至少一種化學(xué)治療劑；以及b)包括多 個(gè)維持周期的第二階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者施 用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，但沒有任何化學(xué)治療 劑；其中組合的第一和第二階段在最初的手術(shù)后治療后持續(xù)至少一年。 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一階段包括第一個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用 VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第 一化學(xué)療法方案，之后是第二 個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第二 化學(xué)療法方案。如果待治療的癌是乳腺癌，那么例如，第一化學(xué)療法方 案包括阿霉素和環(huán)磷酰胺而第二化學(xué)療法方案包括紫杉醇。
在上述每一個(gè)方面的某些實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑是與 VEGF結(jié)合或者減少VEGF表達(dá)或生物活性的化合物。VEGF特異性拮 抗劑可以是下列示例性化合物中的任何一個(gè)與VEGF特異性結(jié)合的多 肽、VEGF特異性核酶、VEGF特異性肽體(peptibody)、與編碼VEGF 多肽的核酸分子的至少一部分互補(bǔ)的反義核堿基寡聚體、與編碼VEGF 多肽的核酸分子的至少一部分互補(bǔ)的小RNA分子或適體。特異性結(jié)合 VEGF的多肽可是可溶的VEGF受體蛋白或其VEGF結(jié)合片段或者是嵌 合的VEGF受體蛋白例如Flt-1/Fc、 KDR/Fc或Flt/KDR/Fc。特異性結(jié) 合VEGF的多肽還可是抗VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段?？筕EGF抗 體或其抗原結(jié)合片段可是單克隆抗體、嵌合抗體、完全人類抗體或人源 化抗體。在本發(fā)明的方法中有用的示例性抗體包括貝伐單抗 (AVASTIN )、 G6-31、 B20-4.1和其片段。所述抗體或其抗原結(jié)合片#殳 還可是缺少Fc部分、F(ab，)2、 Fab或Fv結(jié)構(gòu)的抗體。
依賴于疾病的類型和嚴(yán)重度，VE GF特異性拮抗劑例如貝伐單抗的 優(yōu)選劑量為本文所描述并且可從約1 /xg/kg變化至約50mg/kg，最優(yōu)選 從約5 mg/kg變化至約15 mg/kg,包括但不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg。 施用的頻率將依賴于疾病的類型和嚴(yán)重度而變化。為了將施用重復(fù)幾天 或更久，依賴于疾患，將治療維持直到如通過本文描述的或本領(lǐng)域已知 的方法所測(cè)量的治療了癌或達(dá)到所需的治療效果。在一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明的VEGF特異性拮抗劑(例如抗體)以從約5 mg/kg變化至約15 mg/kg,包括但不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg的劑量每周、每?jī)芍芑蛎?三周施用一次。但其他劑量方案可以是有效的。通過常規(guī)的技術(shù)和測(cè)定 容易地監(jiān)測(cè)本發(fā)明的療法的過程。
在上述每一個(gè)方面的另外的實(shí)施方案中，局部或系統(tǒng)地(例如口服 或靜脈內(nèi)地)施用VEGF特異性拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將使用 VEGF特異性拮抗劑的治療延長(zhǎng)直到患者在達(dá)選自由l年、2年、3年、 4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年和12年所組成的組 的時(shí)間段是無癌的。
盡管可在施用VEGF特異性拮抗劑之前、之時(shí)或之后以許多不同的 方式治療受治療者，但在本發(fā)明的每一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，受治 療者沒有進(jìn)行手術(shù)或化學(xué)療法的治療。在其他實(shí)施方案中，如由臨床醫(yī) 生所評(píng)價(jià)或本文所描述的，使用VEGF特異性拮抗劑的治療是單一療法 或持續(xù)VEGF特異性拮抗劑治療期持續(xù)時(shí)間的單一療法。
在其他實(shí)施方案中，使用VEGF特異性拮抗劑的治療是與其它的抗 癌療法相結(jié)合的，所述其它的抗癌療法包括但不限于手術(shù)、放射療法、 化學(xué)療法、分化療法(differentiating therapy)、生物療法、免疫療法、 血管生成抑制劑和抗增殖化合物。使用VEGF特異性拮抗劑的治療還可 包括上文類型的治療方案的任何組合。此外，細(xì)胞毒性劑、抗血管生成 劑和抗增殖劑可與VEGF特異性拮抗劑結(jié)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中， 抗癌療法是化學(xué)療法。例如，化學(xué)治療劑選自諸如烷化劑、抗代謝物、 葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物和相關(guān)的抑制劑、長(zhǎng)春花生物堿、 表鬼臼毒素(epipodopyyllotoxin)、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓樸異構(gòu) 酶抑制劑、干擾素、鉑配位(cooridnation)絡(luò)合物、蒽醌取代的尿素、甲 基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制藥、腎上腺皮質(zhì)甾類 (adrenocorticosteroide )、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄性激素、抗雄 性激素、促性腺激素釋放激素類似物等。在某些方面，化學(xué)治療劑和 VEGF特異性拮抗劑并行(concurrently )施用。
在包括其它的抗癌療法的實(shí)施方案中，可在施用VEGF特異性拮抗 劑之前、之時(shí)(例如同時(shí)地)或之后用其它的抗癌療法進(jìn)一步治療受治療者。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌療法是包括施用伊立替康、氟尿嘧啶、 曱酰四氬葉酸、吉西他濱或其組合的化學(xué)療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，可
將單獨(dú)或與抗癌療法一起施用的VEGF特異性拮抗劑作為維持療法施
用。在一個(gè)方面，前列腺癌、卵巢癌和乳i^癌的抗癌療法可是;;敫素療法。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將VEGF特異性拮抗劑與抗癌療法結(jié)合施 用，該抗癌療法不包括抗Her2抗體或者其片段或衍生物(例如 Herceptin⑧抗體)。
本發(fā)明的方法對(duì)治療和預(yù)防早期腫瘤，由此預(yù)防向更晚期發(fā)展，引 起與晚期癌相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的下降是尤其有益的。本發(fā)明的方法 還對(duì)預(yù)防肺瘤的復(fù)發(fā)或腫瘤的再生長(zhǎng)(例如在去除原發(fā)腫瘤后一直存在 的休眠肺瘤)或?qū)p少或預(yù)防微轉(zhuǎn)移的發(fā)生或增殖有益。
對(duì)于本發(fā)明的方法來說，癌可是實(shí)體瘤，例如諸如乳腺癌、結(jié)腸直 腸癌、直腸癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、神經(jīng)力交質(zhì)瘤(例如間變性星形細(xì)胞瘤、 間變性少突星形細(xì)胞瘤、間變性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤)、腎癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、類癌(carcinoid carcinoma)、頭頸癌、黑素瘤和卵巢癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌是胃腸 癌。
在本發(fā)明上述每一個(gè)方面的另外的實(shí)施方案中，將VEGF特異性拮 抗劑以一定量或一定時(shí)間(例如特定的治療方案的全部時(shí)間)施用以減 少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更 多的)腫瘤或癌(包括但不限于良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌)中的 癌細(xì)胞數(shù)目；以減小腫瘤、息肉或腺瘤的大??；以減小腫瘤負(fù)荷；以抑 制(即降低至某種程度和/或停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官+;以減少 激素分泌；以減少息肉的數(shù)目；以減小腫瘤或癌(包括但不限于良性的、 癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌)中血管密度；以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；以減少或抑制 腫瘤生長(zhǎng)或肺瘤細(xì)胞增殖；以減少或預(yù)防休眠腫瘤的生長(zhǎng)；以減少或預(yù) 防微轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或增殖；以減少或預(yù)防治療或去除后胂瘤的再生長(zhǎng)；以 增加或延長(zhǎng)易患或被診斷為患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的受 治療者的DFS或OS;和/或以將與癌相關(guān)的一種或多種癥狀緩解至某種 程度。在一個(gè)實(shí)例中，生存期被測(cè)量為受治療者的DFS或OS，其中在治療開始后約2至5年評(píng)估DFS或OS。在一些另外的實(shí)施方案中，VEGF 特異性拮抗劑被用于預(yù)防受治療者中癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。在 一 個(gè)實(shí)例中， 約四年后在受治療者的群體中評(píng)估癌復(fù)發(fā)的預(yù)防以證實(shí)在群體的至少 約80%中沒有發(fā)生疾病復(fù)發(fā)。在另一個(gè)實(shí)例中，VEGF特異性拮抗劑被 用于減小受治療者中腫瘤或癌復(fù)發(fā)的可能性。在一個(gè)實(shí)例中，在約3年 時(shí)評(píng)估癌復(fù)發(fā)，其中與只用化學(xué)療法治療的受治療者相比，癌復(fù)發(fā)被減 少了至少約50%。
本發(fā)明的方法還可包括監(jiān)測(cè)受治療者癌或腫瘤的復(fù)發(fā)。 根據(jù)下列的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn) 將是明顯的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A-1F是顯示Apc"^+腺瘤和正常絨毛中VEGF-A表達(dá)的系列顯 微照片。用VEGF-A探針在來自14周大Apc"^+小鼠的小腸(圖1A、 1D)和大腸(圖1B、 1E)的腸腺瘤以及正常絨毛(圖1C、 1F)上進(jìn) 行的原位雜交表明上皮細(xì)胞(arrow,箭)和基質(zhì)細(xì)J包(arrow head,箭 頭)中VEGF-A的表達(dá)。明視野圖1A-1C，暗視野圖1D-1F。
圖2A-2F是顯示VEGF-A的抑制降低腫瘤負(fù)荷并延長(zhǎng)生存期的系 列圖示。圖2A是顯示組中單獨(dú)小鼠的腫瘤負(fù)荷的圖示。通過從腫瘤負(fù) 荷的最大值到最小值的條標(biāo)示腫瘤負(fù)荷。白色十字標(biāo)示組平均值。 *P<0.008， **p<5.3xl(T5。 N指明動(dòng)物的凄t目。圖2B是通過直徑和作為 腫瘤總數(shù)目的百分比顯示腫瘤分布的系列圖示。N指明組中腫瘤的數(shù) 目。圖2C是顯示治療3周后(上)和治療6周后(中)腫瘤大小頻率 覆蓋(overlay)的系列圖示。下部的圖示顯示與第0天相比的腫瘤大小
頻率覆蓋(下)。豎線示出這樣一種大小---卜于或等于該大小時(shí)mAb
G6-31處理的動(dòng)物中腫瘤頻率較大；其在3周處理組中為1 mm而在6 周處理組中為1.2 mm。圖2D是顯示對(duì)腸中位置繪制的平均腫瘤直徑的 圖示。N分別指明在第一、第二、第三和第四腸四分之一區(qū)中每組的腫 瘤數(shù)目。第0天組包括12只動(dòng)物，其他組為10只。S:胃；C:盲腸， R:直腸。條代表SEM。與mAb G6-31三或六周相比，*P<1.0xl(T10，**p<0.002。圖2E是顯示十四只Apcmm/+、 Villin-Cre(黑色柱)和Apcmin/+、 VEGFlQX、 Villin-Cre(灰色柱)小鼠的平均腫瘤直徑的以降序顯示的圖示。 條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖2F是顯示mAb G6-31(灰線)或?qū)φ誌gG(黑 線)處理的小鼠的Kaplan-Meier的圖示。中空的箭指明治療的持續(xù)時(shí)間。 用灰色的箭表示中值生存期。*P<2.4xl(T3。 N指明組中小鼠的數(shù)目。
圖3A-3L顯示抗VEGF-A處理在改變腫瘤形態(tài)學(xué)但不是增殖指數(shù) 上的作用。圖3A-3B是亞曱基藍(lán)染色的小腸的空腸段的顯微照片。圖 3C-3D是顯示H&E染色的來自空腸的切片的低放大倍數(shù)圖像的顯微照 片。圖3E-3F是顯示H&E染色的來自空腸的腫瘤切片的高放大倍數(shù)圖 像的顯微照片。圖3G-3J是顯示肺瘤組織和正常粘膜的使用Ki-67抗體 進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的顯微照片。以H&E復(fù)染。圖3K是顯示表示 為Ki-67的陽性細(xì)胞核相對(duì)于細(xì)胞核總數(shù)目的百分比的增殖指數(shù)的圖 示。條代表SEM。圖3L是來自用對(duì)照IgG(Nl-N4)或mAb G6-31(N5-N8) 處理的動(dòng)物的正常粘膜溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡分析。來自用對(duì)照 IgG(Tl-T4)或mAb G6-31(T5-T8)處理的動(dòng)物的肺瘤溶解產(chǎn)物。
圖4A-4C顯示用mAb G6-31處理時(shí)減小的腫瘤血管區(qū)域密度。圖 4A-4B是免疫組織化學(xué)染色的來自空腸的腫瘤的80 /mi切片的共焦圖 像。綠色-CD31，血管內(nèi)皮細(xì)胞；藍(lán)色-E-鈣粘蛋白，上皮細(xì)月包；紅色-平滑肌肌動(dòng)蛋白。圖4C是顯示表示為CD31的陽性區(qū)域相對(duì)于所分析 的總腫瘤區(qū)域的百分比的血管密度的圖示。條代表SEM; n指明所分析 的肺瘤數(shù)目。
圖5A-5D是顯示抗VEGF-A處理抑制垂體腫瘤生長(zhǎng)的系列圖示。 圖5A是顯示對(duì)照IgG (黑線)和mAb G6-31 (灰線)處理的組在處理 9、 25、 39、 53和67天時(shí)的平均腫瘤體積的圖示。條代表SEM。 N指 明組中小鼠的數(shù)目。圖5B是顯示用對(duì)照IgG(實(shí)線)或mAbG6-31 (虛 線)處理的單獨(dú)小鼠的腫瘤體積的圖示。由于不健康將七只小鼠在研究 終點(diǎn)前安樂死(線在67天時(shí)間點(diǎn)前結(jié)束)。圖5C是顯示在處理開始后 9、 25、 39、 53和67天時(shí)評(píng)價(jià)的對(duì)照IgG (黑線)和mAb G6-31 (灰線) 處理的組的無腫瘤倍增的-生存期的圖示。圖5D是顯示在處理1、 7、 14、 21、 28和35天時(shí)對(duì)照IgG (黑線)和mAb G6-31 (灰線)處理的皮下垂體腫瘤移植物的腫瘤體積測(cè)量值的圖示。條代表SEM。 N指明組中小鼠的數(shù)目。圖6是顯示垂體腺和Menl+〃垂體Ai瘤表達(dá)VEGF-A、 VEGFR-1和 VEGFR-2的圖示。顯示了野生型垂體腺(黑色柱)、來自Menl+ 、鼠 的非腫瘤性的垂體腺組織(灰色)、來自Menl+ 、鼠的小的未處理的垂 體腺瘤、對(duì)照IgG處理的垂體腫瘤(紅色)和mAb G6-31處理的垂體 腫瘤(藍(lán)色)的VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2的相對(duì)表達(dá)。條代表 SEM。 Ns:不顯著。圖7是來自Menl+、卜鼠的代表性的垂體腫瘤的系列MRI圖像。顯 示了對(duì)照IgG和mAbG6-31處理的小鼠在處理9、 39和67天時(shí)具有垂 體腺瘤的冠狀切面。對(duì)于第9天，用黃色星號(hào)突出了垂體腺瘤的邊緣。 在處理開始后9、 39和67天時(shí)，分別地，對(duì)照IgG處理的腫瘤的體積 是23.2、 55.9和142.0 mm3，而mAb G6-31處理的腫瘤的體積是18.9、 27.2和35.3 mm3。圖8A-8H是顯示Menl+ 、鼠的垂體腫瘤和胰腺腫瘤的組織學(xué)檢查 的系列圖像。圖8A-8B顯示H&E染色的垂體肺瘤而圖8E-8F顯示H&E 染色的胰腺腫瘤。圖8C-8D顯示用泛內(nèi)皮(panendothelial )標(biāo)記 MECA-32進(jìn)ff的原位垂體胂瘤的免疫組織化學(xué)染色而圖8G-8H顯示用 泛內(nèi)皮標(biāo)記MECA-32進(jìn)行的原位胰腺肺瘤的免疫組織化學(xué)染色。圖81 是顯示在對(duì)照IgG和抗VEGF處理的動(dòng)物中測(cè)定垂體肺瘤中血管密度的 結(jié)果的圖示而圖8J是顯示在對(duì)照IgG和抗VEGF處理的動(dòng)物中測(cè)定胰 腺腫瘤中血管密度的結(jié)果的圖示。條代表SD。 Ns二不顯著。圖9A-9D是顯示催乳素染色陽性的來自Menl+/—小鼠的垂體腫瘤和 垂體腫瘤移植物的系列圖像。顯示了用抗催乳素抗體進(jìn)行的原位垂體腫 瘤(圖9A-9B)和皮下垂體腫瘤移植物(圖9C-9D)的免疫組織化學(xué)染 色。圖9E和9F是顯示靠近乳腺的移植的垂體腫瘤表現(xiàn)出催乳素誘導(dǎo)的 分泌變化(圖像的左邊)的圖像。圖10A-10D顯示在具有垂體腫瘤和垂體腫瘤移才直物的小鼠中血清 催乳素和生長(zhǎng)激素水平被升高。圖IOA是顯示對(duì)來自19只未處理的、 帶有腫瘤的Menl仏小鼠的垂體腫瘤體積(mm3)繪制的血清PRL(ng/ml)水平的圖示，表明正相關(guān)。圖IOB是顯示對(duì)在研究終點(diǎn)時(shí)對(duì)照IgG (黑 色三角形)和mAb G6-31 (灰色球形)處理的Menl"-小鼠的垂體腫瘤 體積繪制的血清PRL水平的圖示。圖IOC-IOD是顯示在處理1天和35 天時(shí)來自具有垂體腺瘤移植物的小鼠的血清催乳素(C )和生長(zhǎng)激素(D ) 水平的圖示。圖11是顯示在胰島腫瘤發(fā)育的小鼠Rip-T/5Ag模型中早期腫瘤發(fā)展 期間抗VEGF處理("干預(yù)")的作用的圖示。圖示顯示與用同種型匹配 的對(duì)照單克隆抗體處理相比，用抗VEGF抗體處理后9至11周時(shí)通過 血管生成胰島的平均數(shù)目測(cè)量的腫瘤血管生成的下降。圖12A和12B顯示退化試驗(yàn)的結(jié)果，其中在胰島腫瘤發(fā)育的小鼠 Rip-T/3Ag模型中用抗VEGF抗體和同種型匹配的對(duì)照單克隆抗體處理 之間未檢測(cè)到肺瘤負(fù)荷或生存期的顯著差異。圖12A是顯示與用同種 型匹配的對(duì)照單克隆抗體處理的那些小鼠相比，用抗VEGF抗體處理的 小鼠中腫瘤負(fù)荷的圖示。圖12B是顯示與用同種型匹配的對(duì)照單克隆抗 體處理的那些小鼠相比，用抗VEGF抗體處理的小鼠隨著時(shí)間存活的圖 示。療法抑制腫瘤的再生長(zhǎng)的有效性的圖示。圖14A-14D是顯示與鄰近的正常垂體前葉(下方的點(diǎn)線)相比， 原發(fā)未處理的垂體腺瘤(圖14A，點(diǎn)線之上)對(duì)生長(zhǎng)激素呈變化并弱的 陽性的系列圖像。四個(gè)移植的垂體胂瘤(對(duì)照IgG處理的)中的一個(gè)對(duì) 生長(zhǎng)激素呈弱的陽性(圖14B)。來自用mab G6-31 (圖14C )或?qū)φ?IgG (圖14D)處理的小鼠的原發(fā)垂體肺瘤對(duì)生長(zhǎng)激素呈病灶陽性。發(fā)明的詳細(xì)描述 I.定義術(shù)語"VEGF，，或"VEGF-A";故用來指165個(gè)氨基酸的人類血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和相關(guān)的121、 145、 189和206個(gè)氨基酸的人類血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如由例如Leung等人Sc/e"ce， 246:1306 (1989)和 Houck等人Mo/.五m/ocn'"., 5:1806 (1991)所描述的)，以及其天然存在的等位的和加工過的形式。VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F和P1GF的基因家族的一部分。VEGF-A主要與兩個(gè) 高親和力的受體酪氨酸激酶VEGFR-l(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)結(jié) 合，后者是VEGF-A的血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂信號(hào)的主要遞質(zhì)。此外， 神經(jīng)氈蛋白-1已被確認(rèn)為肝素結(jié)合的VEGF-A同種型的受體并可在血 管發(fā)育中起作用。術(shù)語"VEGF"或"VEGF-A，，還指來自非人類物種 例如小鼠、大鼠或靈長(zhǎng)目動(dòng)物的VEGF。有時(shí)通過術(shù)語例如用于人類 VEGF的hVEGF或用于鼠科動(dòng)物VEGF的mVEGF標(biāo)示來自特定物種 的VEGF。術(shù)語"VEGF，，還被用來指含有165個(gè)氨基酸的人類血管內(nèi) 皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸8至109或1至109的多肽的截短形式或片段。 可例如通過"VEGF(8-109)"、 "VEGF(1-109)"或"VEGF165"來識(shí)別本 申請(qǐng)中所提及的任何這種形式的VEGF。如在天然VEGF序列中所標(biāo)示 的對(duì)"截短的"天然VEGF的氨基酸位置編號(hào)。例如，在截短的天然 VEGF中的氨基酸位置17 (曱硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17 (曱 硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶?duì)KDR和Flt-l 受體的結(jié)合親和力。
如本文所用的，術(shù)語"VEGF變體"是指包括天然VEGF序列中的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變的VEGF多肽。任選地， 一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變 包括氨基酸取代。為了簡(jiǎn)化本文所描述的VEGF變體的名稱，應(yīng)當(dāng)注意 的是號(hào)碼是指沿公認(rèn)的天然VEGF的氨基酸序列的氨基酸殘基的位置 (在Leung等人，如上和Houck等人，如上中所提供的)。
"天然序列"多肽包含具有與來自自然的多肽的相同氨基酸序列的 多肽。因此，天然序列多肽可具有來自任何哺乳動(dòng)物的天然存在的多肽 的氨基酸序列?？蓮淖匀环蛛x或可通過重組或合成方法生產(chǎn)這種天然序 列多肽。術(shù)語"天然序列"多肽尤其包含所述多肽的天然存在的截短的 或分泌的形式(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列)、所述多肽的天然存在的變體 形式(例如可選擇地剪接的形式)和所述多肽的天然存在的等位變體。 多肽"變體"意指具有與天然序列多肽至少約80%的氨基酸序列同 一性的生物活性多肽。這種變體包括，例如，其中在多肽的N或C末 端添加或缺k一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽。通常，變體具有與天然序列多肽至少約80%的氨基酸序列同一性、更優(yōu)選地至少約90%的氨基酸 序列同一性、以及甚至更優(yōu)選地至少約95%的氨基酸序列同一性。
"VEGF生物活性，，包括與任何VEGF受體結(jié)合或4壬何VEGF信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)活性例如調(diào)節(jié)正常和非正常的血管生成和血管發(fā)生(Ferrara和 Davis-Smyth (1997)五油cnwe i ev. 18:4-25; Fe服a (1999)丄Mo/. M^/. 77:527-543 );促進(jìn)胚胎的血管發(fā)生和血管生成(Carmeliet等人(1996) A^m/w 380:435-439; Ferrara等人(1996) AAa/Mre 380:439-442 );以及調(diào)節(jié) 雌性生殖道中的和為了骨生長(zhǎng)以及軟骨形成的周期性血管增殖(Ferrara 等人(1998) A^mm似e丄4:336-340; Gerber等人.(1999) 7V^"" 5:623-628 )。除了作為血管生成和血管發(fā)生中的血管生成因子之外， VEGF作為多效的生長(zhǎng)因子在其他生理過程例如內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管通 透性和血管舒張、單核細(xì)胞趨化性和4丐內(nèi)流中表現(xiàn)出多種生物效應(yīng) (Ferrara和Davis-Smyth (1997),如上和Cebe-Suarez等人.Ce〃. Mo/. h/e 63:601-615 (2006))。而且最近的研究已經(jīng)報(bào)道了 VEGF對(duì)少數(shù)非內(nèi) 皮細(xì)胞類型例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、胰管細(xì)胞和施萬氏細(xì)胞的促有絲 分裂作用。Guerrin等人.(1995)丄Ce〃P/y;wW. 164:385-394; Oberg-Welsh 等人.(1997) Mo/. Ce〃.五"^cnwo/. 126:125-132; Sondell等人.(1999) 爆麗c/. 19:5731-5740。
本文在第III部分描述"VEGF特異性拮抗劑"。 "抗VEGF抗體"是以足夠的親和力和特異性與VEGF結(jié)合的抗體。 所選纟奪的抗體將通常具有對(duì)VEGF的足夠強(qiáng)的結(jié)合親和力，例如抗體可 以lOOnM-l pM之間的Kd值結(jié)合hVEGF?？衫缤ㄟ^表面等離子體共 振為基礎(chǔ)的測(cè)定(例如，如PCT申請(qǐng)公開第WO 2005/012359號(hào)中描述 的BIAcore測(cè)定)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA );以及竟?fàn)帨y(cè)定(例如 RIA的)確定抗體親和力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體 可被用作靶向并干預(yù)其中涉及VEGF活性的疾病或疾患的治療劑?？贵w 還可經(jīng)受其他的生物活性測(cè)定，例如為了評(píng)價(jià)其作為治療劑的效力。這 種測(cè)定是本領(lǐng)域已知的并取決于目標(biāo)抗原和抗體的預(yù)期用途。實(shí)例包括 HUVEC抑制測(cè)定(如下文的實(shí)施例中所描述的)；腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè) 定(例如，如WO 89/06692中所描述的)；抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性
23(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)的測(cè)定(美國(guó)專利5,500,362);以 及激動(dòng)性活性或血細(xì)胞生成的測(cè)定(參見WO 95/27062 )?？筕EGF抗 體通常不會(huì)與其他VEGF同源物例如VEGF-B或VEGF-C結(jié)合，也不 與其它生長(zhǎng)因子例如P1GF、 PDGF或bFGF結(jié)合。關(guān)于抗VEGF抗體的 另外的信息可在第m部分，A找到。
遍及本說明書和權(quán)利要求書中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號(hào)是如 Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)關(guān)注 的蛋白質(zhì)的序列)，第5版，Public Health Service( 7>共衛(wèi)生局)，National Institutes of Health (美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院)，Bethesda， Md. (1991)中的 EU索引的編號(hào)，明確地通過引用并入本文。"如Kabat中的EU索引" 是指人類IgGl EU抗體的殘基編號(hào)。
術(shù)語"抗體"被以最廣泛的意義使用并特別地涵蓋單克隆抗體(包 括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體) 以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性。
依照本發(fā)明的"Kd"或"Kd值'，是在一個(gè)實(shí)施方案中通過如下列 測(cè)定所描述的用抗體的Fab形式和VEGF分子進(jìn)行的》文射標(biāo)記的VEGF 結(jié)合測(cè)定(RIA)來測(cè)量的通過使Fab與最小濃度的(1251)標(biāo)記的 VEGF(109)在未標(biāo)記的VEGF滴定系列存在的情況下平衡，之后用抗 Fab抗體包被的板捕獲結(jié)合的VEGF,測(cè)量Fab對(duì)VEGF的溶液結(jié)合親 和力(Chen等人，(1999)/Mo/^0/293:865-881)。為確立測(cè)定的條件， 用溶于50 mM碳酸鈉(pH 9.6 )的5 ug/ml的捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs) 將微量滴定板(Dynex)包纟皮過夜，并隨后用溶于PBS的2。/。(w/v)的牛血 清白蛋白于室溫(約23 °C )封閉二至五小時(shí)。在非吸附性(non-adsorbant) 板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM的[^1]VEGF(109)與感興趣的 Fab例如Fab-12的系列稀釋液混合(Presta等人，(1997) Oz"cw 57:4593-4599)。之后將感興趣的Fab孵育過夜；但孵育可持續(xù)65小時(shí) 以確保達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲板以便于室溫孵育一小時(shí)。 之后去除溶液并將板用溶于PBS的0.1%的吐溫-20洗八次。當(dāng)板已干， 加入150 ul/孔的閃爍體(MicroScint-20; Packard )，并將板在Topcount Y計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù)十分鐘。選擇產(chǎn)生小于或等于最大結(jié)合的20%的每種Fab的濃度用于竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中。依照另一個(gè)實(shí)施方案， Kd或Kd值是通過使用表面等離子體共振測(cè)定(使用了 BIAcoreTM-2000 或BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ))于25。C用固定的 hVEGF (8-109) CM5芯片以~10響應(yīng)單元(RU )測(cè)量的。簡(jiǎn)單地說， 依照供應(yīng)商的說明書將羧曱基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5, BIAcore Inc.)用7V-乙基W-(3-二曱氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和,羥基丁 二酰亞胺(NHS)活化。在以5 ul/分鐘的流速注入前用10 mM醋酸鈉，pH 4.8將人類VEGF稀釋至5 ug/ml( 0.2 uM)以獲得約10響應(yīng)單元(RU ) 的偶聯(lián)蛋白。注入人類VEGF之后，注入1M的乙醇胺以封閉未反應(yīng)的 基團(tuán)。為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，將兩倍的Fab系列稀釋液(0.78nM至500 nM ) 于25。C以約25 ul/min的流速注入含有0.05%的吐溫20的PBS(PBST) 中。用簡(jiǎn)單的一對(duì)一 Langmuir結(jié)合模型(BIAcore評(píng)估軟件3.2版)通 過同時(shí)擬合締合和解離感應(yīng)譜(sensorgram)計(jì)算締合速率(k。n )和解離
速率(k。ff)。將平衡解離常數(shù)(Kd)計(jì)算為k。ff/k。n的比率。參見例如
Chen，Y.等人，(1999) J. Mo/Ao/ 293:865-881。如果通過上文的表面等 離子體共振測(cè)定的結(jié)合速率(on-rate)超過106 M" S",那么可通過在 逐漸增加濃度的人類VEGF短形式(8-109 )或小鼠VEGF存在的情況 下如在分光4義，例如裝備了停流的分光光度計(jì)(spectrophometer ) ( Aviv Instruments)或具有攪拌吸收池的8000系列SLM-Aminco分光光度計(jì) (The腦Spectronic )中所測(cè)量的使用測(cè)量25°C時(shí)溶于PBS， pH 7,2的 20 nM抗VEGF抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295 nm;發(fā) 射二340nm, 16nm帶通)的增大或減小的熒光淬滅技術(shù)確定結(jié)合速率。
"封閉性"抗體或抗體"拮抗劑"是抑制或降低其結(jié)合的抗原的生 物活性的抗體。例如，VEGF特異性拮抗劑抗體結(jié)合VEGF并抑制VEGF 的誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。優(yōu)選的封閉性抗體或拮抗劑抗體完全 抑制抗原的生物活性。
除非以其他方式指出，遍及此說明書使用詞組"多價(jià)抗體"表示含 有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。例如，多價(jià)抗體被改造為具有三個(gè) 或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)并通常不是天然序列的IgM或IgA抗體。
"Fv"片段是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。這一區(qū)由緊密締合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚物組成，例如在scFv中所述締合性質(zhì)上可是共價(jià)的。它處于這樣的構(gòu)型一一每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域
的三個(gè)CDR相互作用以界定Vh-Vl二聚物表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR或其子集共同將抗原結(jié)合特異性賦予抗體。但是，單個(gè)的可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含三個(gè)對(duì)抗原特異的CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管通常以比完整結(jié)合位點(diǎn)低的親和力。
如本文所用的，"抗體可變結(jié)構(gòu)域"是指包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDR;即CDR1、 CDR2和CDR3)和框架區(qū)(FR)的氨基酸序列的抗體分子的輕鏈和重鏈的一部分。vh是指重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。v^是指輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。依照本發(fā)明中所使用的方法，可按照Kabat (Sequences ofProteins of Immunological Interest (免疫學(xué)關(guān)注的蛋白質(zhì)的序歹'j )(National Institutes of Health (美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院)，Bethesda， Md.，1987和1991))定義分配纟合CDR和FR的氨基酸位置?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)也按照Kabat的編號(hào)。
如本文所用的，術(shù)語"互補(bǔ)決定區(qū)"(CDR;即CDR1、 CDR2和CDR3)是指其存在是抗原結(jié)合所必需的抗體可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域通常具有被鑒定為CDR1、 CDR2和CDR3的三個(gè)CDR區(qū)。每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)可含有來自如由Kabat所定義的"互補(bǔ)決定區(qū)，，的氨基酸殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的大約24-34(Ll)、 50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3)殘基；Kabat等人，Se《wewces q/"/VotezVw o//m附wwo/og/ca/ /w/ems/ (免疫學(xué)關(guān)注的蛋白質(zhì)的序列)，第5版.Public Health Service (公共衛(wèi)生局)，National Institutes of Health (美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院)，Bethesda， MD.(1991))和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的大約26-32(Ll)、 50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(Hl)、53隱55(H2)和96-101(H3)殘基；Chothia和Lesk, Mo/. 196:901-917(1987))。在某些實(shí)例中，互補(bǔ)決定區(qū)可包含來自按照Kabat定義的CDR區(qū)和高變環(huán)兩者的氨基酸。例如，抗體4D5的重鏈的CDRH1包含氨基酸26至35。
"框架區(qū)"(此后的FR)是除了 CDR殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域
26殘基。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域通常具有被鑒定為FR1、 FR2、 FR3和FR4的四個(gè)FR。如果按照Kabat定義CDR，那么輕鏈FR殘基位于大約l-23(LCFRl)、 35-49(LCFR2)、 57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)殘基而重鏈FR殘基位于重鏈殘基中的大約l-30(HCFRl)、 36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)殘基。如果CDR含有來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基位于輕鏈中的大約l-25(LCFRl)、33-49(LCFR2)、 53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)殘基而重鏈FR殘基位于重鏈殘基中的大約l-25(HCFRl)、 33-52(HCFR2)、 56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)殘基。在某些實(shí)例中，當(dāng)CDR含有來自如Kabat所定義的CDR和高變環(huán)的那些氨基酸的氨基酸時(shí)，那么FR殘基將被相應(yīng)地調(diào)整。例如，當(dāng)CDRH1包括氨基酸H26-H35時(shí)，重鏈FR1殘基是在1-25位置而FR2殘基是在36-49位置。
"Fab"片段含有輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1 )。 F(ab，)2抗體片段含有一對(duì)通常通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸在它們的羧基末端附近共價(jià)連接的Fab片段?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是本領(lǐng)域已知的。
"單鏈Fv"或"scFV"抗體片段含有抗體的Vh和Vl結(jié)枸域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)的多肽鏈中。通常Fv多肽進(jìn)一步包括Vh和V^結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，其使scFv能夠形成抗原結(jié)合所需要的結(jié)構(gòu)。scFv的綜述，參見Pluckthim在77ze尸/za削aco/ogy o/ Mowoc/owa/v4""6c^m (單克隆抗體的藥理學(xué))，113巻，Rosenburg和Moore編輯,Springer-Verlag， New York ，第269-315頁(1994)。
術(shù)語"雙抗體"是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小的抗體片段，該片段包含與同一條多肽鏈(Vh和VJ中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vj相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不允許相同鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接體，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體纟皮更加完整地描述于例如EP 404,097; WO93/11161以及Hollinger等人，尸roc.胸/. JcaA Sc/.園,90:6444-6448(1993)中。
詞組"線性抗體"是指Zapata等人，8(10):1057-1062(1995)中描述的抗體。簡(jiǎn)單地說，這些抗體含有一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段 (Vh-Ch1-Vh-Ch1 )，其與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線 性抗體可是雙特異性或單特異性的。
如本文所用的，術(shù)語"單克隆抗體"是指從基本上均一的抗體的群 中獲得的抗體，即所述群所包含的單個(gè)抗體除了可以較小量存在的可能 自然發(fā)生的突變以外是完全相同的。針對(duì)單一的抗原性位點(diǎn)的單克隆抗 體是高特異性的。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗 體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相比，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上單一的 決定簇。修飾語"單克隆，，表明抗體的特征是從基本上均一的抗體群中 獲得的，并不被解釋為需要通過任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，將依 照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過首次由Kohler等人，256:495 (1975)描述的雜交瘤方法制得，或可通過重組DNA的方法(參見，例 如美國(guó)專利第4,816,567號(hào))制得。還可使用例如Clackson等人，淑騰 352:624-628 (1991)和Marks等人.,她/. 5,W. 222:581-597 (1991)中描 述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離"單克隆抗體"。
本文單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，以及這些 抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(美國(guó)專利第4,816,567 號(hào)；和Morrison等人，Prac. Ato/.爿cW. "&4 81 :6851-6855 (1984))， 所述"嵌合"抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或?qū)儆?br> 部分與來自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類或亞類的抗體中的相應(yīng)序
列完全相同或同源。
非人類(例如鼠科動(dòng)物)抗體的"人源化"形式是含有最少的來自 非人類免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分來說，人源化抗體是 人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者高變區(qū)的殘基被來自具有 所需要的特異性、親和力和能力的非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非 人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物的高變區(qū)(供者抗體)的殘基取代。在一些實(shí)例中，人 類免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類殘基取代。此外， 人源化抗體可包含在受者抗體或供者抗體中找不到的殘基。進(jìn)行這些修 飾以進(jìn)一步完善抗體性能。通常，人源化抗體將包括基本上全部的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本上全部的高變環(huán)與非人類 免疫球蛋白的高變環(huán)一致并且全部或基本上全部的FR區(qū)是人類免疫球
蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體還將任選地含有免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc ), 通常是人類免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參 見Jones等人，A^wre 321 :522-525 (1986); Riechmann等人，A^ww 332:323-329 (1988);和Presta, Cwa Op. 5Vn/".歷o/. 2:593-596 (1992)。
"人類抗體"是具有與通過人生產(chǎn)的抗體和/或使用如本文所公開
的任何 一 項(xiàng)制造人類抗體的技術(shù)制得的抗體的氨基酸序列 一 致的氨基 酸序列的抗體。人類抗體的這一定義尤其排除了含有非人類抗原結(jié)合殘 基的人源化抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的不同技術(shù)生產(chǎn)人類抗體。在一個(gè) 實(shí)施方案中，人類抗體選自噬菌體文庫(kù)，其中噬菌體文庫(kù)表達(dá)人類抗體 (Vaughan等人.A^ww歷otec/mo/ogy 14:309-314 (1996); Sheets等人. 尸亂胸/. JcW. 95:6157-6162 (1998》；Hoogenboom和Winter, 乂 Mo/.腸/" 227:381 (1991); Marks等人，Mo/.腸/" 222:581 (1991))。還 可通過將人類免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如小鼠中制得人類 抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分或完全地失 活。攻擊后，觀察了人類抗體的產(chǎn)生，其在包括基因重排、組裝和抗體 譜的所有方面上都與在人類中所見到的非常相似。這一方法被描述于例 如美國(guó)專利第5,545,807; 5，545，806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016號(hào)和下列科學(xué)出版物中Marks等人，所o/rec/mo/ogy 10: 779-783 (1992); Lonberg等人，淑臟368: 856-859 (1994); Morrison, A^wre 368:812-13 (1994); Fishwild等人，Atowe 5/o&c/mo/ogy 14: 845-51 (1996); Neuberger,淑畫腸/ec/mo/ogy 14: 826 (1996); Lonberg和 Huszar, /"&r", "ev. /wmwwo/. 13:65-93(1995)?？蛇x擇地，可經(jīng)由針對(duì)目 標(biāo)抗原產(chǎn)生抗體的人類B淋巴細(xì)胞(這類淋巴細(xì)胞可從個(gè)體中被回收或 可在體外被免疫)的無限增殖化制備人類抗體。參見，例如Cole等人，
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌療法)，Alan R. Liss,第77頁(1985); Boerner等人，/畫,/.' 147 (l):86-95 (1991) 和美國(guó)專利第5,750,373號(hào)。
"親和力成熟的"抗體是在其一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一個(gè)或多個(gè)原的親和力上的改善。優(yōu)選的親和力成熟的抗體具有對(duì)目標(biāo)抗原的納摩 爾或甚至皮摩爾級(jí)的親和力。通過本領(lǐng)域已知的程序生產(chǎn)親和力成熟的
抗體。Marks等人.所o/7fec/mo/ogy 10:779-783 (1992)描述了通過VH和 VL結(jié)構(gòu)域改組(shuffling)的親和力成熟。由以下描述了 CDR和/或框架 殘基的隨機(jī)的誘變Barbas等人.尸racA^. *SW, 91 :3809-3813
(1994); Schier等人，169:147-155 (1995); Yelton等人./mmw"o/. 155:1994-2004 (1995); Jackson等人，/附mw"o/. 154(7):3310畫9 (1995) 和Hawkins等人，Mo/. 5zo/. 226:889-896 (1992)。
抗體的"功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)"是能夠結(jié)合目標(biāo)抗原的位點(diǎn)?？乖?結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力不必與抗原結(jié)合位點(diǎn)所來自于的母體抗體 一樣強(qiáng)，但結(jié)合抗原的能力必須是使用已知的評(píng)估抗體對(duì)抗原的結(jié)合的 多種方法中的任何一種可測(cè)量的。而且，本文的多i"介抗體的每一個(gè)抗原 結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力在數(shù)量上不必相同。對(duì)于本文的多聚體抗體 來說，可使用如美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20050186208號(hào)的實(shí)施例2中所描 述的超速離心分析評(píng)價(jià)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。依照這一分析方
的不同數(shù)目而計(jì)算復(fù)合物的平均分子量。將這些理論值與所獲得的實(shí)際 的實(shí)驗(yàn)值對(duì)比以便評(píng)價(jià)功能性結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。
具有指定抗體的"生物特性"的抗體是具有該抗體的一種或多種使 其區(qū)別于與相同抗原結(jié)合的其他抗體的生物特性的抗體。
為了篩查與感興趣的抗體所結(jié)合的抗原上的表位結(jié)合的抗體，可進(jìn) 4亍常頭見的交叉封閉測(cè)定例如Antibodies, A Laboratory Manual (抗體的實(shí) -驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實(shí)-瞼室)，Ed Harlow 和David Lane (1988)中描述的測(cè)定。
"物種依賴性抗體，，是對(duì)來自第 一哺乳動(dòng)物物種的抗原具有比對(duì)來 自第二哺乳動(dòng)物物種的該抗原的同源物的親和力更強(qiáng)的結(jié)合親和力的 抗體。通常，物種依賴性抗體"特異性地結(jié)合"于人類抗原(即具有不 超過約lxl0々M，優(yōu)選地不超過約lxl0—8M，并最優(yōu)選地不超過約lxl(T9 M的結(jié)合親和力(Kd)值)，但具有對(duì)來自第二非人類哺乳動(dòng)物物種的抗原的同源物的結(jié)合親和力比所述抗體對(duì)人類抗原的結(jié)合親和力弱至
少約50倍，或至少約500倍，或至少約1000倍。物種依賴性抗體可以 是如上文所定義的不同類型的抗體中的任何一種，但通常是人源化或人 類抗體。
如本文所用的，"抗體突變體"或"抗體變體"是指物種依賴性抗 體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已 被修飾。這種突變體必須具有與物種依賴性抗體的小于100%的序列同
一性或相似性。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體突變體將具有與物種依賴性抗
體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有至少75%,更優(yōu)選地至少 80%,更優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90%，并最優(yōu)選地至少95%的 氨基酸序列同 一性或相似性的氨基酸序列。本文關(guān)于這一序列的同 一性 或相似性被定義為在比對(duì)序列并引入空位(如果需要)以達(dá)到最大百分 比的序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同(即同樣的 殘基)或相似(即來自以共同側(cè)鏈特性為基礎(chǔ)的相同組的氨基酸殘基， 參見下文)的氨基酸殘基的百分比。對(duì)可變結(jié)構(gòu)域外部的抗體序列的 N-末端、C-末端或內(nèi)部的延伸、缺失或插入都不應(yīng)當(dāng)被理解為影響序列 同一性或相似性。
為了增加含有本發(fā)明的氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期，如例如 美國(guó)專利5,739,277中所描述的，可對(duì)抗體(尤其是抗體片段)附加一 個(gè)補(bǔ)救受體結(jié)合表位。例如，可將編碼補(bǔ)救受體結(jié)合表位的核酸分子在 框架中與編碼本發(fā)明的多肽序列的核酸連4妻以便通過改造的核酸分子 表達(dá)的融合蛋白含有補(bǔ)救受體結(jié)合表位和本發(fā)明的多肽序列。如本文所 使用的，術(shù)語"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"是指IgG分子(例如IgG,、 IgG2、 IgGs或IgG4)的Fc區(qū)的表位，其起到增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期 的作用(例如Ghetie等人，i ev. /mw頭o/. 18:739-766 (2000)，表1 )。 其Fc區(qū)中具有取代以及具有增加的血清半衰期的抗體還描述于 WO00/42072、 WO 02/060919; Shields等人，,所o/, CT em. 276:6591-6604 (2001); Hinton, 所o/. C力em. 279:6213-6216 (2004))中。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，通過例如附加其他多肽序列也可增加血清半衰期。例如，可將 用于本發(fā)明方法中的抗體或其他多肽附加于與FcRn受體或血清白蛋白
31結(jié)合肽結(jié)合的血清白蛋白或血清白蛋白的一部分以便血清白蛋白與抗
體或多肽例如WOO 1/45746中所公開的這些多肽序列結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施 方案中，將被附加的血清白蛋白肽含有DICLPRWGCLW的氨基酸序列。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過這些方法增加了 Fab的半衰期。對(duì)于血清白 蛋白結(jié)合肽序列也參見Dennis等人，J.所o/. CAew. 277:35035-35043 (2002)。
"嵌合VEGF受體蛋白"是具有來自至少兩個(gè)不同蛋白質(zhì)(其中至少 一個(gè)是VEGF受體蛋白)的氨基酸序列的VEGF受體分子。在某些實(shí)施 方案中，嵌合VEGF受體蛋白能夠結(jié)合VEGF并抑制VEGF的生物活性。
"分離的"多肽或"分離的"抗體是已經(jīng)從其自然環(huán)境的 一個(gè)組分中 識(shí)別并分離和/或回收的多肽或抗體。其自然環(huán)境的污染物組分是會(huì)干 擾多肽或抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素和其他蛋白質(zhì) 的或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，多肽或抗體將被純化(l) 以至大于如通過羅氏法(Lowry method)測(cè)定的多肽或抗體的95%重量， 并最優(yōu)選的大于99%重量，(2)以至足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得 N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或(3)以至通過在 還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)或銀染色的SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)性。 分離的多肽或抗體包括重組細(xì)胞中原位的多肽或抗體，因?yàn)槎嚯奶烊画h(huán) 境的至少一個(gè)組分將不存在。然而，通常將通過至少一個(gè)純化步驟制備 分離的多肽或抗體。
所謂的"片段"，意指優(yōu)選地含有參考核酸分子或多肽的全長(zhǎng)的至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或更多 的多肽或核酸分子的一部分。片l殳可含有10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100、 200、 300、 400、 500、 600或更多核苷酸或者10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 140、 160、 180、 190、 200或更多氨基酸。
"抗血管生成劑，，或"血管生成抑制劑，，是指直接或間接地抑制血管 生成、血管發(fā)生或不需要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多 肽、分離的蛋白質(zhì)、重組的蛋白質(zhì)、抗體、或者其軛合物或融合蛋白。應(yīng)當(dāng)理解的是，抗血管生成劑包括結(jié)合血管生成因子或其受體并阻斷其 血管生成活性的那些劑。例如，抗血管生成劑是如上文定義的血管生成
劑的抗體或其他拮抗劑，例如VEGF-A或VEGF-A受體(諸如KDR受 體或Flt-l受體)的抗體、抗PDGFR抑制劑諸如Gleevec (曱磺酸伊 馬替尼)?？寡苌蓜┻€包括天然的血管生成抑制劑例如血管他丁、 內(nèi)皮4也丁等。參見，例如Klagsbrun和D，Amore， Jwww. i ev. P/^Wo/., 53:217-39 (1991); Streit和Detmar， Owcoge"e, 22:3172-3179 (2003)(例 如歹'J出惡性黑素瘤的抗血管生成療法的表3); Ferrara & Alitalo, A^w" MeAc/"e 5:1359-1364 (1999); Tonini等人，O"coge"e， 22:6549-6556 (2003) (例如列出已知的抗血管生成因子的表2)以及Sato. /"A C//". (9"co/., 8:200-206 (2003)(例如表1列出臨床試驗(yàn)中所使用的抗血管生成劑)。
"治療"是指治療性處理和預(yù)防疾病的或預(yù)防性的措施。需要治療的 那些包括已經(jīng)患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的那些以及其中癌 的發(fā)生或復(fù)發(fā)有待被預(yù)防的那些。
術(shù)語"治療上有效的量"是指治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中疾病或病癥的 VEGF特異性拮抗劑的量。在癌前的、良性的或早期腫瘤的實(shí)例中，治 療上有效的量的VEGF特異性拮抗劑可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；減小原發(fā)腫 瘤的大??；抑制(即減慢至某種程度和優(yōu)選地停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周 器官中；抑制(即減慢至某種程度和優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制(至 某種程度)腫瘤生長(zhǎng)；和/或使與所述病癥相關(guān)的一種或多種癥狀緩解 至某種程度。對(duì)于腫瘤休眠或微轉(zhuǎn)移的治療來說，治療上有效的量的 VEGF特異性拮抗劑可減少微轉(zhuǎn)移的數(shù)目或增殖；減少或預(yù)防休眠腫瘤 的生長(zhǎng)；或在治療或去除(例如，使用抗癌療法諸如手術(shù)、；故射療法或 化學(xué)療法)后減少或預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。藥物可以某種程度預(yù)防生長(zhǎng)和/ 或殺死存在的癌細(xì)胞，它可是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于 癌治療，體內(nèi)效力可例如通過評(píng)定存活的持續(xù)時(shí)間、疾病發(fā)展時(shí)間 (TTP)、響應(yīng)率(RR)、響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、緩解的時(shí)間和/或生活質(zhì)量來 測(cè)量。有效的量可增加無病生存期(DFS)、增加總體生存期(OS)、減 小復(fù)發(fā)的可能性、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)的時(shí)間、延長(zhǎng)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的時(shí)間(即在原發(fā)部 位外部的復(fù)發(fā))、治愈癌、改善癌癥狀(例如使用癌特定的4企查所測(cè)量的)、減少第二原發(fā)癌的出現(xiàn)等。
"可手術(shù)的"癌是被局限于原發(fā)器官并適于手術(shù)的癌。 "生存期"是指患者依然活著，并包括無病生存期(DFS)、無發(fā)展
生存期(PFS)和總體生存期(OS)。可通過Kaplan-Meier法評(píng)估生存 期，并使用分層的時(shí)序檢驗(yàn)(stratified log-rank test)計(jì)算生存期的任何 差異。
"無病生存期(DFS)"是指患者自治療開始或自最初的診斷保持活 著、沒有復(fù)發(fā)癌所持續(xù)的確定的一段時(shí)間，例如約1年、約2年、約3 年、約4年、約5年、約10年等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，依照意向治 療的原則分析DFS，即在他們的指定的療法的基礎(chǔ)上評(píng)估患者。用于 DFS的分析的事件可包括癌的原處(local )、區(qū)域和遠(yuǎn)處的復(fù)發(fā)，繼發(fā) 性癌的發(fā)生和沒有之前事件(例如，乳腺癌復(fù)發(fā)或第二原發(fā)癌)的患者 中的由于^f壬^f原因的死亡。
"總體生存期"是指患者自治療開始或自最初的診斷保持活著所持 續(xù)的確定的一段時(shí)間，例如約l年、約2年、約3年、約4年、約5年、 約10年等。在本發(fā)明的研究中，用于生存期分析的事件是由于任何原 因的死亡。
所謂的"延長(zhǎng)生存期"，意指在已治療的患者中相對(duì)于未治療的患者 (即相對(duì)于沒有用VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體治療的患者)， 或相對(duì)于對(duì)照治療方案例如僅用化學(xué)治療劑諸如紫杉醇的治療增加 DFS和/或OS。在治療開始之后或在最初的診斷之后，監(jiān)測(cè)生存期至少 約六個(gè)月，或至少約一年，或至少約2年，或至少約3年，或至少約4 年，或至少約5年，或至少約10年等。
生存期分析中的"危害比"是兩個(gè)生存期曲線之間差異的概括，表示 在隨訪的時(shí)間段內(nèi)與對(duì)照相比治療時(shí)死亡風(fēng)險(xiǎn)上的降低。危害比是事件 比率的統(tǒng)計(jì)學(xué)定義。為了本發(fā)明，將危害比定義為表示在任何時(shí)間上的 特定點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組(arm)中的事件的概率除以對(duì)照組中的事件的概率。
本文術(shù)語"并行地"被用于指兩種或更多種治療劑的施用，其中所述 施用的至少一部分在時(shí)間上重疊。因此，并行施用包括當(dāng)在停止一種或 多種劑的施用后繼續(xù) 一 種或多種其他劑的施用時(shí)的給藥方案。
34所謂的"單一療法"，意指在治療期的過程中僅包括一種用于癌或腫
瘤治療的治療劑的治療方案。使用VEGF特異性拮抗劑的單一療法意指 在治療期期間在不存在其它的抗癌療法的情況下施用VEGF特異性拮 抗劑。
所謂的"維持療法"，意指被提供以減小疾病復(fù)發(fā)或發(fā)展的可能性的 治療方案。可將維持療法提供達(dá)任何長(zhǎng)度的時(shí)間，包括延長(zhǎng)的直到受治 療者壽命的時(shí)間段。可將維持療法在最初的療法之后或與最初或其它的 療法聯(lián)合起來提供。維持療法所使用的劑量可變化并且可包括與用于其 他類型療法的劑量相比減少的劑量。
本文"新輔助療法"或"手術(shù)前療法"是指在手術(shù)前提供的療法。新輔 助療法的目的是提供即時(shí)的系統(tǒng)的治療，可能地根除微轉(zhuǎn)移(不然其會(huì) 增殖，如果遵照手術(shù)隨后是系統(tǒng)療法的標(biāo)準(zhǔn)順序)。新輔助療法還可幫 助減小腫瘤大小由此允許完全切除最初不可切除的胖瘤，或保留部分器 官和其功能。而且，新輔助療法允許在體內(nèi)評(píng)定藥物效力，這可指導(dǎo)隨
后的治療選擇。
本文"輔助療法"是指在手術(shù)后不能檢測(cè)到殘留疾病的跡象時(shí)提供 的療法，以降低疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。輔助療法的目的是預(yù)防癌的復(fù)發(fā)并因 此減^f氐癌相關(guān)的死亡的幾率。
本文"標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理，，化學(xué)療法是指常規(guī)使用以治療特定癌的化學(xué)治 療劑。
如在醫(yī)學(xué)團(tuán)體中使用該術(shù)語的方式使用"確定性手術(shù)"。確定性手術(shù) 包括例如手術(shù)的或其他方面的導(dǎo)致腫瘤去除或切除的程序，所述程序包 括導(dǎo)致所有很可見的腫瘤去除或切除的那些程序。確定性手術(shù)包括，例 如完全或有療效的切除或者完全的全切除肺瘤。確定性手術(shù)包括在一個(gè) 或多個(gè)階段內(nèi)發(fā)生的程序并包括例如切除腫瘤前進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)手術(shù) 或其它程序的多階段手術(shù)的程序。確定性手術(shù)包括移走或切除腫瘤，包 括所涉及的器官、部分器官和組織以及周圍器官例如淋巴結(jié)、部分器官 或組織的程序。
術(shù)語"癌"或"癌的"是指或描述哺乳動(dòng)物中通常以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞 生長(zhǎng)為特征的生理疾患。這一定義中包括良性的和惡性的癌以及休眠的腫瘤或微轉(zhuǎn)移。所謂的"早期癌"或"早期腫瘤"意指未擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的或者 -故分類為0、 I或II期癌的癌。
術(shù)語"癌前的"是指通常先于癌或發(fā)展為癌的狀況或生長(zhǎng)。"癌前的" 生長(zhǎng)將具有以可通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖或分化的標(biāo)記測(cè)定的不正 常的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、增殖或分化為特征的細(xì)胞。
所謂的"發(fā)育異常，，意指組織、器官或細(xì)胞的任何不正常的生長(zhǎng)或發(fā)
育。優(yōu)選地，發(fā)育異常是高級(jí)別或癌前的。
所謂的"轉(zhuǎn)移"意指癌從其原發(fā)部位向體內(nèi)其他地方的擴(kuò)散。癌細(xì)胞
可,人原發(fā)肺瘤脫離，滲入淋巴管和血管，通過血流循環(huán)并在體內(nèi)別處的 正常組織中的遠(yuǎn)處病灶中生長(zhǎng)(轉(zhuǎn)移)。轉(zhuǎn)移可以是原處或遠(yuǎn)處的。轉(zhuǎn) 移是相繼的過程， 一見腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫離，通過血流移動(dòng)并在遠(yuǎn)處 部位停留的情況而定。在新的部位，細(xì)胞建立血液供給并可生長(zhǎng)以形成
威脅生命的塊(mass)。肺瘤細(xì)胞中刺激性和抑制性分子通路都調(diào)節(jié)這 一行為并且在遠(yuǎn)處部位中肺瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞之間的相互作用也是顯 著的。
所謂的"微轉(zhuǎn)移"意指已從原發(fā)腫瘤向身體其他部分?jǐn)U散的少量細(xì) 胞。微轉(zhuǎn)移在篩查或診斷試驗(yàn)中可或不可被檢測(cè)。
所謂的"非轉(zhuǎn)移性的"意指是良性的或保留在原發(fā)部位并沒有滲入 淋巴管或血管系統(tǒng)或原發(fā)部位以外的組織的癌。通常，非轉(zhuǎn)移性的癌是 為0、 I或II期癌，并且偶爾為III期癌的任何癌。
提到腫瘤或癌為"O期"、"I期"、"II期"、"III期"或"IV期"是指使 用本領(lǐng)域已知的總體時(shí)期分組或羅馬數(shù)字分期法(Overall Stage Grouping or Roman Numeral Staging method)的月中瘤或癌的分級(jí)。盡管 癌的實(shí)際階段依賴于癌的類型，但通常，0期癌是原位病變，I期癌是 小的局部的腫瘤，II和III期癌是表現(xiàn)出涉及局部淋巴結(jié)的局部晚期肺 瘤，和IV期癌代表轉(zhuǎn)移性癌。每種類型腫瘤的具體階段是熟練的臨床 醫(yī)生已知的。
如本文所用的"胂瘤"是指所有腫瘤性的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(無論惡性 或良性的)以及所有癌前的和癌的細(xì)胞和組織。
所謂的"原發(fā)腫瘤"或"原發(fā)癌"意指起初的癌而不是定位于在受治療者體內(nèi)的其他組織、器官或位置的轉(zhuǎn)移性的病變。
所謂的"良性肺瘤"或"良性癌"意指保持局限于起源的部位并且不 具有浸潤(rùn)、侵入或轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處部位的能力的腫瘤。
本文"癌復(fù)發(fā)"是指治療后癌的再次發(fā)生，并包括原發(fā)器官中癌的再 次發(fā)生以及癌在原發(fā)器官外部再次發(fā)生時(shí)的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。
所謂的"腫瘤休眠"意指其中腫瘤細(xì)胞存在但腫瘤發(fā)展不是臨床上 明顯的長(zhǎng)時(shí)間靜止?fàn)顟B(tài)。在篩查或診斷試驗(yàn)中休眠腫瘤可或不可被檢 測(cè)。
所謂的"腫瘤負(fù)荷"意指體內(nèi)癌細(xì)胞的數(shù)目、腫瘤的大小或癌的量。
腫瘤負(fù)荷也^:稱為腫瘤負(fù)載。
所謂的"腫瘤數(shù)目"意指腫瘤的數(shù)目。
所謂的"受治療者"意指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人類或非人類的哺 乳動(dòng)物，例如牛科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、綿羊科動(dòng)物或貓科動(dòng)物。 優(yōu)選地，受治療者是人類。
受治療者"群體"是指患有癌的受治療者組，例如在臨床試驗(yàn)中，或
如肺瘤學(xué)家纟安照FDA批準(zhǔn)用于特定適應(yīng)癥的、例如癌新輔助療法所見 到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，群體包括至少3000例受治療者。
術(shù)語"抗癌療法"是指在治療癌中有用的療法?？拱┲委焺┑膶?shí)例包 括但不限于例如手術(shù)、化學(xué)治療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒性劑、用于放 射療法的劑、抗血管生成劑、細(xì)胞凋亡劑、抗微管蛋白劑以及治療癌的 其他劑，例如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑HER1/EGFR抑制劑(諸如埃羅替尼 (TarcevaTM)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子的抑制劑(諸如GleevecTM (曱 磺酸伊馬替尼))、COX-2抑制劑(例如塞來昔布)、干擾素、細(xì)胞因子； 與下列目標(biāo)ErbB2、 ErbB3、 ErbB4、 PDGFR-/5、 BlyS、 APRIL、 BCMA 或VEGF受體、TRAIL/Apo2中的 一 個(gè)或多個(gè)結(jié)合的拮抗劑(例如中和 抗體)以及其他的生物活性和有機(jī)的化學(xué)劑等。本發(fā)明中也包括其組合。
如本文所用的，術(shù)語"細(xì)胞毒性劑"是指抑制或阻斷細(xì)胞功能和/或 導(dǎo)致細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意在包括放射性同位素(例如I'31、 I125、 Y卯和Re186)、化學(xué)治療劑和毒素例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶促活性的毒素或其片段。
"化學(xué)治療劑"是在癌的治療中有用的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí) 例包括在癌的治療中有用的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例包括烷化劑
例如漆替派和CYTOXAN⑧環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide );烷基磺酸 酯例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯佐替派 (benzodopa )、卡巴敏、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa); 乙撐亞胺和曱基蜜胺(methylamelamines)包括六曱蜜胺、曲它胺、三亞 乙基褲酰胺(trietylenephosphoramid )、 三亞乙基辟u代磷酰胺 (triethiylenethiophosphoramide) 和 三 羥曱 基 蜜 胺 (trimethylolomelamine );多聚乙酰(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)； 喜樹石威(包括合成類似物拓樸替康)；苔蘚抑素；callystatin; CC-1065 (包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；自念珠藻環(huán)肽 (尤其是自念珠藻環(huán)肽1和自念珠藻環(huán)肽8 );多拉司他汀；duocarmycin (包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1 );艾榴素(eleutherobin);水鬼 蔑石威(pancratistatin); 甸沖支3冊(cè)炎月酉孚(sarcodictyin); spongistatin; 氛齊例^口 苯丁酸氮齊、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙 氯乙基曱胺、鹽酸曱氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司 汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲例如亞硝基脲氮芥、氯脲菌素、福 莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine );抗生素例如 烯二炔類抗生素(諸如加里剎霉素，尤其是加里剎霉素711和加里剎霉 素"II (參見，例如Agnew, CAem M Ewg/" 33: 183-186 (1994)); 達(dá)內(nèi)霉素包括達(dá)內(nèi)霉素A; 二磷酸鹽例如氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素；以 及新制癌菌素發(fā)色團(tuán)以及相關(guān)的色素蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿 克拉霉素(aclacinomysins )、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博 來霉素、放線菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌素、色霉 素(chromomycinis )、放線菌素D、道諾霉素、地托比星、6-重氮-5-氧 -L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧阿霉素(包括嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代 阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素和脫氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊 達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素例如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾拉霉素、 橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、
38羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐
柔比星；抗代謝物例如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物例如 二曱葉酸、曱氨蝶呤、蝶酰蝶呤、三曱曲沙；噤呤類似物例如氟達(dá)拉濱、 6-巰基。票呤、硫咪。票呤、硫鳥。票呤；嘧咬類似物例如安西他濱、阿扎胞 苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他 濱、氟尿苷；雄性激素例如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄 烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺物例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充 物例如亞葉酸(frolinic acid);醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖香；氨基果糖 酸；恩尿嘧啶；安吖啶；百垂布昔(bestrabucil);比生群；依達(dá)曲沙 (edatraxate ); defofamine;地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸(elfornithine ); 依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達(dá) 明(lonidainine );美登醇(maytansinoid)例如美登素和安絲菌素；米托胍 腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇(mopidanmol); 二胺硝吖咬(nitraerine);噴司 他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸乙肼(podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide );曱千肼；PSK 多糖絡(luò)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋鍺；細(xì)交鏈孢菌酮酸； 三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢霉 素(verracurin) A、桿孢菌素A和蛇形菌素(anguidine));烏4立坦；長(zhǎng) 春地辛；達(dá)卡巴。秦；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara C");環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉烷例如 TAXOL 紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)、 ABRAXANETM無Cremophor且白蛋白改造的紫杉醇納米顆粒制劑 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和TAXOTERE 多西紫杉醇(doxetaxel) (Rh6ne隱Poulenc Rore Antony, France); 苯丁酸 氮芥(chlomnbucil); GEMZAR⑧吉西他濱；6-硫鳥噤呤；巰基。票呤； 曱氨蝶呤；鉑類似物例如順鉑和碳鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊苷(VP-16); 異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長(zhǎng)春新》成；NAVELBINE⑧長(zhǎng)春瑞濱；諾消靈； 替尼泊苷；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨喋呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；伊立 替康(Camptosar, CPT-ll)(包括與5-FU和曱酰四氫葉酸一起的伊立替康 的治療方案)；拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥氨酸
39(difluorometlhylornithine ) (DMFO);類浮見黃醇例如—見黃酸；卡培他濱； 考布他?。粫貂Ｋ臍淙~酸(LV);奧沙利鉑，包括奧沙利鉑治療方案 (FOLFOX);減少細(xì)胞增殖的PKC-a、 Raf、 H-Ras、 EGFR(例如埃羅替 尼(TarcevaTM))和VEGF-A的抑制劑以及上述任何一種物質(zhì)的藥學(xué)上可 接受的鹽、酸或衍生物。
這一定義中還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素 劑例如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括諸如三 苯氧胺(包括NOLVADEX⑧三苯氧胺)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基 三苯氧胺、曲沃昔芬、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奧那司 酮和FARESTON托瑞米芬；抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素產(chǎn)生的芳香酶 的芳香酶抑制劑，例如，諸如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE⑧醋酸曱 地孕酮、AROMASIN 依西美坦、福美坦(formestanie )、法倔唑、 RIVISOR⑧伏氯唑、FEMARA⑧來曲哇和ARIMIDEX⑧阿那曲唑；以及 抗雄性激素藥例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林； 以及曲沙他濱(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核普酸，尤其 是抑制在粘附細(xì)胞(abherant cell)增殖中涉及的信號(hào)通路中的基因(例 如，諸如PKC-ce、 Raf和H-Ras)的表達(dá)的那些；核酶例如VEGF表達(dá) 抑制劑(諸如ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；疫苗例如基 因療法疫苗，諸如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2; LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶1抑制劑； AB ARELIX⑧rmRH; 長(zhǎng)春瑞濱和埃斯培4立霉素(參見美國(guó)專利第 4,675,187號(hào))以及上述任何一種物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生 物。
當(dāng)本文使用"生長(zhǎng)抑制劑"時(shí)是指在體外和/或體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的 化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可是顯著減小S期中細(xì)胞的百分比 的劑。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)行(在除了 S期的某處) 的劑，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的劑。典型的M期阻斷劑包括長(zhǎng) 春堿類(vincas)(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)、TAXOL⑧和拓樸異構(gòu)酶II抑制 劑例如阿霉素、表柔比星、道諾霉素、依托泊苷和博來霉素。停滯Gl 的那些劑也擴(kuò)溢至S期停滯，例如DNA烷化劑諸如三苯氧胺、潑尼松、達(dá)卡巴溱、雙氯乙基曱胺、順鉑、曱氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。
進(jìn)一步的信息可在The Molecular Basis of Cancer (癌的分子基礎(chǔ))， Mendelsohn和Israel編輯，第1章,Murakami等人題名為"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs (纟田胞周期調(diào)節(jié)、致癌基 因和抗腫瘤藥物)"，(WB Saunders: Philadelphia, 1995),具體地可在第 13頁中找到。
術(shù)語"細(xì)胞因子"是用于由 一種細(xì)胞群釋放的對(duì)其他細(xì)胞起細(xì)胞間 介質(zhì)作用的蛋白質(zhì)的通用術(shù)語。這種細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子、單核 因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素例如人類生長(zhǎng)激素、 N-蛋氨酰人類生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；曱狀腺素；胰島 素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促濾泡素(FSH)、 促曱狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH);表皮生長(zhǎng)因子；肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳素；肺瘤壞死因子a 和卩；米勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子例 如NGF-a;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-ce和TGF-/3; 胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II;紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素 例如干擾素a、p和集落刺激因子(CSF )例如巨噬細(xì)胞-CSF( M-CSF )、 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF (GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF ( G-CSF );白細(xì)胞介 素(IL)例如IL陽1、 IL-l仏IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL畫5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL畫ll、 IL-12;月中瘤壞死因子例如TNF-o;或TNF-)S以及其 他多肽因子包括LIF和kit配基(KL)。如本文所用的，術(shù)語細(xì)胞因子 包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因 子的生物活性等價(jià)物。
如本申請(qǐng)中所用的術(shù)語"前藥"是指藥學(xué)上活性物質(zhì)的前體或衍生 物形式，其與母體藥物相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并且能夠被酶促 地活化或轉(zhuǎn)化成更有活性的母體形式。參見，例如Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy (癌化學(xué)療法中的前藥)，，Sz'ocAem/caZ So"'e(y rra"sac"o/w, 14,第375-382頁，第615期Meeting Belfast (1986)和 Stella等人,"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前藥革巴向藥物遞送的化學(xué)方法)，，，Z)z>ecto/ DWveo^， Borchardt 等人(編輯)，第247-267頁，Humana Press (1985)。本發(fā)明的前藥包括 但不限于含磷酸酯前藥、含硫代,岸酸酯前藥、含硫酸酯前藥、含肽前藥、 D-氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含iS-內(nèi)酰胺前藥、含任選地取代 的苯氧基乙酰胺的前藥或含任選地取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧 啶和其他可轉(zhuǎn)化為更有活性的無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟尿苷前藥。可被 衍生為前藥形式以便用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物的實(shí)例包括但不限于 上文描述過的那些化學(xué)治療劑。
所謂的"放射療法"意指使用定向的7射線或/3射線以產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的 足夠的損害以便限制其正常地起作用的能力或完全毀壞細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解 的是有許多本領(lǐng)域已知的方法來確定治療的劑量和持續(xù)時(shí)間。典型的治 療是作為 一次施用提供的并且典型的劑量從10單位變化至200單位(戈 瑞)每天。
所謂的"減少或抑制"意指導(dǎo)致優(yōu)選地20%或更多，更優(yōu)選地50%或 更多并且最優(yōu)選地75%、 85%、 90%、 95%或更多的總體下降的能力。 減少或抑制可指正被治療的病癥的癥狀、轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移的存在或大小、 原發(fā)腫瘤的大小、休眠肺瘤的存在或大小或者在血管生成病癥中血管的 大小或數(shù)目。
所謂的"反義核堿基寡聚體"意指無論長(zhǎng)度，與基因的編碼鏈或 mRNA的至少一部分互補(bǔ)的核i成基寡聚體。
所謂的"核堿基寡聚體"意指含有通過連接基團(tuán)連在一起的至少八 個(gè)核堿基，優(yōu)選地至少十二個(gè)并且最優(yōu)選地至少十六個(gè)堿基的鏈的化合 物。這一定義中包括天然的和非天然的寡核苷酸(修飾的和未修飾的)， 以及寡核香酸模擬物例如蛋白核酸、鎖定核酸和阿拉伯糖核酸
(arabinonucleic acid )。許多的核石咸基和連接基團(tuán)可被用于本發(fā)明的核 堿基寡聚體，包括通過引用并入本文的美國(guó)專利公開第20030114412號(hào)
(參見例如公布文本的第27-45段)和第20030114407號(hào)(參見例如公 布文本的第35-52段)中描述的那些。核堿基寡聚體還可被靶向至翻譯 起始和終止位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，反義核堿基寡聚體包含從約8至 30個(gè)核苷酸。反義核堿基寡聚體還可包含至少40、 60、 85、 120或更多個(gè)與VEGF mRNA或DNA互補(bǔ)的連續(xù)的核苷酸，并可以與全長(zhǎng) mRNA或基因一樣長(zhǎng)。
所謂的"小RNA"意指長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選地17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34或 35個(gè)核苷酸并且長(zhǎng)度甚至多達(dá)50或100 (包括之間的所有整數(shù))個(gè)核 苷酸的任何RNA分子(單鏈或雙鏈的)。在某些實(shí)施方案中，小RNA 能夠介導(dǎo)RNAi。如本文所用的，詞組"介導(dǎo)RNAi"是指辨別哪個(gè)RNA 將一皮通過RNAi才幾理(machinery)或過程降解的能力。術(shù)語小RNA中 包括"小干擾RNA"和"微小RNA"。通常，微小RNA ( miRNA )是通過 切酶(Dicer)從約70個(gè)核苷酸的發(fā)夾前體RNA加工來的小的(例如17-26 個(gè)核苷酸)、單鏈非編碼的RNA。小干擾RNA (siRNA)具有相似的大 小并且也是非編碼的；但是siRNA是從長(zhǎng)的dsRNA加工來的并且通常 是雙鏈的。siRNA還可包括短的發(fā)夾RNA ，其中siRNA雙鏈體的兩條 鏈都包含于單一的RNA分子中。小RNA可被用于描述兩種類型的 RNA。這些術(shù)語包括雙《連RNA、單鏈RNA、分離的RNA(部分純化的 RNA、本質(zhì)上純的RNA、合成RNA、重組產(chǎn)生的RNA)以及通過添加、 缺失、耳又代和/或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸而與天然存在的RNA不同的改 變的RNA。這種改變可包括添加非核苷酸物質(zhì)，例如在小RNA的末端 或內(nèi)部(在RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸處)。本發(fā)明的RNA分子中的核 香酸還可包括非標(biāo)準(zhǔn)的核香酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核 苷酸。對(duì)核酸分子的其它修飾參見上文的"核堿基寡聚體"。在一個(gè)實(shí)施 方案中，RNA分子包含3'羥基基團(tuán)。
術(shù)語"靜脈內(nèi)輸注"是指在大于約5分鐘，優(yōu)選地在約30至90分鐘 之間的 一段時(shí)間內(nèi)將藥物引入動(dòng)物或人類患者的靜脈中，但是依照本發(fā) 明，可選擇地將靜脈內(nèi)輸注施用10小時(shí)或更短。
術(shù)語"靜脈內(nèi)團(tuán)注"或"靜脈內(nèi)推注"是指將藥物施用于動(dòng)物或人類 的靜脈中以便身體在約15分鐘或更短，優(yōu)選地5分鐘或更短的時(shí)間內(nèi) 接受藥物。
術(shù)語"皮下施用"是指通過從藥物貯器相對(duì)緩慢地持續(xù)地遞送而將 藥物引入動(dòng)物或人類患者的皮膚下，優(yōu)選地在皮膚和下面的組織之間的嚢(pocket)中?？赏ㄟ^向上捏或拉起皮膚并離開下面的組織來產(chǎn)生嚢。
術(shù)語"皮下輸注"是指通過從藥物貯器相對(duì)緩慢地持續(xù)地遞送一段
時(shí)間，包括但不限于30分鐘或更短，或者90分鐘或更短，而將藥物引 入動(dòng)物或人類患者的皮膚下，優(yōu)選地在皮膚和下面的組織之間的嚢中。 任選地，可通過在動(dòng)物或人類患者的皮膚下植入的藥物遞送泵的皮下才直 入來進(jìn)行輸注，其中泵在預(yù)定的時(shí)間段例如30分鐘、90分鐘或跨越治 療方案的長(zhǎng)度的時(shí)間段內(nèi)遞送預(yù)定量的藥物。
術(shù)語"皮下團(tuán)注"是指在動(dòng)物或人類患者的皮膚下方施用藥物，其中 團(tuán)注藥物遞送優(yōu)選少于約15分鐘，更優(yōu)選少于5分鐘并且最優(yōu)選少于 60秒。優(yōu)選地在皮月夫和下面的組織之間的嚢中施用，其中通過例如向 上捏或拉起皮膚并離開下面的組織來產(chǎn)生嚢。
詞語"標(biāo)記"在本文使用時(shí)是指直接或間接地與多肽軛合的可4企測(cè) 的化合物或組合物。標(biāo)記可是本身可被檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記 或熒光標(biāo)記)，或者在酶標(biāo)記的情況下，可催化可^皮檢測(cè)的底物化合物 或組合物的化學(xué)變化。
II.使用VEGF特異性拮抗劑進(jìn)行早期肺瘤治療以及新輔助療法和輔助 療法
本發(fā)明以使用VEGF特異性拮抗劑治療患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn) 移性的腫瘤的受治療者；治療患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者；或者 治療患有發(fā)展中的癌的受治療者或治療具有發(fā)展癌的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者 為特征。例如，4吏用兩種獨(dú)立的方法抑制VEGF,即使用靶向VEGF-A 的單克隆抗體(mAb)的單一療法和VEGF-A的遺傳缺失， -使用早期腸 腺瘤形成的Apc"^+小鼠模型我們已經(jīng)證明了， VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制 足以停止腫瘤生長(zhǎng)并且在腸腺瘤模型中提供了長(zhǎng)期的生存益處。使用靶 向VEGF-A的單克隆抗體(mAb),我們也已經(jīng)i正明了， VEGF-A的抑 制足以在1型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MEN1)的小鼠模型中抑制垂體腺瘤的 生長(zhǎng)并降低過量的激素分泌。而且，使用小鼠胰島腫瘤模型(RIP-T/3Ag) 和耙向VEGF-A的單克隆抗體(mAb )，我們已經(jīng)證明了 VEGF的抑制 導(dǎo)致肺瘤血管生成顯著減少，并且當(dāng)被用作使用手術(shù)或化學(xué)治療劑的細(xì)
44胞減少后的療法時(shí)，阻止了腫瘤的再生長(zhǎng)。本發(fā)明還以在新輔助療法和
輔助情況中VEGF拮抗劑的使用為特征。
III. VEGF特異性拮抗劑
VEGF特異性拮抗劑是指能夠與VEGF結(jié)合，減小VEGF表達(dá)水平， 或中和、阻斷、抑制、取消、減小或干擾VEGF生物活性(包括VEGF 與一種或多種VEGF受體結(jié)合和VEGF介導(dǎo)的血管生成以及內(nèi)皮細(xì)胞存 活或增殖)的分子(肽或非肽的)。優(yōu)選地，VEGF特異性拮抗劑減小 或抑制至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或 更多的VEGF的表達(dá)水平或生物活性。優(yōu)選地，通過VEGF特異性拮抗 劑抑制的VEGF是VEGF同種型或多種VEGF同種型，例如 VEGF(8-109)、 VEGF(1-109)、 VEGF165、 VEGF121、 VEGF145、 VEGF189 或VEGF206。
在本發(fā)明的方法中有用的VEGF特異性拮抗劑包括特異性結(jié)合 VEGF的肽或非肽的化合物，例如抗VEGF抗體和其抗原結(jié)合片4殳，與 VEGF特異性結(jié)合的VEGF多肽的拮抗劑變體或其片段，以及與VEGF 特異性結(jié)合由此隔絕其與一種或多種受體結(jié)合的受體分子和衍生物(例 如可溶的VEGF受體蛋白或其VEGF結(jié)合片段，或嵌合的VEGF受體 蛋白)，融合蛋白(例如VEGF-Trap (Regeneron))和VEGF^-白樹毒素 (Peregrine)。 VEGF特異性拮抗劑還包括與編碼VEGF多肽的核酸分子 的至少一個(gè)片段互補(bǔ)的反義核堿基寡聚體；與編碼VEGF多肽的核酸分 子的至少一個(gè)片段互補(bǔ)的小RNA;靶向VEGF的核酶；VEGF的肽體； 以及VEGF適體。
A在Map我舉
在本發(fā)明的方法中有用的抗VEGF抗體包括以足夠的親和力和特
原結(jié)合片段?？筕EGF抗體通常不會(huì)與其他的VEGF同源物例如 VEGF-B或VEGF-C結(jié)合，也不與其它生長(zhǎng)因子例如P1GF、 PDGF或 bFGF結(jié)合。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗VEGF抗體包括但不限于，與通過雜交瘤ATCC HB 10709生產(chǎn)的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1相同的表位 結(jié)合的單克隆抗體；依照Presta等人(1997) Cancer Res. 57:4593-4599產(chǎn) 生的重組的人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于被稱為貝伐單抗 (BV; Avastin )的抗體。貝伐單抗包括突變的人類IgGl框架區(qū)和來 自阻斷人類VEGF與其受體結(jié)合的鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗 原結(jié)合互補(bǔ)性決定區(qū)。貝伐單抗的約93%的氨基酸序列(包括大部分的 框架區(qū))衍生自人類IgGl,而約7。/。的序列衍生自鼠抗體A.4.6丄貝伐 單抗具有約149,000道爾頓的分子量并且是糖基化的。貝伐單抗和其他 人源化抗VEGF抗體被進(jìn)一步描述于2005年2月26日發(fā)布的美國(guó)專利 第6，884，879號(hào)中?？贵w的更多的實(shí)例包括但不限于如PCT申請(qǐng)7>開第 WO2005/012359號(hào)中描述的G6或B20系列抗體(例如G6-31 ， B20-4.1 )。 更多的抗體參見美國(guó)專利第7,060,269、 6,582,959、 6,703,020號(hào)；第 6,342,219號(hào)；第6,054,297號(hào)；W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1;美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006009360、 20050186208、 20030206899、 20030190317、 20030203409和20050112126號(hào)；以及 Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)?？?在本發(fā)明中4吏用的抗體的其他實(shí)例包括與包含殘基F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 191、 KlOl、 E103和C104的或可選擇地包含殘基F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 183和Q89的人類VEGF上的功能表位結(jié)合的 那些抗體。
依照本發(fā)明的G6系列抗體是一種抗VEGF抗體，其書于生自依照 PCT申請(qǐng)/>開第WO2005/012359號(hào)的圖7、 24-26和34-35中任何一個(gè) 的G6抗體或G6衍生抗體的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，G6系列抗體與 包含殘基F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 183和Q89的人類VEGF上的
功能表位結(jié)合。
依照本發(fā)明的B20系列抗體是一種抗VEGF抗體，其衍生自依照 PCT申請(qǐng)公開第WO2005/012359號(hào)的圖27-29中任何一個(gè)的B20抗體 或B20衍生抗體的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，B20系列抗體與包含殘基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 191、 KlOl、 E103和C104的人類 VEGF上的功能表位結(jié)合。
46依照本發(fā)明"功能表位"是指對(duì)抗體結(jié)合起積極作用的抗原的氨基 酸殘基。抗原中起積極作用的殘基中任何一個(gè)的突變(例如，野生型 VEGF的丙氨酸突變或同系物突變)將擾亂抗體的結(jié)合以致抗體的相對(duì)
親和力比率(IC50突變型VEGF/IC50野生型VEGF)將大于5 (參見 WO2005/012359的實(shí)施例2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過;容液結(jié)合噬菌 體展示ELISA確定相對(duì)親和力比率。簡(jiǎn)單的說，將96孑L Maxisorp免疫 板(NUNC)于4。C用待測(cè)抗體的Fab形式以溶于PBS中2 ug/ml的濃度包 被過夜，并用PBS、 0.5。/。BSA和0.05%吐溫20 ( PBT )于室溫封閉2h。 將噬菌體展示hVEGF丙氨酸點(diǎn)突變體(殘基8-109形式)或野生型 hVEGF( 8-109)于PBT中的系列稀釋液首先在Fab包被的4反上于室溫孵 育15分鐘并將板用PBS、 0.05%吐溫20 ( PBST)清洗。用在PBT中1: 5000稀釋的抗M13單克隆抗體辣根過氧化物酶(Amersham Pharmacia ) 軛合物檢測(cè)結(jié)合的噬菌體，用3,3'，5,5'-四曱基聯(lián)苯胺(TMB, Kirkegaard & Perry Labs， Gaithersburg, MD)底物顯色約5分鐘，用1.0 M的H3P04淬 滅反應(yīng)并在450 nm用分光光度法讀數(shù)。IC50值的比率 (IC50,ala/IC50,wt)代表結(jié)合親和力(相對(duì)結(jié)合親和力)減小的倍數(shù)。 S. 憂伴為、子
兩種最完全表征的VEGF受體是VEGFR1(也稱為Flt-l)和VEGFR2 (也稱為KDR和鼠科同系物的FLK-1 )。每個(gè)受體對(duì)每個(gè)VEGF家族成 員的特異性不同但VEGF-A與Flt-l和KDR都結(jié)合。全長(zhǎng)Flt-l受體包 括具有七個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有酪氨酸激酶活 性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域涉及VEGF的結(jié)合而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域涉及信號(hào) 傳導(dǎo)。
與VEGF特異性結(jié)合的VEGF受體分子或其片段可被用于本發(fā)明的 方法中以結(jié)合VEGF蛋白并使VEGF蛋白掩蔽，由此使其不能進(jìn)行信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，VEGF受體分子或其VEGF結(jié)合片段是可溶 的形式例如Flt-l。受體的可^^形式通過與VEGF結(jié)合而對(duì)VEGF蛋白 的生物活性施加抑制性作用，由此使其不能與存在于目標(biāo)細(xì)胞表面上的 其天然受體結(jié)合。還包括VEGF受體融合蛋白，其實(shí)例描述于下文。
嵌合VEGF受體蛋白是具有衍生自至少兩種不同蛋白質(zhì)(其中至少一種是VEGF受體蛋白(例如flt-l或KDR受體))的氨基酸序列的能 夠與VEGF結(jié)合并抑制VEGF生物活性的受體分子。在某些實(shí)施方案中， 本發(fā)明的嵌合VEGF受體蛋白由衍生自僅兩種不同的VEGF受體分子的 氨基酸序列構(gòu)成；但是可將包含來自flt-l和/或KDR受體胞外配體結(jié)合 區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或所有七個(gè)的Ig樣結(jié)構(gòu)&戈 的氨基酸序列與來自其他無關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如免疫球蛋白序 列)連接。與Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的其他氨基酸序列對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說是明顯的。嵌合VEGF受體蛋白的實(shí)例包括例如可i^的Flt-1/Fc、 KDR7Fc或FLt-l/KDR/Fc (也被稱為VEGF Trap )(參見，例如PCT申 請(qǐng)公開第W097/44453號(hào))。
本發(fā)明的可溶的VEGF受體蛋白或嵌合VEGF受體蛋白包括未經(jīng)由 跨膜結(jié)構(gòu)域而固定在細(xì)胞表面的VEGF受體蛋白。像這樣，VEGF受體 的可溶形式，包括嵌合受體蛋白，盡管能夠與VEGF結(jié)合并使VEGF 失活，但并不包含跨膜結(jié)構(gòu)域并因此通常不會(huì)變得與表達(dá)分子的細(xì)胞的 細(xì)胞膜有關(guān)聯(lián)。
C. *齊
核酶是能夠催化RNA的特異性切割的酶RNA分子。核酶通過對(duì)互 補(bǔ)的目標(biāo)RNA進(jìn)行序列特異性雜交，之后進(jìn)行核酸內(nèi)切而起作用?？?通過已知的技術(shù)識(shí)別可能的RNA目標(biāo)中的特異性核酶切割位點(diǎn)。進(jìn)一 步的細(xì)節(jié)參見，例如Rossi, C匿"f腸/ogy, 4:469-471(1994)和PCT 申請(qǐng)公開第WO 97/33551號(hào)。以VEGF表達(dá)為目標(biāo)的一種示例性核酶 是Angiozyme (參見，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20060035278號(hào))。
A這謬
適體是形成與目標(biāo)分子例如VEGF多肽特異性結(jié)合的三級(jí)結(jié)構(gòu)的 核酸分子。適體的產(chǎn)生和治療使用在本領(lǐng)域中已廣泛建立。參見例如美 國(guó)專利第5,475,096號(hào)。VEGF適體是聚乙二醇化修飾的寡核苷酸，其 采用使其能夠與胞外VEGF結(jié)合的三維構(gòu)象。治療上有效的以VEGF 為目標(biāo)來治療年齡相關(guān)的黃斑變性的適體的 一 個(gè)實(shí)例是哌加4也尼 (pegaptanib ) (MacugenTM, Eyetech， New York)。關(guān)于適體的更多的4言息 可在美國(guó)專利申諱^^開第20060148748中找到。
48欣#
肽體是與編碼免疫球蛋白分子的 一 個(gè)片段或 一部分的氨基酸序列 相連接的肽序列。多肽可衍生自隨機(jī)的序列，其通過用于特異性結(jié)合的 任何方法(包括但不限于噬菌體展示技術(shù))來選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所選擇的多肽可被連接于編碼免疫球蛋白Fc部分的氨基酸序列。與
VEGF特異性結(jié)合并拮抗VEGF的肽體在本發(fā)明的方法中也是有用的。 E #^#^#我##"^為、子
本發(fā)明的方法還以VEGF特異性拮抗性核酸分子(包括反義核堿基 寡聚體和小RNA)的使用為特征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明以針對(duì)VEGF RNA的反義核堿基寡聚 體的使用為特征。通過與互補(bǔ)核酸序列(有義或編碼鏈)結(jié)合，反義核 堿基寡聚體能夠大概通過經(jīng)由RNA酶H的RNA鏈的酶切割抑制蛋白 質(zhì)表達(dá)。
在本發(fā)明的方法和組合物中尤其有用的反義核堿基寡聚體的 一個(gè) 實(shí)例是嗎啉代寡聚體。嗎啉代物質(zhì)(morpholinos)被用于阻斷其他分子 對(duì)核酸分子中特異性序列的接近。它們可阻斷其他分子對(duì)核糖核酸 (RNA)的小(~25堿基)區(qū)域的接近。嗎啉代物質(zhì)有時(shí)被稱作PMO， 石粦酰二胺嗎啉^寡一亥香酉臾(phosphorodiamidate morpholino oligo )的首 字母縮寫。
嗎啉代物質(zhì)^L用于通過阻止細(xì)胞制造目標(biāo)蛋白質(zhì)或通過》f飾 mRNA前體的剪接而敲低基因功能。嗎啉代物質(zhì)是通過標(biāo)準(zhǔn)的核酸堿基 配對(duì)與RNA的互補(bǔ)序列結(jié)合的合成分子。盡管嗎啉代物質(zhì)具有標(biāo)準(zhǔn)的 核酸堿基，但那些堿基是與嗎啉環(huán)而不是脫氧核糖環(huán)結(jié)合的并通過磷酰 二胺基團(tuán)而不是磷酸鹽連接。用無電荷的磷酰二胺基團(tuán)取代陰離子的磷 酸鹽消除了在通常生理pH范圍內(nèi)的離子化，因此，有才幾體或細(xì)^^中的 嗎啉代物質(zhì)是無電荷分子。
嗎啉代物質(zhì)通過"空間阻斷"或與RNA中的目標(biāo)序列結(jié)合并阻斷可 與RNA以其他方式相互作用的分子來起作用。由于嗎啉代物質(zhì)的完全 非天然的骨架，細(xì)胞蛋白質(zhì)無法識(shí)別嗎啉代物質(zhì)。核酸酶不降解嗎畔木代 物質(zhì)而嗎啉代物質(zhì)不會(huì)活化toll樣受體并且因此它們不會(huì)活化固有的免疫響應(yīng)例如干擾素系統(tǒng)或NF-KB介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。還未知嗎啉代物質(zhì)
修飾DNA的曱基化。因此，針對(duì)VEGF的任何部分的可減少或抑制
中是尤其有用的。
本發(fā)明還以使用RNA干擾(RNAi)抑制VEGF的表達(dá)為特4正。 RNAi是通過引入雙鏈RNA( dsRNA)而起始的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的形式。 短的15至32個(gè)核香酸的雙鏈RNA (通常被稱為"siRNA"、"小RNA" 或"微小RNA")在線蟲(Zamor等人，Ce〃 101 : 25-33 )和哺乳動(dòng)物組 織培養(yǎng)細(xì)胞系(Elbashir等人，Mm/M 411 :494-498， 2001,據(jù)此通過引 用并入)中在下調(diào)基因表達(dá)方面有效。在哺乳動(dòng)物中這一方法的進(jìn)一步 的治療效力由McCaffrey等人(A^/wre 418:38-39. 2002 )在體內(nèi)證實(shí)。 小RNA在長(zhǎng)度上至少是15個(gè)核苷酸，優(yōu)選地17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35個(gè)才亥苦 酸，并且甚至在長(zhǎng)度上多達(dá)50或100 (包括之間的所有整數(shù))個(gè)核苷 酸。這種與VEGF的任何區(qū)域基本上一致或互補(bǔ)的小RNA被包括為本 發(fā)明的VEGF特異性拮抗劑。
小RNA的特殊要求和修飾是本領(lǐng)域已知的并被描述于例如PCT申 請(qǐng)公開第 WO01/75164號(hào)和美國(guó)申請(qǐng)公開第20060134787 、 20050153918、 20050058982、 20050037988和20040203145號(hào)中，其相 關(guān)的部分通過引用并入本文。在特定的實(shí)施方案中，可合成siRNA或 通過例如在酶切酶存在的情況下在dsRNA被加工為約17至約26個(gè)核 苦酸的RNA分子的條件下加工較長(zhǎng)的雙鏈RNA而產(chǎn)生siRNA。還可 通過相應(yīng)的DNA片段(例如發(fā)夾DNA構(gòu)建體)的表達(dá)產(chǎn)生siRNA。 通常，siRNA具有特有的2-至3-核苷酸的3，懸垂末端，優(yōu)選地這些是 (2，-脫氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常含有3'羥基基團(tuán)。在某些實(shí)施 方案中，使用單鏈siRNA或平端dsRNA。為了進(jìn)一步加強(qiáng)RNA的穩(wěn)定 性，使3，懸垂對(duì)降解穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過含有嘌呤核苷酸例 如腺苷或鳥苷使RNA穩(wěn)定?？蛇x擇地，通過修飾的類似物取代嘧啶核 苷酸，例如通過(2，-脫氧)胸苷(thymide)取代尿苷2-核苷酸懸垂是 可耐受的并且不影響RNAi的效力。2，羥基基團(tuán)的缺乏顯著增強(qiáng)了組織培養(yǎng)基中懸垂的核酸酶抵抗力。
可通過包括化學(xué)合成或使用果蠅體外系統(tǒng)的重組生產(chǎn)的多種方案
獲4尋siRNA分子?？蓙V人公司移'H口 Dharmacon Research Inc.或Xeragon Inc. 商業(yè)地獲得它們或者可使用商業(yè)上可得的試劑盒例如來自Ambion的 &7e"cwTM siRNA構(gòu)建試劑盒(目錄編號(hào)1620)或來自New England BioLabs的HiScribeTM RNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒(目錄編號(hào)E2000S)合成它們。
可選4奪地，可使用RNA體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)程序和dsRNA退火程序來 制備siRNA,所述程序例如Elbashir等人(Ge"&s & Dev. 15: 188-200, 2001), Girard等人(A^wre 442: 199-202 (2006))， Aravin等人(Mz似re 442: 203-207 (2006)), Grivna等人(Ge"&s Dev. 20: 1709-1714 (2006)》和Lau 等人(Sck"ce 313: 363-367 (2006))中描述的那些。
如Yu等人(尸rac. A^//.C/&4， 99: 6047-6052, 2002)或 Paddison等人(Ge"^ & Dev, 16: 948-958， 2002)中描述的短發(fā)夾RNA (shRNA),還可用于本發(fā)明的方法。設(shè)計(jì)shRNA以便將有義和反義鏈 包含于一個(gè)RNA分子中并通過核苷酸(3個(gè)或更多)環(huán)連接。可^f吏用 如前文和Yu等人如上中所描述的標(biāo)準(zhǔn)體外T7轉(zhuǎn)錄合成來合成并純化 shRNA。還可將shRNA亞克隆進(jìn)具有小鼠U6啟動(dòng)子序列的之后可被轉(zhuǎn) 染進(jìn)細(xì)胞中并用于shRNA的體內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體中。
可獲得用于將dsRNA轉(zhuǎn)染或引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的多種方法。例 如，有若干商業(yè)上可獲得的對(duì)siRNA的基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染有用的轉(zhuǎn)染試 劑，包括但不限于TransIT-TKOTM (Minis,目錄號(hào)MIR 2150)、 TransmessengerTM (Qiagen, 目錄號(hào) 301525) 、 01igofectamineTM和 Lipofectamine (Invitrogen,目錄號(hào) MIR 12252-011 和目錄號(hào) 13778-075)、 siPORT (Ambion,目錄號(hào)1631)、 DharmaFECT (Fisher Scientific,目錄號(hào)T-2001-01)。還可商業(yè)獲得用于基于電穿孔的siRNA 轉(zhuǎn)染的方法的試劑，例如siPORTer (Ambion Inc.目錄號(hào)1629)。還可 使用顯微注射技術(shù)。還可從被引入細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄小RNA,其 中表達(dá)構(gòu)建體包括用于轉(zhuǎn)錄可操作地與 一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列連接 的小RNA的編碼序列。當(dāng)需要時(shí)，質(zhì)粒、載體或病毒載體還可纟皮用于 遞送dsRNA或siRNA并且這種載體是本領(lǐng)域已知的。每種轉(zhuǎn)染試劑的方案可從制造商獲得。
IV.治療〗吏用
盡管已知關(guān)于VEGF在血管生成中的作用的大量信息，但關(guān)于 VEGF在良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌中或在輔助或新輔助情況中的 作用相對(duì)地所知甚少。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF特異性拮抗劑可被用于治療 良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌；用于治療休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移；用于預(yù) 防腫瘤復(fù)發(fā)或再生長(zhǎng)；或用于在處于發(fā)展癌的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中治療或
轉(zhuǎn)移性癌的受治療者的輔助療法；或用于治療患有可手術(shù)的癌的受治療 者的新輔助療法，其中在手術(shù)去除受治療者中可手術(shù)的癌之前提供所述 療法。盡管下文中治療應(yīng)用一皮分為療法、預(yù)防、新輔助療法和輔助療法，
A y^9f的分類
術(shù)語癌包含增殖病癥的集合，包括但不限于癌前的生長(zhǎng)、良性腫瘤、 惡性腫瘤和休眠胂瘤。良性腫瘤保持局限于起始的部位并且不具有向遠(yuǎn) 處部位浸潤(rùn)、侵入或轉(zhuǎn)移的能力。惡性肺瘤會(huì)侵入并損害它們周圍的其 他組織。它們還可獲得從起初的部位脫離并通常通過血流或通過'淋巴結(jié) 所在的淋巴系統(tǒng)向身體的其他部分?jǐn)U散(轉(zhuǎn)移)的能力。休眠腫瘤是靜 止的腫瘤，其中腫瘤細(xì)胞存在但腫瘤發(fā)展不是臨床上明顯的。
將原發(fā)腫瘤按其發(fā)生的組織類型分類；將轉(zhuǎn)移性的腫瘤按癌細(xì)胞來 自于的組織類型分類。久而久之，惡性腫瘤的細(xì)胞變得更加不正常并顯 得更不像正常細(xì)胞。癌細(xì)胞外觀上的這一變化被稱為腫瘤分級(jí)，并且癌 細(xì)胞被描述為良好分化的(低級(jí)別)、中度分化的、低分化的或未分化 的(高級(jí)別)。良好分化的細(xì)胞表現(xiàn)相當(dāng)正常并且類似于它們起源于的 正常細(xì)胞。未分化的細(xì)胞是已經(jīng)變得如此不正常以致不可能再確定細(xì)月包 的來源的細(xì)胞。
癌分期系統(tǒng)描述了在解剖學(xué)上癌已經(jīng)擴(kuò)散了多遠(yuǎn)并嘗試將具有相 似預(yù)后和治療的患者放入同樣的分期組?？蛇M(jìn)行幾個(gè)檢驗(yàn)以幫助將癌分 期，包括活組織檢查和某些成像檢驗(yàn)例如胸部X射線、乳房X線照片、骨掃描、CT掃描和MRI掃描。血液檢驗(yàn)和臨床評(píng)估也被用來評(píng)估患者 的總體健康并檢測(cè)癌是否已經(jīng)擴(kuò)散至某些器官。
為4奪癌分期，American Joint Committee on Cancer (美國(guó)癌癥耳關(guān)合 委員會(huì))使用TNM分類系統(tǒng)首次將癌，尤其是實(shí)體瘤，以字母類別形 式分類。將癌標(biāo)明字母T (腫瘤大小)、N (可觸診的結(jié)節(jié))和/或M (轉(zhuǎn) 移)。Tl、 T2、 T3和T4描述原發(fā)病變的不斷增加的大小；N0、 Nl、 N2、 N3指明漸進(jìn)的晚期結(jié)節(jié)的復(fù)雜情況；以及MO和Ml反映了遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移的不存在或存在。
在第二種分期方法，也被稱為總體時(shí)期分組或羅馬數(shù)字分期法中， 結(jié)合原發(fā)病變的大小以及結(jié)節(jié)擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在，將癌分為O至IV 期。在這一系統(tǒng)中，病例-故分為由羅馬ll字I至IV表示的四個(gè)時(shí)期， 或被分類為"復(fù)發(fā)"。對(duì)于某些癌，O期被稱作"原位"或"Tis"，例如乳腺 癌的導(dǎo)管原位癌或小葉原位癌。高級(jí)別腺瘤也可纟皮分類為0期。通常I 期癌是小的局部的通常可治愈的癌，而IV期癌通常代表不可手術(shù)的或 轉(zhuǎn)移性的癌。II和III期癌通常是局部晚期的和/或表現(xiàn)出局部淋巴結(jié)的 參與。通常，較高分期數(shù)字表示更廣泛的疾病，包括較大的腫瘤大小和 /或癌向附近的淋巴結(jié)和/或原發(fā)腫瘤的相鄰器官的擴(kuò)散。這些時(shí)期被精 確地定義，但定義對(duì)于每種癌來說是不同的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的。
許多癌檔案(registry), 例如NCI的Surveillance, Epidemiology, and End Results Program (監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)和最終結(jié)果項(xiàng)目)(SEER)使用了 總結(jié)分期。這一系統(tǒng)被用于所有類型的癌。它將癌病例分為五個(gè)主要的 類別
^位的是早期癌，其僅存在于其開始的細(xì)胞層。 肩部的是限于其開始的器官，沒有擴(kuò)散跡象的癌。 且誠(chéng)的是已經(jīng)超出初始的(原發(fā))部位向鄰近的淋巴結(jié)或器官和組 織擴(kuò)散的癌。
遠(yuǎn)處的是已經(jīng)從原發(fā)部位向遠(yuǎn)處器官或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)擴(kuò)散的癌。
^乂p的被用來描述沒有足夠的信息以表明時(shí)期的病例。
此外，對(duì)于癌來說在已經(jīng)去除原發(fā)腫瘤后幾個(gè)月或幾年復(fù)發(fā)是常見的。在所有可見的腫瘤已經(jīng)被根除后重現(xiàn)的癌被稱為復(fù)發(fā)疾病。在原發(fā) 腫瘤的區(qū)域中重現(xiàn)的疾病是原處復(fù)發(fā)，而作為轉(zhuǎn)移重現(xiàn)的疾病被稱為遠(yuǎn) 處復(fù)發(fā)。休眠腫瘤是以存在腫瘤細(xì)胞但腫瘤發(fā)展不是臨床上明顯的靜止 狀態(tài)存在的肺瘤。微轉(zhuǎn)移是已經(jīng)從原發(fā)肺瘤向身體其他部分?jǐn)U散的小轉(zhuǎn) 移或許多細(xì)胞。在篩查或診斷試驗(yàn)中微轉(zhuǎn)移可或不可被檢測(cè)。本發(fā)明的 方法對(duì)預(yù)防休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的發(fā)生或者腫瘤的復(fù)發(fā)是有用的，例如在 〃f木眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移存在但可或不可被臨床檢測(cè)的情況下。
本發(fā)明的方法還對(duì)早期癌的治療是有用的，包括但不限于良性的、
癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤。這包括任何O、 I或II期的肺瘤；任何非轉(zhuǎn) 移性的II期腫瘤；任何通常先于癌或發(fā)展為癌的疾患，包括但不限于 發(fā)育異常；以及任何保持局限于起始的部位并且沒有向遠(yuǎn)處部位浸潤(rùn)、 侵入或轉(zhuǎn)移的腫瘤。良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的實(shí)例包括息肉、 腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰島素瘤、軟骨瘤、骨瘤、血管瘤、 淋巴管瘤、腦脊膜瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤、聽神 經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、膽管嚢腺瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、 沙眼、肉芽瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、移行細(xì)胞乳頭狀瘤、唾液腺的多形性腺瘤、硬 纖維瘤、皮樣嚢乳頭狀瘤、嚢腺瘤、局灶性結(jié)節(jié)狀增生和結(jié)節(jié)狀再生性 增生。
由于在原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中都涉及血管生成，因此本發(fā)明提供的 抗血管生成治療能夠抑制腫瘤在原發(fā)部位的腫瘤性生長(zhǎng)以及預(yù)防腫瘤 在繼發(fā)部位的轉(zhuǎn)移，由此允許通過其他治療劑攻擊腫瘤。本文有待治療 的癌的實(shí)例包括實(shí)體和非實(shí)體或軟組織的腫瘤。實(shí)例包括^f旦不限于癌、 淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這種癌的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì) 胞癌；肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌)； 腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃(gastric)或胃(stomach)癌(包括胃腸癌)； 胰腺癌；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer);膀 胱癌；肝細(xì)胞瘤；乳腺癌；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜或子宮癌、 唾液月泉癌；腎(kidney)或腎(renal)癌；肝癌(liver cancer);前列A良 癌；外陰癌；曱狀腺癌；肝癌(hepatic carcinoma);和不同類型的頭頸 癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)別/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL;中等級(jí)別/濾泡性NHL;中等級(jí)別彌漫性NHL; 高級(jí)別免疫母細(xì)胞性NHL;高級(jí)別淋巴母細(xì)胞性NHL;高級(jí)別小無核 裂細(xì)胞性NHL;肺塊性疾病NHL;套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS相關(guān)的淋巴瘤； 以及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL);急 性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL);毛細(xì)胞性白血?。宦栽剂＜?xì)胞性 白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及與母斑細(xì)胞病、水腫(例 如與腦瘤相關(guān)的)和梅格斯綜合征相關(guān)的非正常血管增生。更具體地， 可通過本發(fā)明的VEGF特異性拮抗劑治療的癌包括乳腺癌、結(jié)腸直腸 癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腎細(xì)胞癌、前 列腺癌；肝癌；胰腺癌；軟組織肉瘤，卡波西肉瘤、類癌、頭頸癌、腦 瘤、神經(jīng)月交質(zhì)瘤(例如間變性星形細(xì)il包瘤、間變性少突星形細(xì)胞瘤、間 變性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、黑素瘤、卵巢癌、間皮 瘤和多發(fā)性骨髓瘤。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法被用于治療人類患者中的 結(jié)腸直腸癌。
在 一 個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法用于治療被稱為腺瘤的良性上 皮細(xì)胞腫瘤。腺瘤是具有腺性起源的良性腫瘤。腺瘤通常起源于用于分 泌的上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞遍布身體但4義僅是一部分這種細(xì)月包用于分泌。 被用于分泌的上皮細(xì)胞構(gòu)成了被稱為腺的身體特殊部分。腺承擔(dān)形成身 體中許多物質(zhì)的職責(zé)，所述物質(zhì)包括^旦不限于汗、唾液、母乳、黏液和 激素。腺瘤可從身體中大多數(shù)腺的細(xì)胞形成。
腺瘤可以與惡性或癌性腫瘤相似的方式形成。腺瘤是良性的并因此 不會(huì)向其他器官或組織轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散。盡管大多數(shù)腺瘤保持良性，但一些 腺瘤可發(fā)展為惡性腫瘤，并且如果其發(fā)生，新的惡性腺瘤被稱為腺癌。 例如，結(jié)腸和直腸癌開始時(shí)可作為腺瘤或息肉但后來發(fā)展為腺癌；i氣 管腺瘤可發(fā)展為肺癌。
常常，腺瘤對(duì)它們發(fā)展于其中的器官或腺組織具有顯著影響。腺瘤 經(jīng)常分泌過量水平的激素。當(dāng)這發(fā)生時(shí)，對(duì)于受到影響的個(gè)體來說該作 用可能是相當(dāng)不舒服的。在有些情況，這種作用可為致命的。然而，有 些腺瘤發(fā)展而沒有任何可證實(shí)的作用。有某些類型的腺瘤在女性中更加常見，例如肝的腺瘤。其他的例如 結(jié)腸腺瘤是在高齡例如超過五十歲的成人中最常見的。此外，有使患者 容易發(fā)展腺瘤的因素。例如，使用口服避孕藥的女性可能具有增加的發(fā) 展肝腺瘤的風(fēng)險(xiǎn)。某些類型的腺瘤，例如結(jié)腸腺瘤，可能是可遺傳的。
與腺瘤相關(guān)的癥狀變化很大。例如，稱作纖維腺瘤的乳腺腺瘤，通 常不產(chǎn)生癥狀并且可以很小以致受影響的個(gè)體不能發(fā)覺它。但是其他的 乳腺腺瘤可大到足以通過觸摸而注意到。相比之下，肺腺瘤可產(chǎn)生發(fā)熱、
寒戰(zhàn)、呼吸短促和咳血(bloody cough )。
使用多種技術(shù)診斷腺瘤，包括采集血液和尿樣品、超聲成像、計(jì)算 機(jī)斷層(CT)掃描和磁共振成像(MRI)。活體組織檢查通常被用于確 定腫瘤是良性的還是惡性的。本發(fā)明的方法對(duì)于腺瘤的治療、腺瘤復(fù)發(fā) 的治療或預(yù)防(例如在具有休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或者對(duì)于 具有與腺瘤有關(guān)的任何危險(xiǎn)因素的受治療者中腺瘤的預(yù)防尤其有用。
C. f浙;#
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于良性的、癌前的、非轉(zhuǎn) 移性的或休眠的胃腸腫瘤或來自胃腸腫瘤的微轉(zhuǎn)移的治療。這包括任何 0、 I或II期肺瘤；通常先于胃腸癌或發(fā)展為胃腸癌的任何腫瘤或疾患； 以及保持局限于起始的部位并且沒有向遠(yuǎn)處部位浸潤(rùn)、侵入或轉(zhuǎn)移的任 何胃腸腫瘤。胃腸腫瘤中包括消化系統(tǒng)尤其是食管、胃、肝、膽道(膽 嚢、膽管、肝胰管壺腹(ampulla of vater))、腸、胰腺、結(jié)腸、直腸和 肛門的任何息肉、腺瘤、肺瘤或癌。這些在以下詳述。
(%) WW
肛門癌是肛管或痔環(huán)的惡性腫瘤。肛門癌經(jīng)常開始為肛門發(fā)育異 常。肛門發(fā)育異常由具有不正常變化，但沒有顯示出向周圍組織侵入的 跡象的肛門細(xì)胞構(gòu)成。肛門發(fā)育異常的最嚴(yán)重的形式被稱為原位癌，其 中細(xì)胞的表現(xiàn)像癌細(xì)胞，但沒有侵入到正常細(xì)胞所在的一邊。隨時(shí)間過 去，肛門發(fā)育異常最終變化至細(xì)胞變成擴(kuò)散性并獲得轉(zhuǎn)移或脫離身體其 他部分的能力的點(diǎn)。肛門發(fā)育異常有時(shí)被稱為肛門上皮內(nèi)瘤樣病變 (AIN)。當(dāng)肛門癌開始擴(kuò)散，它通常是通過直接侵入至周圍組織中或 通過淋巴系統(tǒng)而擴(kuò)散。盡管可能發(fā)生，但通過血液的肛門癌的擴(kuò)散比較
56不常見。
已經(jīng)將幾種因素與肛門癌相關(guān)。最重要地，人類乳頭瘤病毒(HPV) 的感染已經(jīng)顯示出與肛門癌相關(guān)并與幾種其他的癌(包括子宮頸癌和頭
頸癌)相關(guān)。另一種性傳播病毒人類免疫缺陷病毒(HIV)已經(jīng)與肛門 癌相關(guān)^:，感染HIV的個(gè)體具有增加的感染HPV的風(fēng)險(xiǎn)。由于肛門癌 在發(fā)展為肛門癌之前首先開始表現(xiàn)為肛門發(fā)育異常，因此有AIN史的 患者具有增加的發(fā)展肛門癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在患有良性肛門病癥例如肛
門瘺、肛裂、肛周膿腫或痔瘡的患者中表現(xiàn)出增加的肛門癌比率。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期肛門癌的治療，肛門癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防 (例如在患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與肛門癌相 關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素的受治療者中肛門癌的預(yù)防是尤其有用的。 問錄應(yīng)i廯和i應(yīng)濕
結(jié)腸是大腸((large intestine),也被稱為大腸(large bowel))中最 長(zhǎng)的部分。在西方世界的男性和女性中，結(jié)腸癌都是第三類最常見的癌。 在非洲裔美國(guó)人中發(fā)病率是最高的，他們也更可能死于這種疾病。結(jié)腸 癌的風(fēng)險(xiǎn)在50歲之后大大升高，但是每年在較年輕的人群中也有大量 病例纟皮才艮告。通常，結(jié)腸和直腸癌一皮劃分在一起并具有與它們相關(guān)的相 同的風(fēng)險(xiǎn)因素。具有結(jié)腸癌、息肉或遺傳性結(jié)腸癌綜合征(例如FAP 和HNPCC)的個(gè)人或家族史的個(gè)體，以及患有潰瘍性結(jié)腸炎或克隆病 的患者都處于較高的風(fēng)險(xiǎn)中并可能在比一般人群更早的年齡就需要篩 查。患有結(jié)腸癌的具有一級(jí)親屬關(guān)系(父母、兄弟姐妹或子女)的個(gè)體 發(fā)展癌的可能性是沒有受感染的親屬的人的2至3倍。
可用臨床醫(yī)生已知的多種技術(shù)診斷結(jié)腸癌。由于這些時(shí)期常常不與 任何癥狀相關(guān)，篩查測(cè)試是診斷處于早期的結(jié)腸癌(例如息肉或腺瘤) 的最有效的方法。通常當(dāng)息肉長(zhǎng)成腫瘤時(shí)，其會(huì)出血或堵塞結(jié)腸而產(chǎn)生 癥狀。這些癥狀包括從直腸出血、排便后大便或廁所中的血、大便形狀 的改變(即變稀)、腹部絞痛以及在不需要排便時(shí)感覺到需要排便。由 于肺瘤和息肉可間歇地出血，通過稱為大便潛血試驗(yàn)(FOBT)的試驗(yàn) 可檢測(cè)大便樣品中的血液。FOBT單獨(dú)只能發(fā)現(xiàn)約24%的癌?？蓮澢?乙狀結(jié)腸鏡檢查或結(jié)腸鏡檢查也可被用于診斷結(jié)腸直腸癌。通常，將結(jié)腸直腸癌如下分期
0期(也稱作原位癌)-癌局限于結(jié)腸壁最外面的部分。I期-癌已經(jīng)擴(kuò)散至結(jié)腸壁的第二和第三層，但沒有到結(jié)腸壁的外部
或超出結(jié)腸壁。這也被稱為杜克斯A期結(jié)腸癌。
II期-癌已經(jīng)擴(kuò)散穿過結(jié)腸壁，但是沒有侵入任何淋巴結(jié)(這些是
幫助對(duì)抗感染和疾病的小結(jié)構(gòu))。這也被稱為杜克斯B期結(jié)腸癌。
III期-癌已經(jīng)擴(kuò)散穿過結(jié)腸壁并且到淋巴結(jié)中，但是沒有擴(kuò)散至身
體其他區(qū)域。這也被稱為杜克斯C期結(jié)腸癌。
IV期-癌已經(jīng)擴(kuò)散至身體其他區(qū)域(即肝和肺)。這也被稱為杜克斯
D期結(jié)腸癌。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期結(jié)腸直腸癌的治療，結(jié)腸直腸癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防(例如在患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中結(jié)腸直腸癌的預(yù)防是尤其有用的。
食管是連接咽喉與胃的肌肉質(zhì)管。絕大多數(shù)的食管癌是從食管的內(nèi)部膜(粘膜)而不是從構(gòu)成食管其余部分的肌肉或軟骨細(xì)胞發(fā)展的。食管的膜有些獨(dú)特因?yàn)槠湓趶难屎硐蛭干煺箷r(shí)是變化的。在上端(近端)食管中，食管的膜與咽喉的膜類似，由鱗狀細(xì)胞構(gòu)成。因此當(dāng)癌在這一區(qū)發(fā)展時(shí)，它們通常是鱗狀細(xì)胞癌。在低端(末端)食管中，更常見的類型的癌被稱為腺癌。
除了擴(kuò)散性的癌，患者有時(shí)被診斷為癌前病變，稱作原位癌。這些癌前病變可在發(fā)展為鱗狀細(xì)胞癌或腺癌之前^皮發(fā)現(xiàn)。當(dāng)食管的膜經(jīng)歷與癌的變化相似的變化4旦沒有任何向更深組織中侵入時(shí)發(fā)生原位癌。因此，盡管細(xì)胞本身具有癌樣特性，但由于沒有侵入發(fā)生，因此沒有擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。被認(rèn)為是癌的前兆的另一種類型的病變本身被稱為巴雷特食管，其在下文中被深入地講解。
每年食管癌發(fā)生于約13,500個(gè)美國(guó)人中，導(dǎo)致約12，500例死亡。大多數(shù)患者在他們50多歲或60多歲的時(shí)候被診斷出，并且被診斷出的男性是女性的大約四倍。過去，絕大多數(shù)(~85%)被診斷的食管癌是在上端食管中發(fā)生的鱗狀細(xì)胞癌。這種類型的癌的風(fēng)險(xiǎn)因素包括抽煙和
飲酒(alcohol use )。盡管它們都被認(rèn)為是獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素(抽煙為更強(qiáng)的)，但在食管癌發(fā)展中這兩種因素之間似乎有協(xié)同作用。食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的其他潛在的致癌原是亞硝胺、石棉纖維和石油產(chǎn)品。
有腺癌(通常為低端食管的)風(fēng)險(xiǎn)的患者群體與這截然不同。當(dāng)與鱗狀細(xì)胞癌相比，腺癌之前是不太常見的疾病。但近來它已變得甚至比鱗狀細(xì)胞癌更普遍。通常腺癌被認(rèn)為是產(chǎn)生于巴雷特食管的環(huán)境中，所述巴雷特食管是食管的正常膜被與胃相似的膜所替代的一種病癥。通過內(nèi)窺鏡檢查診斷巴雷特食管，其中使用纖維光學(xué)照相機(jī)以俯視進(jìn)入食管中并活體組織檢查任何可疑區(qū)域。巴雷特食管被認(rèn)為是低端食管長(zhǎng)期暴露于胃酸所導(dǎo)致的。這種暴露發(fā)生于患有胃食管反流疾病(GERD)的患者中，其導(dǎo)致患者胃灼熱、胃氣脹、喪失食欲或隨著食物或晚上睡覺時(shí)胃痛的癥狀?；加新訥ERD的患者具有發(fā)展巴雷特食管的風(fēng)險(xiǎn)并且因此具有較高的發(fā)展食管腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。
盡管通過定義，巴雷特食管在食管的膜不正常時(shí)發(fā)生，但是可有不同水平的不正常程度。將其從發(fā)育異常的方面來分級(jí)，其被用于確定巴雷特食管將有多大可能發(fā)展至癌。由于這些被認(rèn)為是具有發(fā)展至癌的高可能性的癌變前變化，具有高級(jí)別發(fā)育異常的巴雷特食管的患者應(yīng)當(dāng)每三個(gè)月接受 一 次內(nèi)窺鏡檢查或?qū)嶋H地接受治療。對(duì)于證明局部食管癌或發(fā)育異常的最靈敏的檢測(cè)是內(nèi)窺鏡檢查。用內(nèi)窺鏡檢查，可用纖維光學(xué)照相機(jī)直接觀察食管中所關(guān)心的位置，并且將不正常的位置，存或不存在流血，以及梗阻的量可視化。取決于食管癌的位置和程度，可能還需要進(jìn)行喉鏡檢查(查看咽喉)或支氣管鏡檢查(查看氣管和氣道)。如今的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)護(hù)還包括在內(nèi)窺鏡檢查期間進(jìn)行超聲波，稱作內(nèi)窺鏡超聲檢查(EUS)。為正確的診斷癌并將癌分期，通常進(jìn)行CT掃描、吞鋇測(cè)試、X-射線以及其他更多的常規(guī)測(cè)試(包括血液篩查測(cè)試)。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期食管癌的治療，食管癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防(例如在患有休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與食管癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中食管癌的預(yù)防是尤其有用的。
59(7v」,對(duì)4
膽嚢是貯存并濃縮膽汁的小的梨形器官。膽嚢和肝通過肝管相連。
在美國(guó)膽嚢的原發(fā)癌每年感染約6000名成人。這些癌的大部分是^泉癌，
具有亞型例如乳頭狀的、結(jié)節(jié)狀的、管狀的，這取決于顯微鏡下腫瘤細(xì)胞的外觀。比較不常見的亞型包括鱗狀細(xì)胞、印戒細(xì)胞和腺鱗癌(腺棘皮癌)。
膽嚢癌在老年患者中最常見，診斷時(shí)年齡中值為62-66歲。它在女性中更常見，女性比男性比率為約3: 1。
盡管已經(jīng)將膽嚢癌與膽結(jié)石、高的雌激素水平、吸煙、酒精、肥胖和女性性別相關(guān)聯(lián)，但膽嚢癌的病因是未知的。而且患有炎性腸疾病(潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病)的患者發(fā)展肝外膽道癌的可能性是10倍。
通常，通過(thorough)病史和身體檢查以及實(shí)驗(yàn)室工作(其包括代謝化學(xué)和肝功能組以尋找作為一般肝膽疾病的提示的血液中不同物質(zhì)的不正常水平)來診斷膽嚢癌。通常還進(jìn)行尿分析以評(píng)估這些物質(zhì)中的一些的尿中水平。還可使用其它的技術(shù)例如超聲、MRI、膽管造影和CT掃描。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期膽嚢癌的治療，膽嚢癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防(例如在患有休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與膽嚢癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中膽嚢癌的預(yù)防是尤其有用的。
W #痛
胃癌是胃的癌。在美國(guó)，胃癌目前列為第14大最普遍的癌。40歲前很少發(fā)生胃癌，但之后其發(fā)病率隨年齡而增加。
超過90%的胃癌產(chǎn)生于胃的膜。由于這種膜具有腺，因此從其而來的癌被稱為腺瘤或?qū)τ诟砥诘男问絹碚f稱為腺癌。盡管有其他可從胃中產(chǎn)生的癌(淋巴瘤-來自淋巴組織、平滑肌肉瘤-來自肌肉組織、鱗狀細(xì)胞癌-來自沒有腺的膜)，但絕大部分是腺癌。
研究也已將幽門螺旋桿菌(//e"coZ^cter ; j;/on')感染與胃癌相關(guān)聯(lián)。幽門螺旋桿菌與胃潰瘍和慢性萎縮性胃炎有關(guān)，這可解釋幽門螺旋桿菌感染的患者中胃癌的高發(fā)病率。然而，幽門螺旋桿菌在胃癌的發(fā)展中的
60確切作用還不清楚。
可用多種片企測(cè)精確地識(shí)別胃癌，包括鋇射線雙重比對(duì)(doublecontrast barium radiograph)(所i胃的"上端胃腸道"或"吞鋇、(bariumswallow )")和上端內(nèi)窺鏡^r查術(shù)。包括CT掃描、PET掃描和腹腔鏡檢查的其他程序被用于胃癌的診斷。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期胃癌的治療，胃癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防(例如在患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與胃癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中胃癌的預(yù)防是尤其有用的。
〈v〃賴
有許多良性的肝腫瘤。血管瘤是最常見的肝良性腫瘤并且當(dāng)在肝中形成良性的充血的腫瘤時(shí)發(fā)生。其他良性腫瘤包括腺瘤和局灶性結(jié)節(jié)狀增生。盡管這些肺瘤沒有侵入周圍的組織或轉(zhuǎn)移，但放射攝影成像時(shí)常常4艮難分辨良性和惡性肺瘤之間的差別。
肝細(xì)胞癌(HCC)是產(chǎn)生于肝細(xì)胞的癌，是最常見類型的原發(fā)肝癌并占所有肝癌的70%左右。產(chǎn)生于肝中的膽管的癌被稱為膽管癌并占所有肝癌的10-20%。這些癌可產(chǎn)生于肝中的膽管(稱為肝內(nèi)膽管癌)或產(chǎn)生于從肝導(dǎo)出的膽管中(稱為肝外膽管癌)。其他類型的罕見的癌可在肝中發(fā)生。這包括血管肉瘤(惡性充血腫瘤)和肝胚細(xì)胞瘤(一種在非常小的兒童中發(fā)展的罕見癌)。
有許多和肝癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。在美國(guó)，肝癌的最常見的風(fēng)險(xiǎn)因素是肝硬化。在美國(guó)慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染也是肝癌常見的病因。世界范圍內(nèi)，其他的風(fēng)險(xiǎn)因素例如慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染和黃曲霉毒素Bl食品污染更加常見。
有幾種^l用于^r測(cè)肝癌的篩查測(cè)試。 一種可能的篩查測(cè)試涉及Q!-胎蛋白(AFP)的血液水平的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)AFP在胎兒血液中是以高水平存在的蛋白質(zhì)，^S正常地在出生后消失。在HCC存在的情況下AFP水平升高并且可是肝癌發(fā)展的標(biāo)志物。盡管對(duì)一些具有發(fā)展肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)的患者常規(guī)地測(cè)試AFP水平，但不是所有肝癌都產(chǎn)生血液中高水平的AFP,而且到大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)具有高AFP水平時(shí)，腫瘤已經(jīng)處于晚期了。其他的血液蛋白有可能被用作肝癌的篩查工具。幾項(xiàng)研究已顯示蛋白質(zhì)例如去-y羧基凝血酶原(DCP )和扁豆凝集素反應(yīng)性部分(AFP-L3 ) 的使用也可被用作肝癌形成的標(biāo)志物；然而，事實(shí)上很少使用這些蛋白質(zhì)。
此外，當(dāng)懷疑是肝癌時(shí)，進(jìn)行超聲、CT掃描、MRI、血管造影、 氟脫氧葡萄糖(fluorodexoyglucose )-正電子發(fā)射斷層攝影(FDG-PET )、 活體組織才企查和剖腹探查(exploratory laporatomy )以進(jìn)一步診斷并將 肝癌分期。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期肝癌的治療，肝癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防(例如 在患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與肝癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn) 因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中肝癌的預(yù)防是尤其有用的。
闊
胰腺是長(zhǎng)約六英寸的梨形腺，位于腹部深處，在胃和脊推之間。需
指出的是胰腺被分為三個(gè)部分最寬的部分被稱為頭部，中間的部分是
本體而細(xì)末端被稱為尾部。胰腺負(fù)責(zé)制造激素(包括幫助調(diào)節(jié)血糖水平 的胰島素)和經(jīng)由腸用于消化食物的酶。通過胰腺中的導(dǎo)管運(yùn)輸這些酶，
這些酶流入通常的膽管，所述膽管將酶運(yùn)進(jìn)腸。胰腺癌的發(fā)病率在60 和80歲之間是最高的，而在低于40歲的人群中非常少見。男性和女性 中的發(fā)病率大致相當(dāng)，盡管近年來女性的發(fā)病率升高，這可能是因?yàn)榕?性更高的吸煙率。吸煙者發(fā)展胰腺癌的可能性是二至三倍。如果一個(gè)人 的母親、父親或兄弟姐妹已經(jīng)患有所述疾病，那么他的風(fēng)險(xiǎn)增至三倍。 乳腺癌或結(jié)腸癌的家族史也增加風(fēng)險(xiǎn)。這一增加的風(fēng)險(xiǎn)是由于致癌基因 上的遺傳突變。這種疾病實(shí)際上的病因還不知道，但是被認(rèn)為是遺傳的 遺傳上的變化和由環(huán)境暴露導(dǎo)致的變化聯(lián)合的結(jié)果。
當(dāng)醫(yī)生懷疑患者可能患有胰腺癌時(shí)，超聲、CT掃描和內(nèi)窺鏡檢查 被用來診斷并將癌分期。某些患有胰腺癌的患者可能具有升高的糖抗原 19-9 (CA 19-9)水平。在具有升高的水平的患者中，所述水平在與其 他測(cè)試聯(lián)合確認(rèn)診斷上以及對(duì)在治療期間監(jiān)測(cè)所述疾病是有用的。可在
-;臺(tái)療期間周期性的檢查所述水平以觀察癌是穩(wěn)定的還是惡化的。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期胰腺癌的治療，胰腺癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防 (例如在患有休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與胰腺癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中胰腺癌的預(yù)防是 尤其有用的。
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小腸(small bowel )，也一皮稱為小腸(small intestine ),是連才妻胃和 大腸(也稱作結(jié)腸)的消化道部分。小腸有三個(gè)不同的部分l)十二指 腸，2)空腸以及3)回腸。令人驚訝的是，盡管與消化道的其余部分相比 小腸長(zhǎng)度驚人地長(zhǎng)，小腸的癌卻非常少見。這包括在腸中開始的癌或從 另一個(gè)身體部位擴(kuò)散到那里的癌。尤其是，在美國(guó)小腸癌占所有腸癌的 不到5%占已診斷的所有癌的約0.5%。
大多數(shù)小腸癌的病因是未知的。然而有一些可增加發(fā)展小腸癌的機(jī) 會(huì)的可能的風(fēng)險(xiǎn)因素。 一些實(shí)例包括克隆病、乳糜瀉病、peutz-jegher 氏綜合征和腸息肉病。
取決于顯微鏡下的外觀和起源的細(xì)胞，有四種主要類型的小腸癌。
腺癌是最常見的類型。它通常在腸的膜或內(nèi)層中開始，并通常在十二指
腸中發(fā)生。另一種類型是肉瘤并且典型的亞型是平滑肌肉瘤，其在小腸
的肌肉壁中開始并通常在回腸中發(fā)生。第三種類型是類癌，其在小腸的
特殊的產(chǎn)生激素的細(xì)胞中開始并通常發(fā)生在回腸中，有時(shí)在闌尾(其是
大腸的第一部分)中。第四種類型是淋巴瘤，其在小腸的淋巴組織中開
始并通常在空腸中發(fā)生。淋巴瘤的最典型的亞型是非霍奇金淋巴瘤。小
腸癌的一種不常見的亞型是胃腸道間質(zhì)腫瘤，其可在小腸三個(gè)部分的任 何一個(gè)中發(fā)生。
通常使用完整病史、身體檢查和大便樣品、內(nèi)窺鏡檢查或結(jié)腸鏡檢 查、鋇C射線、CT掃描、超聲或其他x射線診斷小腸癌。
本發(fā)明的方法對(duì)于早期小腸癌的治療，小腸癌復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防 (例如在患有休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的受治療者中)或具有任何與小腸癌相 關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如上文所描述的那些)的受治療者中小腸癌的預(yù)防是 尤其有用的。
V.預(yù)防
在本發(fā)明的另 一個(gè)方面，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF特異性拮抗劑可被用于良性的、癌前的或早期癌的治療，或者腫瘤復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防?？墒?用所述方法治療癌本身或預(yù)防癌向轉(zhuǎn)移性或擴(kuò)散期或者向更高級(jí)別或 時(shí)期的發(fā)展。例如，可使用本發(fā)明的方法治療患有O期癌或息肉的受治 療者以便預(yù)防向I期或更高期腫瘤發(fā)展。同樣，在患有II期癌的患者中，
可使用所述方法預(yù)防癌向m期或iv期癌發(fā)展。
還可使用VEGF特異性拮抗劑預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。例如，如果腫瘤已 經(jīng)被識(shí)別并治療(例如用化學(xué)療法或手術(shù)去除)，可使用VEGF特異性 拮抗劑預(yù)防結(jié)腸直腸肺瘤原處的復(fù)發(fā)或結(jié)腸直腸腫瘤的轉(zhuǎn)移。為預(yù)防腫 瘤的復(fù)發(fā)，可使用VEGF特異性拮抗劑，例如治療休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移或 者預(yù)防休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或再生長(zhǎng)，其可是或可不是臨床上可檢 測(cè)的。
我們還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF特異性拮抗劑可被用于從未患過癌或具有 發(fā)展癌的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中癌的預(yù)防。有多種已知的風(fēng)險(xiǎn)因素與癌相關(guān) 并且上文中描述了它們中的許多。示例性的風(fēng)險(xiǎn)因素包括高齡(即超過 50歲)、癌的家族史、HPV、 HIV、 HBV和HCV的病毒感染、使用口 服避孕藥、肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、巴雷特食管、幽門螺旋桿菌感染以 及息肉或發(fā)育異常的存在。此外，認(rèn)為已知患有遺傳性癌綜合征的受治 療者具有發(fā)展癌的風(fēng)險(xiǎn)。這種綜合征的非限制性實(shí)例包括APC、 HNPCC、加德納綜合征和MEN1。發(fā)展癌的另外的風(fēng)險(xiǎn)因素可根據(jù)臨 床評(píng)估確定并包括升高水平的激素或血液蛋白例如PSA(前列腺癌)、 CA-125(卵巢癌)、AFP(肝癌)、DCP(肝癌)和CA 19-9(胰腺癌)。
VI.新輔助療法
本發(fā)明提供在受治療者，例如人類患者中在手術(shù)去除可手術(shù)的癌之 前的新輔助療法的方法，其包括對(duì)患者(例如，其中患者已經(jīng)被確診為 腫瘤和/或癌)施用有效量的VEGF特異性拮抗劑，例如VEGF抗體。 任選地，將VEGF特異性拮抗劑與至少一種化學(xué)治療劑聯(lián)合施用。在手 術(shù)后對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防癌復(fù)發(fā)的其 它的步驟也可與本文描述的新輔助療法一起使用。對(duì)于包括在手術(shù)后對(duì) 受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑的其它步驟的方法來說，可使用任何本文描述的輔助方法。
例如， 一種方法包括在受治療者中治療癌，該方法包括下列步驟
a)包括多個(gè)治療周期的第 一 階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受 治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，以及任選地至 少一種化學(xué)治療劑；b)確定性手術(shù)，借以去除癌；以及任選地，c)包括 多個(gè)維持周期的第二階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者 施用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，以及有或沒有任何化 學(xué)治療劑。
對(duì)于新輔助療法來說，可將VEGF特異性拮抗劑以一定量或一定時(shí) 間(例如特定的治療方案的全部時(shí)間)施用以減少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更多的)腫瘤中癌細(xì)胞 的數(shù)目；以減小腫瘤的大小(例如以允許切除)；以減少腫瘤負(fù)荷；以 抑制(即降低至某種程度和/或終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官中；以減 小腫瘤中血管密度；以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；以減少或抑制腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤細(xì) 胞增殖；以減少或預(yù)防休眠腫瘤的生長(zhǎng)；以減少或預(yù)防微轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或 增殖；以增加或延長(zhǎng)易患或被診斷為患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的 腫瘤的受治療者的DFS或OS;和/或以將與癌相關(guān)的 一種或多種癥狀緩 解至某種程度。
在一個(gè)實(shí)例中，施用新輔助療法以延長(zhǎng)DFS或OS,其中在開始施 用抗體后約2至5年評(píng)估DFS或OS。在某些實(shí)施方案中，在治療開始 后或最初的診斷后約3-5年、約4-5年，或至少約4年或至少約5年評(píng) 估受治療者的DFS或OS。通常，VEGF特異性拮抗劑是VEGF抗體例 如貝伐單抗。
在另一個(gè)實(shí)例中，與單獨(dú)用化學(xué)療法(例如紫杉烷，諸如紫杉醇) 治療的受治療者相比，抗體和/或化學(xué)療法的施用可在受治療者群體中3 年時(shí)降低約50%(其中此處"約50%"包括從約45%至約70%的范圍)的 疾病復(fù)發(fā)(在原發(fā)器官中的癌復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā))，例如3年時(shí)降低約 52%的在原發(fā)器官中的復(fù)發(fā)，和/或3年時(shí)降低約53%的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。
可按照已知的方法對(duì)受治療者例如人類患者施用VEGF特異性拮 抗劑例如VEGF抗體，已知方法為例如靜脈內(nèi)施用(諸如為團(tuán)注)或通過 一 段時(shí)間的持續(xù)輸注、通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)
(intracerobrospinal )、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸 入途徑施用。抗體的靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的。
盡管可將VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體作為單一劑施用，但 任選地用VEGF抗體和一種或多種化學(xué)治療劑的組合治療患者。在一個(gè) 實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑中的至少一種是紫杉烷。組合的施用包括使用 分開的制劑或單一藥學(xué)制劑聯(lián)合施用或并行施用，以及以任一種順序的 連續(xù)施用，其中優(yōu)選地有一段時(shí)間兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們 的生物活性。因此，可在VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體的施用之 前或之后施用化學(xué)治療劑。在這一實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑的至少一次 施用和VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體的至少一次施用之間的時(shí)間 優(yōu)選地為約l個(gè)月或更短，并最優(yōu)選地為約2周或更短?？蛇x擇地，將 化學(xué)治療劑和VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體以單一制劑或分開的 制劑并行對(duì)患者施用。使用化學(xué)治療劑(例如紫杉烷)和VEGF抗體(例 如貝伐單抗)組合的治療可對(duì)患者產(chǎn)生協(xié)同的或比加和更大的治療益 處。
為此通常將化學(xué)治療劑(如果施用)以已知的劑量或者由于藥物的 組合作用或歸因于抗代謝化學(xué)治療劑的施用的消極副作用而任選地以 降低的劑量施用?？梢勒罩圃焐痰氖褂谜f明書或由熟練醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來 確定使用這種化學(xué)治療劑的制劑和給藥時(shí)間表。當(dāng)所述化學(xué)治療劑是紫 杉醇時(shí)，優(yōu)選地將它每周(例如以80 mg/m2 )或每3周(例如以175 mg/m 或135 mg/m2 )施用。適當(dāng)?shù)亩辔髯仙即嫉膭┝堪?0 mg/m2、70 mg/m2、 75 mg/m2、 100 mg/m2(每3周)；或35 mg/m2或40 mg/m2 (每周)。
上文公開了各種可組合的化學(xué)治療劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案 中，將與VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體組合的化學(xué)治療劑包括但 不限于，例如紫杉烷(包括多西紫杉醇和紫杉醇)、長(zhǎng)春堿類(vinca) (例如長(zhǎng)春瑞濱或長(zhǎng)春花堿)、鉑化合物(例如碳鉑和順鉑)、芳香酶抑 制劑(例如來曲唑、阿那曲唑或依西美坦)、抗雌激素藥(例如氟維司 群和三苯氧胺)、依托泊苷、噻替派、環(huán)磷酰胺、曱氨蝶呤、多柔比星 脂質(zhì)體、聚乙二醇化的多柔比星脂質(zhì)體、卡培他濱、吉西他濱、COX-2
66抑制劑(例如塞來昔布)或蛋白體抑制劑(例如PS342)。
當(dāng)對(duì)受治療者施用蒽環(huán)類抗生素(例如阿霉素或表柔比星)時(shí)，優(yōu)
選地在施用VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗之前和/或之后提供這一 施用。然而，可將具有減小的心臟毒性的經(jīng)修飾的蒽環(huán)類抗生素例如多 柔比星脂質(zhì)體(TLC D-99 (MYOCET⑧)、聚乙二醇化的多柔比星脂質(zhì)體 (CAELYX⑧)或表柔比星與VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗組合。
在施用時(shí)間表的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的新輔助療法包括第一步 驟，其中在多個(gè)新輔助周期中對(duì)患者施用VEGF特異性拮抗劑例如貝伐 單抗以及一種或多種的化學(xué)治療劑，之后進(jìn)行手術(shù)以確定性地去除腫 瘤。每個(gè)新輔助周期取決于特定的治療計(jì)劃，由一至三周組成。例如， 治療周期可是三周，其意味著患者每三周接受一劑量的化學(xué)療法和一劑 量的貝伐單抗。治療周期也可是兩周，其意味著患者每隔一周接受一劑 量的化學(xué)療法和一劑量的貝伐單抗。新輔助治療的整個(gè)第 一階段可持續(xù) 約4-8個(gè)周期。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，新輔助療法在手術(shù)前持續(xù) 不超過一年，在一個(gè)實(shí)施方案中不超過六個(gè)月。取決于疾病的類型和嚴(yán) 重度，VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗的優(yōu)選的劑量是在從約1 Mg/kg 至約50 mg/kg,最優(yōu)選地在/人約5 mg/kg至約15 mg/kg的范圍內(nèi)，包 括但不限于7.5mg/kg或10mg/kg。在一些方面，化學(xué)療法方案涉及傳 統(tǒng)的高劑量的間歇施用。在一些其他的方面，沒有預(yù)定間隔而使用較小 但更頻繁的劑量來施用化學(xué)治療劑("有節(jié)奏的化學(xué)療法")。通過常規(guī) 技術(shù)和測(cè)定很容易監(jiān)測(cè)本發(fā)明的療法的進(jìn)展。
除了 VEGF抗體和化學(xué)治療劑之外，還可將其他的治療方案與之組 合。例如，可施用第二(第三、第四等等)化學(xué)治療劑，其中第二化學(xué) 治療劑或是另 一種不同的紫杉烷化學(xué)治療劑或是非紫杉烷的化學(xué)治療 劑。例如，第二化學(xué)治療劑可是紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、 長(zhǎng)春堿類(例如長(zhǎng)春瑞濱)、鉑化合物(例如順鉑和碳鉑)、抗激素劑(例 如芳香酶抑制劑或抗雌激素藥)、吉西他濱、卡培他濱等。示例性的組 合包括紫杉烷/鉑化合物、吉西他濱/紫杉烷、吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春 瑞濱/紫杉烷、卡培他濱/紫杉烷等。可施用不同化學(xué)治療劑的"混合物"。
可與VEGF抗體組合的其他治療劑包括以下^壬何一種或多種另—一種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑例如第二抗VEGF抗體、VEGF 變體、可溶的VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中 和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶抑制劑及其任何組合。對(duì)使 用本發(fā)明抗體的組合腫瘤療法有用的其他治療劑包括涉及腫瘤生長(zhǎng)的 其他因子例如EGFR、 ErbB2(也稱為Her2)、 ErbB3、 ErbB4或TNF的拮 抗劑。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑的組合物中不包 括抗ErbB2抗體或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗體)。在本發(fā) 明的某些實(shí)施方案中，可將抗VEGF抗體與以一種或多種酪氨酸激酶受 體例如VEGF受體、FGF受體、EGF受體和PDGF受體為靶的小分子 受體酪氨酸激酶抑制劑(RTKI)組合使用。許多治療性的小分子RTKI 是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787)、埃羅 替尼(TARCEVA⑧)、OSI畫7904、 ZD6474(ZACTIMA⑧)、ZD6126(ANG453)、 ZD1839、舒尼替尼(SUTENT⑧)、司馬沙尼(semaxanib ) (SU5416)、 AMG706、 AGO 13736、伊馬替尼(GLEEVEC⑧)、MLN-518、 CEP國(guó)701、 PKC匿412、拉帕替尼(lapatinib) (GSK572016)、 VELCADE⑧、AZD2171、 索拉非尼(NEXAVAR⑧)、XL880和CHIR-265。
上文聯(lián)合施用的任何劑的適合的劑量是目前使用的那些并可由于 該劑和VEGF抗體的組合作用(協(xié)同)而被降低。
除了上文的治療方案，可使患者經(jīng)受放射療法。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所施用的VEGF抗體是完整的無保護(hù) 的抗體。但可將VEGF抗體與細(xì)胞毒性劑軛合。在某些實(shí)施方案中，軛 合的抗體和/或與其結(jié)合的抗原被細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致軛合物殺死其所結(jié)合 的癌細(xì)胞的治療效力增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑靶向或干擾 癌細(xì)胞中的核酸。這種細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括美登醇(maytansinoids )、 加里剎霉素、核糖核酸酶和DNA核酸內(nèi)切酶。
VII.輔助療法
本發(fā)明提供輔助療法的方法，其包括在確定性手術(shù)后對(duì)患有非轉(zhuǎn)移 性的癌的受治療者施用VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體。
例如，方法可包括以下步驟a)包括多個(gè)治療周期的第一階段，其
68中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者施用有效量的VEGF特異性
拮抗劑例如貝伐單抗，以及任選地至少一種化學(xué)治療劑；以及b)包括多 個(gè)維持周期的第二階段，其中每個(gè)周期包括以預(yù)定的間隔對(duì)受治療者施 用有效量的VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗，但沒有任何化學(xué)治療 劑；其中組合的第一和第二階段在最初的手術(shù)后治療后持續(xù)至少一年。 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一階段包括第一個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用 VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第一化學(xué)療法方案，之后是第二 個(gè)多個(gè)治療周期，其中施用VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗以及第二 化學(xué)療法方案。
對(duì)于輔助療法來說，可將VEGF特異性拮抗劑以一定量或一定時(shí)間 (例如特定的治療方案的全部時(shí)間)施用以減少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％、 100%或更多的)腫瘤中癌細(xì)胞的數(shù)目； 以減小肺瘤的大小；以減少腫瘤負(fù)荷；以抑制(即降低至某種程度和/ 或終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官中；以減小肺瘤中血管密度；以抑制肺 瘤轉(zhuǎn)移；以減少或抑制腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞增殖；以減少或預(yù)防^^眠腫 瘤的生長(zhǎng)；以減少或預(yù)防微轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或增殖；以減少或預(yù)防治療或去 除后腫瘤的再生長(zhǎng)；和/或以將與癌相關(guān)的一種或多種癥狀緩解至某種 程度。在一些其它的實(shí)施方案中，可使用VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防受 治療者中癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。在一個(gè)實(shí)例中，在約四年后在受治療者群體 中評(píng)估癌復(fù)發(fā)的預(yù)防以證實(shí)在群體的至少約80%中無疾病復(fù)發(fā)發(fā)生。在 另一個(gè)實(shí)例中，在約3年時(shí)評(píng)估疾病復(fù)發(fā)的預(yù)防，其中與Y又用化學(xué)療法 治療的受治療者相比，疾病復(fù)發(fā)下降了至少約50%。
通常在受治療者從手術(shù)中復(fù)原一段時(shí)間后施用VEGF特異性拮抗 劑。這段時(shí)間可包括傷口愈合或手術(shù)切口愈合所需要的時(shí)間段、降低傷 口裂開的風(fēng)險(xiǎn)所需要的時(shí)間段或受治療者恢復(fù)至與手術(shù)前的健康水平 基本相似或更好的健康水平所需要的時(shí)間段。確定性手術(shù)完成和VEGF 特異性拮抗劑的首次施用之間的時(shí)間段還可包括藥物假期所需要的時(shí) 間段，其中受治療者需要或要求在治療方案之間的一段時(shí)間。通常，確 定性手術(shù)完成和VEGF特異性拮抗劑療法開始之間的時(shí)間段可包括少 于一周、l周、2周、3周、4周(28天)、5周、6周、7周、8周、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、IO個(gè)月、11個(gè) 月、l年、2年、3年或更久。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定性手術(shù)和施用 VEGF特異性拮抗劑之間的時(shí)間段大于2周并小于1年。
在一個(gè)實(shí)例中，以有效延長(zhǎng)無病生存期(DFS )或總體生存期(OS ) 的量施用VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體，其中在抗體最初施用后 約2至5年評(píng)估DFS或OS。在某些實(shí)施方案中，在治療開始后或最初 的診斷后約3-5年、約4-5年或至少約4年或至少約5年評(píng)估受治療者 的DFS或OS。
按照已知的方法對(duì)受治療者例如人類患者施用VEGF特異性拮抗 劑例如VEGF抗體，已知方法為例如靜脈內(nèi)施用(諸如為團(tuán)注)或通過 一段時(shí)間的持續(xù)輸注、通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、 滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑施用。抗體的靜月永內(nèi)施用是優(yōu)選的。
可將VEGF特異性拮抗劑作為單一劑施用。在其他的實(shí)施方案中， 用VEGF特異性拮抗劑和一種或多種化學(xué)治療劑的組合治療患者。在一 些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑中的至少一種是紫杉烷。組合的施用包括使 用分開的制劑或單一 藥學(xué)制劑的聯(lián)合施用或并行施用，以及以任一種順 序的連續(xù)施用，其中任選地有一段時(shí)間兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮 它們的生物活性。因此，可在VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體的施 用之前或之后施用化學(xué)治療劑。在這一實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑的至少 一次施用和VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體的至少一次施用之間的 時(shí)間優(yōu)選地為約1個(gè)月或更短，并最優(yōu)選地為約2周或更短?？蛇x擇地， 將化學(xué)治療劑和VEGF抗體以單一制劑或分開的制劑并行對(duì)患者施用。 使用化學(xué)治療劑(例如紫杉烷)和VEGF抗體(例如貝伐單抗)組合的 治療可對(duì)患者產(chǎn)生協(xié)同的或比加和更大的治療益處。
為此通常將化學(xué)治療劑(如果施用)以已知的劑量或者由于藥物的 組合作用或歸因于抗代謝化學(xué)治療劑的施用的消極副作用而任選地以 降低的劑量施用?？梢勒罩圃焐痰氖褂谜f明書或由熟練醫(yī)師根據(jù)經(jīng)-驗(yàn)來 確定使用這種化學(xué)治療劑的制劑和給藥時(shí)間表。當(dāng)所述化學(xué)治療劑是紫 杉醇時(shí)，優(yōu)選地將它每周(例如以80 mg/m2 )或每3周(例如以175 mg/m2或13 5 mg/m2 )施用。適當(dāng)?shù)亩辔髯仙即嫉膭┝堪?0 mg/m2 、 70 mg/m2 、 75 mg/m2、 100 mg/m2(每3周)；或35 mg/m2或40 mg/m2 (每周)。
上文公開了各種可組合的化學(xué)治療劑。將與VEGF抗體組合的化學(xué) 治療劑的實(shí)例包括但不限于，例如紫杉烷(包括多西紫杉醇和紫杉醇)、 長(zhǎng)春堿類(例如長(zhǎng)春瑞濱或長(zhǎng)春花堿)、鉑化合物(例如碳鉑和順鉑)、 芳香酶抑制劑(例如來曲唑、阿那曲唑或依西美坦)、抗難激素藥(例 如氟維司群和三苯氧胺)、依托泊苷、噻替派、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、 多柔比星脂質(zhì)體、聚乙二醇化的多柔比星脂質(zhì)體、卡培他濱、吉西他濱、 COX-2抑制劑(例如塞來昔布)或蛋白體抑制劑(例如PS342)。
當(dāng)對(duì)受治療者施用蒽環(huán)類抗生素(例如阿霉素或表柔比星)時(shí)，優(yōu) 選地在施用VEGF抗體之前和/或之后提供這一施用，例如以在下文的 實(shí)施例中公開的方案，其中在手術(shù)后但在VEGF抗體和紫杉烷的施用之 前對(duì)受治療者施用蒽環(huán)類抗生素/環(huán)磷酰胺的組合。然而，可將具有減 小的心臟毒性的經(jīng)修飾的蒽環(huán)類抗生素例如多柔比星脂質(zhì)體(TLC D-99 (MYOCET⑧)、聚乙二醇化的多柔比星脂質(zhì)體(CAELYX⑧)或表柔比星與 VEGF抗體組合。
在一個(gè)施用時(shí)間表中，本發(fā)明的輔助療法包括第一階段，其中在多 個(gè)治療周期中對(duì)患者施用VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體以及一種 或多種的化學(xué)治療劑；和第二階段，其中將VEGF特異性拮抗劑例如 VEGF抗體作為單一劑在多個(gè)維持周期內(nèi)使用。每個(gè)治療周期取決于特 定的治療計(jì)劃，由一至三周組成。例如，治療周期可包括貝伐單抗作為 VEGF特異性拮抗劑并且可為三周，其意味著患者每三周沖妻受一劑量的 化學(xué)療法和一劑量的貝伐單抗。治療周期也可是兩周，其意味著患者每 隔一周接受一劑量的化學(xué)療法和一劑量的貝伐單抗。治療的整個(gè)第一階 段可持續(xù)約4-8個(gè)周期。在第二個(gè)維持階段，取決于特定的周期的長(zhǎng)度， 可兩周一次或三周一次地提供貝伐單抗并持續(xù)約30-50個(gè)周期。在某些 實(shí)施方案中，輔助療法從治療的開始持續(xù)至少一年，并且在此之后密切 注意受治療者的進(jìn)展。取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，VEGF抗體的優(yōu)選 的劑量是在從約1 ug/kg至約50 mg/kg，最優(yōu)選地在從約5 mg/kg至約 15 mg/kg的范圍內(nèi)，包招^旦不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg。在一些方面，
71化學(xué)療法方案涉及傳統(tǒng)的高劑量的間歇施用。在一些其他的方面，沒有 預(yù)定間隔而使用較小但更頻繁的劑量來施用化學(xué)治療劑("有節(jié)奏的化 學(xué)療法")。通過常規(guī)技術(shù)和測(cè)定很容易監(jiān)測(cè)本發(fā)明的療法的進(jìn)展。
與單獨(dú)用化學(xué)療法(例如紫杉烷諸如紫杉醇)治療的受治療者相比， 抗體和化學(xué)療法的施用可在受治療者群體中3年時(shí)降低約50%(其中此
處"約50%"包括從約45%至約70%的范圍)的疾病復(fù)發(fā)(在原發(fā)器官中
的癌復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā))的可能性，例如在3年時(shí)降低約52%的在原
發(fā)器官中的復(fù)發(fā)和/或3年時(shí)降低約53%的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。
本發(fā)明在本文提供了治療患有非轉(zhuǎn)移性的癌的人類受治療者的群 體中的非轉(zhuǎn)移性的癌的方法，其包括在確定性手術(shù)之后對(duì)受治療者施用
有效量的VEGF特異性拮抗劑例如VEGF抗體和至少一種化學(xué)治療劑， 并在四年或更多年后評(píng)估受治療者以證實(shí)在約4年后至少約80%(優(yōu)選 地至少約85%)的受治療者中沒有疾病復(fù)發(fā)發(fā)生。所述群體可包括3000 例或更多人類受治療者。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在患有非轉(zhuǎn)移性的癌的人類受治療者的群體中 降低疾病復(fù)發(fā)的可能性的方法，其包括在確定性手術(shù)之后對(duì)受治療者施 用有效量的貝伐單抗和至少一種化學(xué)治療劑，其中與單獨(dú)用紫杉烷治療 的受治療者相比，3年時(shí)疾病復(fù)發(fā)的可能性降低至少約50%。
除了 VEGF抗體和化學(xué)治療劑之外，還可將其他的治療方案與之組 合。例如，可施用第二(第三、第四等等)化學(xué)治療劑，其中第二化學(xué) 治療劑或是另 一種不同的紫杉烷化學(xué)治療劑或是非紫杉烷的化學(xué)治療 劑。例如，第二化學(xué)治療劑可是紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、 長(zhǎng)春堿類(例如長(zhǎng)春瑞濱)、鉑化合物(例如順鉑和碳鉑)、抗激素劑(例 如芳香酶抑制劑或抗雌激素藥)、吉西他濱、卡培他濱等。示例性的組 合包括紫杉烷/鉑化合物、吉西他濱/紫杉烷、吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春 瑞濱/紫杉烷、卡培他濱/紫杉烷等?？墒┯貌煌瘜W(xué)治療劑的"混合物"。
可與VEGF抗體組合的其他治療劑包括以下任何一種或多種另一 種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑例如第二抗VEGF抗體、VEGF 變體、可溶的VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中 和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶抑制劑及其^壬〗可組合。對(duì)4吏用本發(fā)明抗體的組合肺瘤療法有用的其他治療劑包括涉及胂瘤生長(zhǎng)的
其他因子例如EGFR、 ErbB2(也稱為Her2)、 ErbB3、 ErbB4或TNF的拮 抗劑。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑的組合物中不包 括抗ErbB2抗體或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗體)。在某些 實(shí)施方案中，可將抗VEGF抗體與以一種或多種酪氨酸;敫酶受體例如 VEGF受體、FGF受體、EGF受體和PDGF受體為靶的小分子受體酪氨 酸激酶抑制劑(RTKI)組合使用。許多治療性的小分子RTKI是本領(lǐng)域 已知的，包括但不限于瓦他拉尼(PTK787)、埃羅替尼(丁八1^￡￥八@)、 OSI-7904、 ZD6474(ZACTIMA )、 ZD6126(ANG453)、 ZD1839、舒尼替 尼(SUTENT⑧)、司馬沙尼(SU5416)、 AMG706、 AG013736、伊馬替尼 (GLEEVEC⑧)、MLN-518、 CEP畫701、 PKC畫412、拉帕替尼(GSK572016)、 VELCADE⑧、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR⑧)、XL880和CHIR畫265。
上文聯(lián)合施用的任何劑的適合的劑量是目前使用的那些并可由于 該劑和VEGF抗體的組合作用(協(xié)同)而被降^氐。
除了上文的治療方案，可使患者經(jīng)受放射療法。
在某些實(shí)施方案中，所施用的VEGF抗體是完整的無^f呆護(hù)的抗體。 但可將VEGF抗體與細(xì)胞毒性劑軛合。在某些實(shí)施方案中，軛合的抗體 和/或與其結(jié)合的抗原被細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致軛合物殺死其所結(jié)合的癌細(xì)胞
上的治療效力增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑靶向或干擾癌細(xì)胞 中的核酸。這種細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括美登醇、加里剎霉素、核糖核酸 酶和DNA核酸內(nèi)切酶。
VIII.劑量、制劑和持續(xù)時(shí)間
以與良好的醫(yī)療實(shí)踐相符合的方式配制、給藥和施用VEGF特異性 拮抗劑組合物。以這個(gè)角度所考慮的因素包括所治療的特定的病癥、所 治療的特定的受治療者、患者個(gè)體的臨床癥狀、病癥的病因、劑的遞送 部位、施用的方法、施用的時(shí)間表、和執(zhí)業(yè)醫(yī)師已知的其他因素。待施 用的VEGF特異性拮抗劑的"治療上有效的量"將由這些考慮因素決定 并且對(duì)預(yù)防、改善、或治療或穩(wěn)定良性的、癌前的或早期癌；或治療或 預(yù)防腫瘤、休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的發(fā)生或復(fù)發(fā)(例如在新輔助或輔助情況中)來說為必需的最小的量。VEGF特異性拮抗劑不需要，但任選地與 目前用以預(yù)防或治療癌或發(fā)展癌的風(fēng)險(xiǎn)的 一 種或多種劑配制在 一 起。這
些其他劑的有效量取決于制劑中存在的VEGF特異性拮抗劑的量、病癥 或治療的類型以及上文所討論的其他因素。通常以如上文中所用的同樣 的劑量和施用途徑使用這些或以迄今使用的劑量的約從1%至99%-使用 這些。
取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，約1 /xg/kg至100 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)的VEGF特異性拮抗劑是對(duì)患者施用的最初的候選劑量，無論例 如是通過一次或多次分開的施用還是通過連續(xù)輸注施用。取決于上文所 提及的因素，典型的每日劑量可從約1 /ig/kg變化至約100 mg/kg或更 多。尤其理想的劑量包括例如7.5 mg/kg、 10 mg/kg和15 mg/kg。對(duì)于 幾天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)施用來說，取決于疾患，將治療維持直到癌被治 療，通過上文描述的或本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行測(cè)量。但其#^劑量方案可 以是有用的。在一個(gè)實(shí)例中，如果VEGF特異性拮抗劑是抗體，那么將 本發(fā)明的抗體以從約5 mg/kg到約15 mg/kg的劑量范圍，包括但不限于 7.5 mg/kg或10mg/kg每周、每?jī)芍芑蛎咳苁┯靡淮巍Ｍㄟ^常規(guī)才支術(shù) 和測(cè)定很容易地監(jiān)測(cè)本發(fā)明的療法的進(jìn)展。
在一個(gè)實(shí)例中，貝伐單抗是VEGF特異性拮抗劑。以100 mg和400 mg無防腐劑、 一次性使用的小瓶為治療應(yīng)用提供貝伐單抗以遞送4 ml 或16 ml的貝伐單抗(25 mg/ml )。在240 mg脫水的a,a-海藻糖、23.2 mg 磷酸鈉(單堿的、 一水合物)、4.8 mg磷酸鈉(雙堿的、無水的)、1.6 mg 聚山梨醇酯20和注射用水(USP)中配制100mg產(chǎn)品。在960 mg脫 水的ce,a-海藻糖、92.8mg磷酸鈉(單堿的、 一水合物)、19.2 mg磷酸 鈉(雙堿的、無水的)、6.4mg聚山梨醇酯20和注射用水(USP)中配 制400 mg產(chǎn)品。
療法的持續(xù)時(shí)間將持續(xù)至醫(yī)學(xué)上表明的長(zhǎng)度或直到達(dá)到所需要的 治療作用(例如本文所描述的那些)。在某些實(shí)施方案中，VEGF特異 性拮抗劑療法持續(xù)2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、IO個(gè)月、l年、2 年、3年、4年、5年、或直到受治療者終生的多年的時(shí)間。
通常良性的、癌前的或早期癌的緩解或治療或者癌(良性的或惡性
74一種或多種癥狀或醫(yī)療問 題。治療上有效量的藥物可實(shí)現(xiàn)下列中的一種或組合以減少(例如
20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更多的)腫 瘤中癌細(xì)胞的數(shù)目；以減小腫瘤的大?。灰詼p少腫瘤負(fù)荷；以抑制(即 降低至某種程度和/或終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官中；以減小腫瘤中 血管密度；以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；以減少或抑制腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞增殖； 以減少或預(yù)防^f木眠肺瘤的生長(zhǎng)；以減少或預(yù)防^t轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或增殖；以 減少或預(yù)防治療或去除后腫瘤的再生長(zhǎng)(例如在輔助療法中)；以增加 或延長(zhǎng)易患或被診斷為患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤或惡性腫 瘤的受治療者的DFS或OS;以減小腫瘤大小以允許手術(shù)(例如在新輔 助療法中)；和/或以將與癌相關(guān)的一種或多種癥狀緩解至某種程度。在 一些其它的實(shí)施方案中，可使用VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防受治療者中 癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。在一個(gè)實(shí)例中，在約四年后在受治療者群體中評(píng)估癌 復(fù)發(fā)的預(yù)防以證實(shí)在群體的至少約80%中無疾病復(fù)發(fā)發(fā)生。在另一個(gè)實(shí) 例中，在約3年時(shí)評(píng)估疾病復(fù)發(fā)的預(yù)防，其中與單獨(dú)用化學(xué)療法治療的 受治療者相比，疾病復(fù)發(fā)下降了至少約50%。
在一個(gè)實(shí)例中，以有效延長(zhǎng)DFS或OS的量施用VEGF特異性拮抗 劑例如VEGF抗體，其中在抗體的最初施用后約2至5年評(píng)估DFS或 OS。在某些實(shí)施方案中，在治療開始后或最初的診斷后約3-5年、約 4-5年或至少約4年或至少約5年評(píng)估受治療者的DFS或OS。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可被用于增加易患或被診斷為患有良性 的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的受治療者的生存持續(xù)時(shí)間。生存持續(xù)時(shí) 間被定義為從藥物的第 一次施用到死亡的時(shí)間。還可通過代表患者在治 療期間死亡的風(fēng)險(xiǎn)的治療組比對(duì)照組的分層的危害比(HR)來測(cè)量生 存持續(xù)時(shí)間。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療顯著的增加了易患或被診斷為 患有癌的用各種抗癌療法治療的 一組受治療者例如人類患者中的響應(yīng) 率。響應(yīng)率被定義為對(duì)治療有響應(yīng)的受治療患者的百分比。在一個(gè)方面， 與單獨(dú)用手術(shù)、放射療法或化學(xué)療法治療的組相比，使用VEGF特異性 拮抗劑和手術(shù)、放射療法或 一 種或多種化學(xué)治療劑的本發(fā)明的組合治療顯著地增加了受治療的患者組中的響應(yīng)率，所述增加具有小于0.005的卡方p值。肺瘤、休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的發(fā)生或復(fù)發(fā)的治療或預(yù)防涉及通常在腫 瘤最初的治療或去除(例如使用抗癌療法諸如手術(shù)、化學(xué)療法或放射療 法)后預(yù)防腫瘤和微轉(zhuǎn)移形成。手術(shù)可留下殘留的胂瘤細(xì)胞或休眠的樣i 轉(zhuǎn)移的小瘤，其具有重新活化"血管生成程序，，并促進(jìn)更多指數(shù)級(jí)的腫瘤 生長(zhǎng)的潛力。盡管休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的存在未必是使用臨床的測(cè)量或篩 查方法可檢測(cè)的，但治療上有效的量是足以預(yù)防或減小使用臨床醫(yī)生已 知的技術(shù)檢測(cè)到休眠腫瘤、微轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移或腫瘤復(fù)發(fā)的量。在一個(gè)實(shí)例中，將通過手術(shù)去除肺瘤治療肺瘤的患者之后用VEGF特異性拮抗劑治 療并隨著時(shí)間監(jiān)測(cè)休眠腫瘤、微轉(zhuǎn)移或腫瘤復(fù)發(fā)的一企測(cè)?？蓪EGF 特異性拮抗劑與另 一種抗癌療法(例如在VEGF特異性拮抗劑之前、同 時(shí)、或之后)組合施用并且可將一種或所有兩種療法作為維持療法繼續(xù)。癌的治療中治療效力的其它的測(cè)量方法被描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公 開第20050186208號(hào)中。使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，通過將具有所需要的純度的活性組分 與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備治療的制劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥劑學(xué))(第20版)，A. Gennaro編輯，2000， Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。 可接受的載體包括鹽水或緩沖劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸； 抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少于約IO個(gè)殘基)的多肽；蛋白 質(zhì)例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水的聚合物例如聚乙烯吡咯 烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、 二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA; 糖醇例如甘露醇和山梨糖醇；鹽形成平衡離子例如鈉；和/或非離子表 面活性劑例如TWEEN 、 PLURONICStm或PEG。任選地，但優(yōu)選地，制劑優(yōu)選地以大約生理濃度含有藥學(xué)上可接受 的鹽，典型地，例如氯化鈉。任選地本發(fā)明的制劑可含有藥學(xué)上可接受 的防腐劑。在一些實(shí)施方案中，防腐劑濃度從0.1%變化至2.0% (通常 為v/v)。適當(dāng)?shù)姆栏瘎┌ㄖ扑庮I(lǐng)域中已知的那些。苯曱醇、苯酚、間甲酚、尼泊金曱酯和尼泊金丙酯是防腐劑的實(shí)例。任選地，本發(fā)明的制劑可以0.005%至0.02%的濃度包含藥學(xué)上可接受的表面活性劑。的活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性的彼此沒有不利影響的那些。這些分 子以對(duì)所預(yù)期目的有效的量適當(dāng)?shù)卮嬖谟诮M合中。還可將活性組分包埋入例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合法制備 的微膠嚢，例如分別地羥曱基纖維素或明膠-微膠嚢和聚(異丁烯酸曱 酯)微膠嚢中，包埋入膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠嚢)或粗乳液中。這些技術(shù)公開于Remington's Pharmaceutic Sciences (雷明頓藥劑學(xué))，如上中?？芍苽涑掷m(xù)釋放的制劑。持續(xù)釋放的制劑的適合的實(shí)例包括含有抗 體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是成形物品例如薄膜或微膠 嚢的形式。持續(xù)釋放的基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙 基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利第3,773,919號(hào))、 L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸 共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖 然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過100 天，但某些水凝膠以較短的時(shí)間段釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)膠嚢包被的抗體留在 體內(nèi)很長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，作為在37。C暴露于水氣的結(jié)果它們可能變性或聚合， 導(dǎo)致生物活性的喪失和免疫原性上的可能的變化。取決于所涉及的機(jī) 制，可為穩(wěn)定提出合理的策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚合機(jī)制是通過硫-二 硫化物互換分子間的S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、從酸性溶 液凍干、控制水分含量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿┖烷_發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組 合物來達(dá)到穩(wěn)定。按照已知的方法對(duì)受治療者例如人類患者施用本發(fā)明的VEGF特 異性拮抗劑，已知方法為例如靜脈內(nèi)施用(諸如為團(tuán)注)或通過一段時(shí) 間的持續(xù)輸注、通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜 內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑施用。如果大量的副作用或毒性與 VEGF拮抗作用有關(guān)，那么局部施用是尤其需要的。離體策略也可被用于治療應(yīng)用。離體策略涉及用編碼VEGF拮抗劑的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化
從受治療者獲得的細(xì)胞。之后將轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞返還給受治療者。細(xì)胞可是各種各樣類型中的任何一種，包括但不限于造血細(xì)胞(例如骨髓
細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)月包或月/L細(xì)胞。
例如，如果VEGF特異性拮抗劑是抗體，那么可通過任何適合的方式來施用抗體，所述方式包括腸胃外的、皮下的、腹膜內(nèi)的、肺內(nèi)的和鼻內(nèi)，以及如果需要局部免疫抑制治療，則在病變處施用。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。此外，抗體適合通過脈沖式輸注，尤其是以逐漸減少的抗體劑量來施用。優(yōu)選地，通過注射，最優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)或皮下注射給藥，這部分地取決于施用是短期的還是長(zhǎng)期的。
在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)腫瘤的病癥或位置允許時(shí)，可例如通過直接注射局部施用VEGF特異性拮抗劑化合物，并且可周期性重復(fù)注射。為了預(yù)防或減少局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，例如休眠肺瘤或微轉(zhuǎn)移的局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，還可對(duì)受治療者在手術(shù)切除腫瘤后對(duì)受治療者系統(tǒng)地遞送VEGF特異性拮抗劑或直接對(duì)腫瘤細(xì)胞例如對(duì)腫瘤或瘤床遞送VEGF特異性拮抗劑。
可選擇地，可將抑制性核酸分子或含有編碼VEGF特異性拮抗劑的核酸序列的多核芬酸遞送至受治療者的適當(dāng)?shù)募?xì)胞。在某些實(shí)施方案中，核酸可遞送至腫瘤本身。
可通過適于所使用的載體的任何方法將核酸引入細(xì)胞中。許多這種方法是本領(lǐng)域中熟知的(如上文Sambrook等人，和Watson等人Recombinant DNA (重組DNA ),第12章，第2版，Scientific AmericanBooks, 1992)?；蜻f送方法的實(shí)例包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、磷酸釣/DEAE葡聚糖法、基因槍和微注射。
IX.組合療法
本發(fā)明還以使用本發(fā)明的兩種或更多的VEGF特異性拮抗劑的組合或至少一種VEGF特異性拮抗劑與一種或多種其它的抗癌療法的組
78合為特征?？拱┋煼ǖ膶?shí)例包括但不限于手術(shù)、放射療法(放射線療法)、
生物療法、免疫療法、化學(xué)療法或這些療法的組合。此外，可與VEGF
特異性拮抗劑組合使用細(xì)胞毒性劑、抗血管生成劑和抗增殖劑。
在 一 個(gè)實(shí)例中，VEGF特異性拮抗劑被用作確定性手術(shù)后非轉(zhuǎn)移性的癌的治療的輔助療法。在這個(gè)實(shí)例中，可與或不與至少一種其它的化學(xué)治療劑一起提供VEGF特異性拮抗劑。
在另 一個(gè)實(shí)例中，VEGF特異性拮抗劑被用作手術(shù)前可手術(shù)的癌的治療的新輔助療法。在這個(gè)實(shí)例中，可在手術(shù)前與或不與至少一種其它的化學(xué)治療劑一起提供VEGF特異性拮抗劑。
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明以VEGF特異性拮抗劑和一種或多種化學(xué)治療劑(例如混合物)的一起使用為特征?；瘜W(xué)治療劑的非限制性實(shí)例包括依立替康、氟尿嘧，定、曱酰四氫葉酸或其任何組合。組合的施用包括使用分開的制劑或單一藥物制劑的同時(shí)施用，和以任一順序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選地有一段時(shí)間兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物活性?？梢勒罩圃焐痰氖褂谜f明書或由熟練醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定使用這種化學(xué)治療劑的制劑和給藥時(shí)間表?；瘜W(xué)療法的制劑和給藥時(shí)間表也描述于Chemotherapy Service (化學(xué)療法服務(wù))，M.C.Perry編輯，Williams&Wilkins, Baltimore, Md.(1992)中?；瘜W(xué)治療劑可在VEGF特異性拮抗劑的施用之前或之后，或與其同時(shí)提供。
的活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性的彼此沒有不利影響的那些。例如可希望在一種制劑中進(jìn)一步提供與EGFR、 VEGF(例如與VEGF上不同的表位結(jié)合的抗體)、VEGFR和ErbB2(例如Herceptin⑧)結(jié)合的抗體。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，VEGF特異性拮抗劑的組合物不包括抗ErbB2抗體或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗體)。可選擇地，或此外，組合物可包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑和/或小分子VEGFR拮抗劑。這些分子以對(duì)所預(yù)期的目的有效的量適當(dāng)?shù)卮嬖谟诮M合中。
為了預(yù)防或治療疾病，VEGF特異性拮抗劑的適當(dāng)?shù)膭┝繉⑷Q于待治療的疾病類型(如上文所定義的)、疾病的嚴(yán)重度和進(jìn)程(無論是為了預(yù)防還是治療的目的而施用VEGF特異性拮抗劑)、之前的療法、患者的臨床史和對(duì)VEGF特異性拮抗劑的響應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷。適合一次性或經(jīng)過一 系列的治療對(duì)患者施用VEGF特異性拮抗劑。在組合療法方案中，將本發(fā)明的VEGF特異性拮抗劑和一種或多種抗癌治療劑以治療上有效或協(xié)同的量施用。如本文所使用的，治療上有效的量是VEGF特異性拮抗劑和一種或多種其他治療劑的聯(lián)合施用或本發(fā)明的組合物的施用導(dǎo)致如上文所描述的癌的減少或抑制的那些量。治療上協(xié)同的量是對(duì)協(xié)同地或顯著地減少或消除與特定疾病相關(guān)的狀況和癥狀來說必需的VEGF特異性拮抗劑和 一種或多種其他治療劑的量。
可以足以減少或消除腫瘤、休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移的發(fā)生或復(fù)發(fā)的量和時(shí)間同時(shí)或依次施用VEGF特異性拮抗劑和一種或多種其他治療劑?？勺鳛榫S持療法施用VEGF特異性拮抗劑和一種或多種其他治療劑以預(yù)防或減少腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。
可將VEGF特異性拮抗劑單獨(dú)包裝或與其他抗癌治療化合物組合包裝為藥盒。藥盒可包括幫助對(duì)患者施用單位劑量的任選的組件例如使粉末形式重新構(gòu)成的小瓶、注射用的注射器、定制的IV遞送系統(tǒng)、吸入器等。此外，單位劑量藥盒可包括組合物的制備和施用的說明書?？蓪⑺幒兄圃鞛橐焕颊咭淮问褂玫膯挝粍┝?、特定患者多次使用(以恒定的劑量或其中個(gè)別化合物可隨療法進(jìn)展在效力上變化)；或者藥盒可包含適于對(duì)多例患者施用的多次劑量("大包裝")。可將藥盒組件集合在紙盒、泡罩包裝(blister pack )、瓶、管以及類似物中。
X.制造品
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有對(duì)上文描述的病癥的治療有用的材料的制造品。制造品包括容器、標(biāo)簽和包裝附頁(packageinsert)。適合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各種材料例如玻璃或塑料形成。容器裝有對(duì)治療疾患有效的組合物并可具有無菌的進(jìn)入孔(access port)(例如容器可是靜脈內(nèi)溶液包或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是抗VEGF抗體。容器上或容器所帶的標(biāo)簽指示組合物被用于治療特別的疾患。制造品可進(jìn)一步包括第二個(gè)容器，該容器含有藥學(xué)上可接受的緩沖劑例如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可進(jìn)一步包括其他出于商業(yè)和使用者立場(chǎng)所需要的材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針和注射器。此外，制造品包括具有使用說明書的包裝附頁，其包括例如關(guān)于不能將組合物與另一種組合物組合使用的警告；或指導(dǎo)組合物的使用者
將抗VEGF抗體組合物單獨(dú)或與抗癌組合物組合對(duì)患者施用。術(shù)語"使用iJi明書"意指通過任何方式，例如以文件的形式諸如以包裝附頁或其他書面宣傳材料的形式提供對(duì)可使用的療法、藥物、治療、治療方案以及類似物的指導(dǎo)。
X.材料的保藏
下列雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), Manassas, VA， USA保藏。
抗體標(biāo)號(hào) ATCC編號(hào) 保藏日期
A4.6.1 ATCCHB-10709 1991年3月29日
實(shí)施例
實(shí)施例l.VEGF-A的抑制導(dǎo)致腸腺瘤生長(zhǎng)的遏止和Apc"^+小鼠的長(zhǎng)期生存
家族性腺瘤性息肉病(FAP)的綜合征和大部分偶發(fā)性結(jié)腸直腸癌是由APC基因中的突變所導(dǎo)致的。除了包括上端胃腸道的硬纖維瘤和腫瘤的結(jié)腸外腫瘤之外，F(xiàn)AP患者在他們的下端胃腸(GI)道中發(fā)育了上百至上千個(gè)腺瘤性息肉。具有密碼子850處的雜合性平截等位基因的Apcmin/、、鼠模擬了具有種系JPC突變的FAP患者的息肉病的某些特征(Moser等人，Sc/e"ce 247:322-324 (1990)， Su等人，S"'置e 256:668-670(1992) )。 Apcmin/、J、鼠中腫瘤形成的開始是在成年早期并且動(dòng)物在C57BL/6的遺傳背景下通常發(fā)育60-150個(gè)腸息肉。腫瘤發(fā)育導(dǎo)致小鼠壽命嚴(yán)重受損，通常在五個(gè)月的年齡左右由于貧血和/或血液蛋白不足導(dǎo)致死亡(Moser等人，5We"ce 247:322-324 (1990))。盡管患有FAP的人類通常發(fā)育結(jié)腸腺瘤，但是Apc"^+小鼠由于還未充分了解的原因而在小腸中發(fā)育絕大多數(shù)的息肉。這些息肉達(dá)到直徑l-2mm的大小，而越大的息肉(直徑多達(dá)4mm)以越低的頻率出現(xiàn)。只偶爾觀察到結(jié)腸 腺瘤，通常每只動(dòng)物0-3個(gè)。
已經(jīng)報(bào)道Apc參與包括增殖、凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、微管組 裝、信號(hào)傳導(dǎo)和染色體分離的細(xì)胞過程(在Nathke， i ev. Ce〃. Z)ev.
歷o/. 20:337-366 (2004)中綜述)。Apc的研究最徹底的功能是它作為Wnt 信號(hào)通路上)S-連環(huán)蛋白的調(diào)節(jié)子的作用(在Nathke， Mo/.尸W/w/. 52:169-173 (1999)中綜述)。簡(jiǎn)單地說，在缺少Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下， Apc與軸蛋白(axin)和GSK-3/5激酶結(jié)合以形成細(xì)胞質(zhì)的/3-連環(huán)蛋白的 破壞性復(fù)合體，由此阻止其核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄因子的T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng) 因子(TCF/LEF)家族的隨后的活化。TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)包括參與上 文提到的細(xì)胞通路的分子。
研究異種移植物中腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制有一些缺陷，因?yàn)檫@些模型不能 再現(xiàn)自然環(huán)境下的肺瘤發(fā)育。為了檢驗(yàn)抗血管生成療法對(duì)自然發(fā)生的遺 傳上易患的非惡性肺瘤模型的作用，我們研究了腸腺瘤病的Apc"^+模 型。在下列實(shí)施例中，在用示例性的VEGF特異性拮抗劑即抗VEGF-A mAb進(jìn)行短期和長(zhǎng)期的處理后以及在腸上皮細(xì)胞中通過Cre-LoxP技術(shù) 將VEGF-A遺傳缺失后分析Apcmin 、鼠的腫瘤表型。
為了下文所描述的實(shí)驗(yàn)，,人The Jackson Laboratory(Bar Harbor， ME)獲得Apc誦 、鼠(庫(kù)存編號(hào)002020, 5 )和12.4KbVilCre小鼠(庫(kù) 存編號(hào)004586，此后為VillinCre, Madison等人，,CAew. 277:33275-33283 (2002))。之前已經(jīng)^>開了 VEGF'。x/1°x小鼠(以后為 VEGF'。x)(Gerber等人，畫"26:1149-1159 (1999))。將小鼠圈 養(yǎng)在屏障設(shè)施中的微隔離器籠子(micro isolator cage )中并隨意喂食。 按照聯(lián)邦政府規(guī)章和Institutional Animal Care and Use Committee (實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物管理與使用委員會(huì))所批準(zhǔn)的進(jìn)行動(dòng)物的養(yǎng)護(hù)和實(shí)驗(yàn)方案。
Apc"^+腸腺瘤中VEGF-A的表達(dá)
為了研究Apc誦"小鼠的腸腫瘤中VEGF-A的表達(dá)模式，我們?cè)趤?自14周大的小鼠的腺瘤上進(jìn)行了原位雜交。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)來說，如早 前所描述的進(jìn)行原位雜交(Ferrara等人，j附.丄尸a組162:1881-1893 (2003))。簡(jiǎn)單地說，將中性緩沖的福爾馬林固定的、脫水的、并且石
82蠟包埋的腸組織切片在于37°C 20]Lig/ml蛋白酶K中脫蛋白15分鐘之前 脫石蠟并水合。將["P]UTP標(biāo)記的有義和反義RNA探針(riboprobe)于 55。C雜交過夜，之后于55。C在O.IX的標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽鹽水中高嚴(yán)緊性清 洗2小時(shí)。將干燥的載玻片于室溫暴露于Kodak BioMax MR放射自顯 影膠片(Eastman Kodak Co., Rochester, NY)3天，之后將膠片泡在NTB2 核徑跡乳膠(Eastman Kodak Co.)中，于4。C在含有干燥劑的密封的塑 料載玻片盒中曝光28天，顯影，并用(蘇木素伊紅)H&E復(fù)染。如之前 所描述的制備VEGF-A探針(Ferram等人.爿m. P^/w/. 162:1881-1893 (2003))。相應(yīng)于NM—031836的核苷酸297-645， VEGF-A探針長(zhǎng)度為 349個(gè)核苦酸。上游引物序列為5，-CAACGTCAC TATGCAGATCAT GCG (SEQ ID NO: 1);下游引物序列為5，-GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTGAG(SEQIDNO: 2)。
在這些原位雜交實(shí)驗(yàn)中，與正常腸絨毛上皮細(xì)胞相比在上皮細(xì)胞中 觀察到具有不同強(qiáng)度的VEGF-A表達(dá)，同時(shí)在腺瘤的基質(zhì)細(xì)胞以及正常 絨毛的基質(zhì)中觀察到焦點(diǎn)突出的信號(hào)(圖IA-F)。
VEGF-A的抑制降低Apcmin/、J、鼠的腫瘤負(fù)荷
為確定抗VEGF-A療法對(duì)降低小鼠中良性腸腫瘤的腫瘤負(fù)荷是否 有效，我們用以小鼠-人類嵌合形式(以降低誘發(fā)免疫響應(yīng)的可能性) 的抗VEGF-A的mAb G6-31處理了 Apc"^+小鼠?？筕EGF-A的mAb G6-31來自如(Liang等人.編.C/^w. 281 :951-961 (2006))所描述的人 類Fab噬菌體文庫(kù)。為產(chǎn)生適于在小鼠中長(zhǎng)期施用的抗體，將可變結(jié)構(gòu) 域接枝到鼠科IgG2a恒定結(jié)構(gòu)域中。將mAb G6-31 ( Liang等人，所o/. C/zem. 281 :951-961 (2006))或同種型匹配的對(duì)照鼠科IgG2a(抗GP120 ) 都以5 mg/kg的劑量以溶于PBS中90-140 /xl的體積每周一次腹膜內(nèi)施 用。將處理持續(xù)3周、6周、直到一年，或直到發(fā)現(xiàn)小鼠瀕死。在91士3 天大時(shí)開始每一組5-14只小鼠的處理。
我們選擇mAb G6-31是由于它強(qiáng)有力地阻斷小鼠和人類VEGF-A 的能力(Liang等人，,飾/. CAem. 281:951-961 (2006))。這與抑制人類 但不抑制小鼠VEGF-A的良好表征的抗VEGF的mAb A.4.6.1不同 (Gerber等人，Omcer T 仏60:6253-6258 (2000)， Liang等人，,歷o/.C&m. 281 :951-961 (2006))。為了評(píng)估m(xù)AbG6-31對(duì)肺瘤負(fù)荷的短期影 響，在十三周大時(shí)開始每組IO只小鼠的處理并持續(xù)3或6周。為了確 定處理開始時(shí)年齡的肺瘤表型，在十三周大(第0天)時(shí)分析未處理的 對(duì)照組的十二只小鼠。
用抗VEGF-A的mAb處理3或6周顯著降低了 Apcmm/、、鼠中的總 腫瘤負(fù)荷。第O天時(shí)，Apcmin/、J、鼠的平均肺瘤負(fù)荷是39.3 mm3 (從12.3 mn^變化到97.0 mm3)(圖2A )。用對(duì)照IgG處理三周的小鼠的平均肺 瘤負(fù)荷為96.8mm3 ( 47.1-299.9 mm3),而用mAb G6-31處理3周的小 鼠的平均腫瘤負(fù)荷是23.5 mm3 (4.5-58.2 mm3 )。當(dāng)mAb G6-31處理時(shí) 平均腫瘤負(fù)荷具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的76%的減少或減至1/4， p<0.008。用 對(duì)照IgG施用6周后，腫瘤負(fù)荷達(dá)到198.6 mmS的平均值(40.5-315.7 mm3),而用mAb G6-31處理的小鼠中的肺瘤負(fù)荷依舊低至28.4 mm3 (3.2-75.9 mm3 )，表現(xiàn)出平均肺瘤負(fù)荷上的顯著的86%的減少或減至 1〃， p<5.3xl(T5 (圖2A)。
相對(duì)于腺瘤數(shù)目下降，用mAb G6-31處理三和六周之后腫瘤負(fù)荷 的顯著下降是由于腺瘤大小下降。用對(duì)照IgG處理三周后，平均腫瘤數(shù) 目是116±9(±SEM)，而mAb G6-31施用后平均腫瘤數(shù)目是 107±ll(p<0.28)。用對(duì)照IgG處理六周后，平均腫瘤數(shù)目是120±11，而 mAb G6-31施用后它是100±10(p<0.09)。在第0天時(shí)，小鼠具有100土9 個(gè)肺瘤的平均值。
為了分析腫瘤大小和數(shù)目，將從腺胃至直腸的腸道縱向打開，漂洗 并平展在濾纟氏上。用Notox Histo固定劑(Scientific Design Laborator Inc.， Des Plaines, IL)固定過夜并用亞曱基藍(lán)0.1%的水溶液染色后，小腸和 大腸的每個(gè)腸腺瘤的數(shù)目、位置和直徑由單一的對(duì)處理不知情的觀察者 在Leica解剖顯微鏡上20X的放大倍數(shù)下通過目鏡比例尺計(jì)數(shù)。通過這 一方法，可靠地記錄具有0.3 mm或更大的直徑的息肉。以半球計(jì)算胂 瘤體積。將每只小鼠的腫瘤負(fù)荷計(jì)算為其腫瘤體積的總和。用雙尾的 Student's t檢驗(yàn)計(jì)算P值。作為抗體處理的小鼠的對(duì)照，在處理開始的 年齡(13周)時(shí)分析非處理組的小鼠(第O天)。
沒有在3或6周的處理期間腺瘤生長(zhǎng)4來過抗VEGF-A處理的證據(jù)
84與用對(duì)照IgG處理的小鼠的肺瘤的較寬的大小分布(圖2B,從頂部起 第二和第四個(gè)圖示)相比，用mAb G6-31處理的小鼠中的腫瘤具有更 緊密的大小分布(圖2B，中間和下部圖示)。用對(duì)照IgG施用三周的小 鼠中平均息肉直徑是1.28 mm以及用mAb G6-31的是0.85 mm
(p<9.2xl(Tm)，而用對(duì)照IgG施用六周的小鼠中平均息肉直徑是1.64 mm以及用mAb G6-31的是0.86 mm ( p<2.7xl(T214 )。第0天時(shí)平均肺 瘤直徑是0.97mm。
有趣的是，抗VEGF-A處理似乎抑制所有大小的腫瘤的生長(zhǎng)。使用 mAb G6-31的3周處理之后，小肺瘤(直徑0.3-1.0 mm,對(duì)于6周處理， 0.3-1.2 mm)的頻率比對(duì)照處理的組中的高，而具有大于1.0 mm直徑
(對(duì)于6周，〉1.2mm)的腫瘤的頻率降低了 (圖2C，頂部和中部圖示)。 與第0天時(shí)胂瘤大小分布(圖2C,底部圖示)的比較表明在mAbG6-31 的施用開始時(shí)腺瘤的生長(zhǎng)已經(jīng)基本上被遏止。
而且，抗VEGF-A的mAb G6-31對(duì)抑制所有小腸區(qū)域內(nèi)的腺瘤生 長(zhǎng)是有效的。在三和六周的治療后，與對(duì)照IgG處理相比在mAbG6-31 處理時(shí)觀察到顯著降低的平均腫瘤直徑(圖2D)。此外，在用mAbG6-31 處理的小鼠的第一腸四分之一區(qū)中的平均腺瘤直徑從第0天時(shí)的小鼠 中觀察到的(圖2D中的雙星號(hào))顯著降低。結(jié)腸腺瘤的平均腫瘤直徑 的減少未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性(圖2D)。用mAb G6-31處理三周的小鼠中 大腸息肉的平均直徑是1.3±0.3 mm(士SEM)，而對(duì)照IgG處理的小鼠中 的平均直徑是2.5土0.4mm,具有p<0.064。 mAb G6-31處理六周后的大 腸肺瘤的平均直徑是2.2±0.3 mm以及用對(duì)照IgG施用后的是2.6±0.3 mm，具有p<0.37。
腸上皮細(xì)胞中VEGF-A的缺失減小平均胂瘤直徑 我們接下來將會(huì)仔細(xì)研究在Apc"^+模型中來自腸上皮細(xì)胞來源的 VEGF-A對(duì)腺瘤發(fā)育的貢獻(xiàn)。為了這一目的，如上文所描述的，在13 周大的Apc"^+小鼠中評(píng)估了腫瘤直徑和數(shù)目，所述小鼠與其中在腸上 皮細(xì)胞中用Cre/loxP技術(shù)有條件地缺失了 VEGF-A的小鼠(VEGF1。、 Villin-Cre小鼠)雜交。在十三周大時(shí)分析Apcm,n/+; Villin Cre和Apcm,n/+; VEGF|0X; Villin隱Cre小鼠。
85絨毛蛋白(肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和專門的吸收細(xì)胞的刷狀緣的主要結(jié) 構(gòu)組分)的表達(dá)在腸的后腸內(nèi)胚層中的胚胎發(fā)生期間開始，并之后延伸
穿過小腸和大腸的內(nèi)胚層(Braunstein等人，Dev. D，. 224:90-102 (2002), Ezzell等人，i)eve/o/wze^/ 106:407-419 (1989)， Maunoury等人, ￡MS(9 7:3321- 3329 (1988)以及Maunoury等人，Deve/op附e"Z 115:717-728 (1992))。在成體中，絨毛蛋白分布隨著隱窩的未成熟的增 殖的細(xì)胞中溫和頂端極化和襯在小腸絨毛里的完全分化的細(xì)胞的刷狀 緣中的強(qiáng)極化而變得彌漫(Robine等人，尸rac. TV"http://.爿caA 82:8488-8492 (1985))。先前已經(jīng)表征了由絨毛蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重 組酶(Villin-Cre)的表達(dá)，再現(xiàn)了在從隱窩到絨毛尖端以及十二指腸至 結(jié)腸的腸的上皮的每一個(gè)細(xì)胞中的絨毛蛋白基因的表達(dá)模式Madison 等人，,所o/. CAem. 277:33275-33283 (2002)。
表型分析顯示對(duì)照Apcmm/+; Villin-Cre小鼠的平均腫瘤直徑是 1.02土0.3mm(士SEM)，而Apcmm/+; VEGF'°X; Villin-Cre小鼠的平均腫瘤 直徑是0.82士0.3mm (圖2E),顯示了 19.8。/o的減少(p〈7.2 x 1(T5)。兩組 間腫瘤數(shù)目沒有顯著的差異。當(dāng)Apcmin/+; Villin-Cre小鼠具有137±11 個(gè)腸腺瘤時(shí)，Apcmm/+; VEGFlox; Villin-Cre小鼠具有150±17個(gè)腺瘤 (p<0.27 )。
這些數(shù)據(jù)表明從十二指腸至結(jié)腸以及隱窩到絨毛尖端的所有腸上 皮細(xì)胞中的VEGF-A的缺失導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制，盡管與從抗 VEGF-A抗體的系統(tǒng)施用得到的抑制相比程度下降。因此，這些數(shù)據(jù)暗 示了上皮外來源的VEGF-A對(duì)Apcmm/+小鼠的腸腺瘤的生長(zhǎng)有貢獻(xiàn)。
VEGF-A的抑制延長(zhǎng)了 Apc"^+小鼠的中值生存期
考慮到抗VEGF-A治療在腫瘤生長(zhǎng)抑制中的效力，我們想要研究使 用mAbG6-31的處理是否能為Apc"^+小鼠產(chǎn)生長(zhǎng)期益處。為了這一 目 的，將mAbG6-31或?qū)φ誌gG的施用持續(xù)直到52周或直到觀察到小鼠 瀕死。有趣的是，mAbG6-31處理將中值生存期從使用對(duì)照IgG的24.0 周增加到使用mAbG6-31的33.6周，具有時(shí)序p〈2.4x l(T3 (圖2F )。
當(dāng)在32、 51、 64或66周(分別地在用mAb G6-31處理19、 38、 51或53周后)的年齡安樂死后分析用mAbG6-31處理的四只小鼠的腫瘤表型。如表l中所示，平均肺瘤直徑依舊在與在十九周大的小鼠中所
見的水平接近的水平(用對(duì)照IgG處理六周的小鼠中為1.64 mm)。同 樣地，腫瘤數(shù)目依舊與十三周大的小鼠的腫瘤數(shù)目相當(dāng)(第0天組小鼠 具有59-161個(gè)腸腺瘤以及IOO的平均值)。組織分析中切片的平面上發(fā) 現(xiàn)的十五個(gè)結(jié)腸腺瘤(小鼠1-4中鑒別的總數(shù)目)中的三個(gè)(表l的第 2、 3和4號(hào)小鼠各一個(gè))顯示沒有惡性的轉(zhuǎn)變。
表l.關(guān)于G6-31長(zhǎng)期處理的小鼠的腫瘤數(shù)據(jù)
小鼠_年齡(周)使用G6-31的周數(shù) 腫瘤數(shù)目 平均腫瘤直徑(mm)腫瘤負(fù)荷(mm3)
^ ^ 5!ii ^~6.3
2 51 38 133 1.72 263.5
3* 64 51 85 2.21 3". 1
4* 66 53 150 1.63 382.2
*實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)被安樂死的健康的動(dòng)物
總的來說，長(zhǎng)期的抗VEGF-A處理通常是良好耐受的并產(chǎn)生了增加 的Apc"^+小鼠的生存期。而且，與新的腺瘤形成和腺瘤生長(zhǎng)的抑制一 致，鑒于小鼠年齡，用mAb G6-31長(zhǎng)期處理的小鼠中腫瘤數(shù)目和平均 肺瘤直徑保持得非常低。
在用抗VEGF-A處理的Apc"^+小鼠中正常的血清總蛋白、白蛋白 和三酸甘油酯水平以及減少的脾髓外造血作用
如通常觀察的，用mAbG6-31處理的Apc隱"小鼠比用對(duì)照IgG處 理的小鼠顯得更加警覺和敏感得多。而且在用對(duì)照IgG處理的動(dòng)物中有 規(guī)律地觀察到蒼白的爪，使得聯(lián)想到最初由Moser等人報(bào)道的進(jìn)行性貧 血(Moser等人，Sc&"ce 247:322-324 (1990))，但在用mAbG6-31處理的 動(dòng)物中未觀察到。與該觀察結(jié)果相符的，用對(duì)照IgG施用的Apcmin/N、 鼠的平均總血清蛋白和血清白蛋白下降，而用mAb G6-31處理的小鼠 中總蛋白和白蛋白水平處于正常范圍內(nèi)(表2)。表2.血清化學(xué)
總蛋白(g/dl廣
白蛋白(g/dl)'
對(duì)照IgG 3周 G6-31 3周 i
對(duì)照IgG 6周 G6-31 6周 i
3.7±0.2 4細(xì).2 3細(xì).3 4.9±0,1
1細(xì).1 2.6±0.1 1.6±0.2 2.7±0.1
268.9±82.5 75.5±4.9
591'1±81.3 71.1±4.3
*參考值3.9-5.5 g/dl **參考值2.3-3.2 g/dl ***參考值35-244 mg/dl ±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)
如關(guān)于Apc匪"小鼠所報(bào)道的(Moser等人，Sc&"ce 247:322-324 (1990))并與血液蛋白不足一致，在用對(duì)照IgG處理的動(dòng)物中，平均三 酸甘油酯水平升高了，然而當(dāng)用mAb G6-31處理時(shí)它被降低至與參考 值相當(dāng)?shù)乃?表2)。
盡管在三或六周的處理后，體重上沒有與處理相關(guān)的差異，但在用 對(duì)照IgG處理的小鼠中平均的脾的質(zhì)量顯著增加(p<2.3x lCr3)。在用 對(duì)照IgG施用三周后，小鼠具有0.26g或體重的1.17%的平均脾質(zhì)量， 而用mAb G6-31處理三周的小鼠中的平均脾質(zhì)量是0.11 g (體重的 0.49%)。用對(duì)照IgG處理的小鼠中平均脾質(zhì)量的增加與髓外造血作用 (EMH，補(bǔ)償性紅細(xì)胞生成，在這一實(shí)例中繼發(fā)于腸出血) 一致，其 通過脾的組織學(xué)檢查來確認(rèn)。用對(duì)照IgG處理6周的十只小鼠中的十只 顯示出顯著的EMH，而用mAb G6-31處理的兩只小鼠具有中度的EMH， 五只具有輕微的EMH,和三只在它們的脾中沒有診斷變化。用mAb G6-31處理18至53周的五只小鼠中的四只被診斷為脾中輕微到廣泛的 EMH。
用mAb G6-31短期處理的小鼠的脾中的較低程度的EMH說明抗 VEGF-A療法具有對(duì)減少腸出血的有利的影響。 用mAbG6-31長(zhǎng)期處理后腎的變化
為了研究與施用高親和力抗VEGF-A的mAb G6-31相關(guān)的可能的 毒性，在短期(3-6周)和長(zhǎng)期(18-53周)處理后對(duì)胰腺、肝和腎進(jìn) 行了組織學(xué)分析。為了進(jìn)行組織學(xué)分析，將Notox固定的腸組織脫水并包埋在石蠟中，切片并用H&E染色以便按標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行組織學(xué)分析。
在處理3-6周的動(dòng)物中未注意到顯著的毒性。用mAbG6-31長(zhǎng)期處 理后，五只小鼠中的五只顯示出可變的(輕微到嚴(yán)重)的彌散性球性腎 小球硬化(diffuse global glomerulosclerosis)和中度的胰腺的基質(zhì)水腫 (反映血液蛋白不足)。這些觀察結(jié)果與之前由于長(zhǎng)期施用mAb G6-31 所觀察到的毒性一致。重要地，由增加的中值生存期反映的健康的總體 改善超過副作用。
mAb G6-31處理時(shí)改變的腫瘤形態(tài)學(xué)并未伴隨增殖指數(shù)上的變化
為了進(jìn)一步表征使用抗VEGF-A的mAb G6-31處理后Apcmin/M、鼠 中的腸息肉，如上文所描述的進(jìn)行了肉眼可見的和組織學(xué)的分析。用 mAb G6-31處理的息肉的總體形態(tài)學(xué)與用對(duì)照IgG處理的息肉的總體 形態(tài)學(xué)顯著不同(圖3A-B)。盡管來自用對(duì)照IgG施用的小鼠的腫瘤通 常具有相對(duì)完好的光滑的表面，但是來自用mAb G6-31處理的動(dòng)物的 腫瘤在其表面上顯出具有深的內(nèi)陷。組織學(xué)分析表明來自mAb G6-31 和對(duì)照IgG處理的小鼠的腫瘤是管狀腺瘤(圖3C-F)。來自用對(duì)照IgG 處理的小鼠的腺瘤具有顯著的絨毛內(nèi)上皮增殖，垂直和側(cè)向延伸，并且 通常從其底部(base)到腔表面增寬超過兩倍。有最小量的纖維基質(zhì)。 來自用mAb G6-31處理的小鼠的腺瘤特性地具有較少的絨毛內(nèi)上皮細(xì) 胞，在腔表面處寬度較窄，較淺并涉及較少的鄰近的絨毛。兩種處理組 中的結(jié)腸息肉的組織學(xué)分析顯示出具有大量纖維血管基質(zhì)和不同量(多 至100%)的發(fā)育異常的上皮的有蒂的(pendu畫lated )管狀腺瘤。
為了評(píng)估腫瘤組織和正常粘膜中的增殖的程度，進(jìn)行了使用Ki-67 抗體的間接的免疫組織化學(xué)染色(圖3G-J)。為了這些實(shí)驗(yàn)，將Notox 固定的、脫水的和石蟲普包埋的腸組織切片于99 °C在Target Retrieval (DAKO， Glostmp, Denmark)中孵育之前脫石蠟并水合，隨后終止內(nèi)源 的過氧化物酶活性并阻斷抗生物素蛋白和生物素(Vector, Burlingame, CA)。將切片進(jìn)一步用溶于PBS的具有3%牛血清白蛋白的10%的封閉 血清封閉30分鐘。將組織切片與稀釋于封閉血清中的第一抗體孵育60 分鐘，用TBST緩沖液(DAKO)清洗并與第二抗體孵育30分鐘，用 TBST清洗并于ABC Elite Reagent (Vector)中孵育30分鐘，之后在金屬?gòu)?qiáng)化DAB (Pierce， Rockford, IL)中孵育并用Mayer氏蘇木素復(fù)染。所 使用的第一抗體是兔多克隆的抗Ki-67 (SP6， 1 : 200, Lab Vision, Fremont, CA)。所使用的第二抗體是生物素化的山羊抗兔(7.5/xg/ml， Vector )。于室溫進(jìn)行所有步驟。
在來自用對(duì)照IgG或用mAb G6-31處理的小鼠的肺瘤中，凄t量分 析顯示相似量的Ki-67陽性細(xì)胞。同樣，在兩種處理之間正常的鄰近的 粘膜的增殖指數(shù)相當(dāng)(圖3K)。從使用Ariol SL50載玻片掃描顯微鏡系 統(tǒng)(Applied Imaging, Inc.， San Jose， CA)獲得的腫瘤組織和正常粘 膜的5 /mi的石蠟切片的圖像利用Kisight測(cè)定(Ariol Review (v2.6))定 量增殖指數(shù)。由不知情的檢查者人工鑒別并劃定腫瘤組織和正常粘膜的 區(qū)域。將測(cè)量為Ki-67陽性細(xì)胞核相對(duì)于總細(xì)胞核的百分比的增殖指數(shù) 按照陽性閾值的定義基于細(xì)胞核顏色以半自動(dòng)的方式定量。增殖指數(shù)測(cè) 量包括都處理6周的mAb G6-31處理組(11=3)中的29個(gè)肺瘤和對(duì)照IgG 組(n=3)中的44個(gè)腫瘤的分析。
為了檢測(cè)通過mAb G6-31的生長(zhǎng)抑制是否伴隨著主要信號(hào)傳導(dǎo)通 路的分子部分的表達(dá)水平上的變化，進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。將空腸腺 瘤和正常鄰近的粘膜用外科手術(shù)刀從mAb G6-31和對(duì)照抗體處理的小 鼠采集并用OMNITH115勻漿器在RIPA裂解緩沖液中機(jī)械勻漿。所使 用的第一抗體是兔多克隆的抗p38 MAPK、磷-p38 MAPK、 p42/p44 MAPK、磷-p42/p44 MAPK、 PTEN、 Akt、磷畫Akt和磷-GSK3o;/iS (均為 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA )。所使用的第二抗體是辣根過 氧化物酶4厄合的抗兔(1: 5000， Chemicon)。
盡管用mAb G6-31處理時(shí)許多所測(cè)試的分子的表達(dá)水平保持不變， j旦觀察到四個(gè)腫瘤樣品中的三個(gè)中的磷(phospho ) -p38 MAPK水平向 在正常粘膜中所發(fā)現(xiàn)的水平的適度復(fù)原(圖3L; p-p38,將T5-T8與 N5-N8對(duì)比)。
mAb G6-31處理的肺瘤中血管密度降低
考慮到已知VEGF-A是經(jīng)由VEGFR-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的 促細(xì)胞分裂原，我們通過以抗CD31的抗體對(duì)厚組織切片的免疫組織化 學(xué)染色在用Mab G6-31和對(duì)照IgG處理的小鼠中檢查腫瘤的血管網(wǎng)絡(luò)(圖4A-B )。為了共焦顯微成像的目的，將小鼠用溶于PBS的1%的多 聚曱醛(PFA)在異氟烷(isofluorane)麻醉下灌注固定，將腸道平展 在濾紙上，并在包埋于O.C.T.并在干冰上冷凍之前用4%的PFA固定并 于4。C在溶于PBS的30%蔗糖中浸沒過夜。以80 /mi進(jìn)行凍干切片，在 4%的PFA中固定10分鐘，用溶于PBS的0.2% Triton-X-lOO透化，并 用溶于含有0.2% Triton-X-lOO的PBS的5%正常的山羊血清封閉30分 鐘。將第一抗體在封閉緩沖液中孵育過夜，第二抗體5-6小時(shí)，用PBS 清洗并用Hoechst 33342 (0.5 mg/ml; Sigma, St. Louis， MO)復(fù)染。所使 用的第一抗體是倉(cāng)鼠單克隆抗CD31 ( 1: 500, Chemicon， Temecula， CA)、大鼠單克隆4元E-4丐粘蛋白(1: 2500, Zymed， South San Francisco, CA)和Cy3軛合的小鼠單克隆抗平滑肌肌動(dòng)蛋白(1: 1000, Sigma)。所 使用的第二抗體是Cy5軛合的抗亞美尼亞倉(cāng)鼠(1: 500, Jackson Immunoresearch， Cambridgeshire, UK)和ALEXA488舉厄合的抗大鼠(1: 500, Molecular Probes, Eugene， OR)。
從用CCD照相機(jī)在Zeiss Axioplan2焚光顯微鏡(Thornwood, NY ) 上獲得的數(shù)字圖像中定量來自Apc"^+小鼠的腫瘤中的血管密度。四組
(用對(duì)照IgG或mAb G6-31處理3或6周的小鼠)中的每一組由兩只 小鼠組成，并且分析了來自每組的11-22個(gè)胂瘤。使用ImageJ v.1.36 (http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)經(jīng)由CD31陽性熒光的基于閾值的分,殳計(jì)算 80/mi的腫瘤切片中的血管面積。之后將血管密度計(jì)算為CD31陽性像 素比總體肺瘤面積的比率。將來自每一組的所有腫瘤的值平均以產(chǎn)生組 的平均值。
血管密度的定量顯示與在對(duì)照IgG處理的小鼠中所見的相比，來自 mAbG6-31處理的小鼠的胂瘤的血管部分減少(圖4C )。用對(duì)照IgG施 用三周后平均腫瘤血管面積密度是23.2%，而用mAbG6-31施用后它降 低至18.6%。用對(duì)照IgG處理六周的腫瘤的平均血管面積是25.5%,而 來自用mAb G6-31處理的小鼠的肺瘤的平均血管面積密度是19.7%。
討論
我們使用Apc,〃小鼠以研究VEGF-A在良性腸肺瘤發(fā)生中的作 用。在第一部分，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以測(cè)量短期和長(zhǎng)期抗VEGF-A處理對(duì)經(jīng)歷茁壯生長(zhǎng)的建成的腸腺瘤的作用。我們已經(jīng)展示了用抗VEGF-A的mAb G6-31處理顯著降低了肺瘤負(fù)荷并延長(zhǎng)了 Apc"^+小鼠的生存期。
已經(jīng)對(duì)飲食和化學(xué)預(yù)防劑包括非甾體抗炎藥物(NSAID )對(duì)Apcmin/+ 小鼠的腫瘤負(fù)荷的作用進(jìn)行了若干研究(綜述于Corpet等人，Oz"cw 五; zWem/0/. Bz》marA:e^ ZVev. 12:391-400 (2003)中)，http:〃corpet.net/min 有其最新的列表。這些研究中的許多報(bào)道了腫瘤數(shù)目上的顯著下降。除 了選擇性的COX-2抑制劑例如塞來昔布(Jacoby等人，Ca"cw 60:5040-5044 (2000))和A-285969 (Wagenaar-Miller等人，5r. Ca"cw 88:1445-1452 (2003))， NSAID例如吡羅昔康和舒林酸(其以COX-l和 COX-2為靶)在抑制Apc"^+小鼠中腫瘤形成的最強(qiáng)有力的劑之中
(Boolbol等人，Oz"cwW&y. 56:2556-2560 (1996)， Chiu等人，Ca"cwi as. 57:4267-4273 (1997), Hansen-Petrik等人，Ozwcw175:157-163 (2002), Ritland等人，Qzn:/"oge"&^ 20:51-58 (1999))。還已經(jīng)成功地使 用聯(lián)合治療降低肺瘤數(shù)目。Torrance等人利用特異的表皮生長(zhǎng)因子受體 抑制劑EKI-785與舒林酸組合并顯示了幾乎完全消除肺瘤數(shù)目
(Torrance等人，Ato. 6:1024-1028 (2000))。同樣地，化學(xué)治療劑 雷替曲塞(RTX)和5-氟尿嘧啶(FU)的聯(lián)合作用導(dǎo)致Apc"^+腫瘤數(shù) 目的顯著(37% )的降低(Murphy等人，C騰w腸/. 77^ 3:1169-1176 (2004))。最近，受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑AZD2171的短期施用 顯示出在Apc誦"模型中減少肺瘤負(fù)荷(Goodlad等人，Cara'"oge"esz、 27:2133-2139 (2006))。他們注意到使用AZD2171的較早處理開始(在 6周時(shí))能夠減少腫瘤數(shù)目，而較晚的干預(yù)(在10周時(shí))僅減小腫瘤 大小(Goodlad等人，如上)。然而，處理對(duì)血管密度沒有作用(Goodlad 等人，如上)。AZD2171抑制若干RTK，包括但不限于VEGFR-1、 -2 和-3 ( Wedge等人，Ca"cw 7 仏65:4389-4400 (2005))。
我們觀察到在13周時(shí)施用的抗VEGF-A的Mab G6-31沒有減少現(xiàn) 有的肺瘤的數(shù)目，但它減少了腫瘤大小并似乎抑制了新腺瘤的形成。這 些結(jié)果與生存期上觀察到的增加相關(guān)。然而，我們相信抗VEGF特異性 腫瘤預(yù)防方法(處理開始較早)可能可比我們的研究中所使用的腫瘤干 預(yù)方法(處理開始較晚)更有效地減少腫瘤數(shù)目是可能的。無論如何，
92抗VEGF特異性抑制在肺瘤生長(zhǎng)的所有時(shí)期都有效。
我們的研究最后顯示，靶向VEGF-A在Apc"^+模型中足以獲得深 切的治療效果。以MabG6-31系統(tǒng)的VEGF-A抑制與Apcmm/+; VEGF1(5X; Villin -Cre小鼠中僅在腸上皮區(qū)室中對(duì)VEGF-A的遺傳缺失的對(duì)比表明 除了上皮細(xì)胞之外，其他細(xì)胞來源的VEGF-A在Apc"^+腺瘤生長(zhǎng)中起 到重要作用。VEGF-A的這些其他的來源可能包括單核細(xì)胞(Sunayama 等人，Ozra'"oge"&^ 23: 1351-1359 (2002))和基質(zhì)成纖維細(xì)胞(Seno 等人，7 仏62:506-511 (2002)， ( Williams等人，/"ve" 105 :1589-1594(2000))。我們的原位分析顯示出腺瘤和正常絨毛中上皮 外的VEGF-A表達(dá)，支持所述觀察結(jié)果。
基于大量的數(shù)據(jù)，可想到大量所觀察到的mAb G6-31的抗腫瘤效 果是由血管生成的抑制介導(dǎo)的(Wise等人，A^/. v4caA Scz' 96:3071-3076 (1999), Zachary等人，CaW/owwc 49:568-581 (2001))。 事實(shí)上，已經(jīng)在腫瘤異種移植研究中觀察到響應(yīng)抗VEGF-A單克隆抗體 的血管供給減少(Borgst腿等人，35: 1-10 (1998))。與這相一 致，與來自用對(duì)照IgG處理的小鼠的腫瘤相比，mAbG6-31施用三和六 周后觀察到Apc"^+腸腺瘤的血管面積密度上的減少。
當(dāng)VEGF-A抑制時(shí)所觀察到的小于lmm的腺瘤的顯著的累積表明 在Apc"^+小鼠的腸腺瘤中，如同已在Apc""模型中所見的，血管生成 開關(guān)(angiogenic switch)可發(fā)生得比通常所認(rèn)為的腫瘤發(fā)育的血管生 成開關(guān)更早(Seno等人，C羅"&s. 62:506-511 2002))。
我們的研究中重要的并出人意料的結(jié)論是靶向單一的血管生成因 子的抗血管生成的單一療法能高效的抑制腫瘤生長(zhǎng)并能產(chǎn)生生存益處。 這似乎與最初從惡性腫瘤的研究中所了解的這種療法的主要益處是使 腫瘤血管"正?；?，以便促進(jìn)化學(xué)療法的遞送的觀點(diǎn)(Jain等人，A^. 7:987-989 (2001))不同。可以想到，良性腫瘤獲得突變的傾向減少可能 產(chǎn)生治療抗性，這至少可在某種程度上解釋差異。因此，我們的數(shù)據(jù)表 明了不需要化學(xué)治療劑的非手術(shù)治療良性腫瘤的可能性。
實(shí)施例2.在多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤的小鼠模型中抗VEGF-A單 隆抗體抑制垂體腺瘤的生長(zhǎng)并降低血清催乳素和生長(zhǎng)激素水平
多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MEN)是一種特征為涉及兩個(gè)或更多內(nèi)分泌 腺發(fā)生腫瘤的病癥。當(dāng)鑒定了曱狀旁腺、胰島細(xì)胞和垂體前葉中腫瘤的 聯(lián)合發(fā)生時(shí)，將患者分類為1型MEN (MEN1)。發(fā)現(xiàn)一般導(dǎo)致蛋白 menin的平截或缺乏的M￡iV7基因中的突變引起了所述病癥(綜述于 Pannett等人，五m/ocr 6:449-473 (1999)中)。隨著關(guān)于腫瘤
中其余的等位基因的頻繁缺失的更多發(fā)現(xiàn)(Bystrom等人，尸rac. AAw/. Jcfld. "72 (7990」，Debelenko等人，Ca"cer
57:2238-2243 (1997), Larsson等人，A^mm 332:85-87(1988)), M五iW 已被分類為腫瘤抑制基因。盡管MEN1作為常染色體顯性的病癥在很 大程度上^皮遺傳，但Affi7W基因的新生突變已被鑒定為MEN1散發(fā)病 例的起因。
menin的功能在很大程度上還未知。已表明到處表達(dá)的主要分布在 細(xì)胞核中的610個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA加工和修復(fù)， 以及通過其與上文所提及的通路的蛋白質(zhì)部分的體外相互作用的細(xì)胞 骨架組織(綜述于Agarwal等人，//onw. MetoZ). T 仏37:369-374 (2005) 中)。然而迄今為止沒有一種已鑒定的蛋白質(zhì)相互作用提供了 MEN1中 的致瘤性的解釋。
胰腺腫瘤(其超過50%是胃泌素瘤以及10-30%是胰島素瘤)治療 的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)是在胃泌素瘤的情況下基礎(chǔ)酸排出量的減少，而手術(shù)被看作 是胰島素瘤的最佳治療。垂體腫瘤的治療由伴隨著取決于激素概況的不 同的藥物療法的選擇性的手術(shù)構(gòu)成，而曱狀旁腺腫瘤的確定性治療是手 術(shù)去除過分活躍的腺。但是曱狀旁腺切除術(shù)的程度和時(shí)機(jī)具有可變性
(綜述于Brandi等人，五m/ocn."o/.86:5658-5671 (2001) 中)。最近對(duì)診斷和治療MEN1的新方法的產(chǎn)生上的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜 述(Viola等人，C匿爭(zhēng)w. (9歸/. 17:24-27 (2005))。
通過同源重組，已經(jīng)將小鼠基因Menl的外顯子3-8作為缺失的靶
(Crabtree等人，Prac. A^/. JcaA 98:1118-1123 (2001))。到九
個(gè)月大時(shí)，雜合的Menl小鼠被報(bào)道發(fā)展胰島損傷，伴隨其它的常觀察 到的曱狀旁腺腺瘤。到16個(gè)月大時(shí)觀察到胰島、曱狀旁腺、曱狀腺、腎上腺皮質(zhì)和垂體中更大更多數(shù)量的腫瘤(Crabtree等人，Prac. A^/. 爿c^/. 98:1118-1123 (2001)),特征與人類病癥非常相似。
當(dāng)抗VEGF-A方法已被用于衍生自人類惡性癌細(xì)胞系的各種臨床 前模型的處理時(shí)(綜述于Geber等人，Cfl"ceri 仏60:2178-2189 (2000)), 存在大量的證據(jù)顯示VEGF-A介導(dǎo)的血管生成的阻斷導(dǎo)致肺瘤抑制 (Gerber等人，Oz"cw M 60:6253-6258 (2000), Holash等人，Prac.胸/. Jed 固99:11393-11398 (2002)， Millauer等人，A^ww 367:576-579 (1994), Prewett等人，59:5209-5218 (1999), Wood等人， Oz"cwi &s. 60:2178-2189 (2000))。然而在自然情況下，腫瘤異種移植 物很難再現(xiàn)腫瘤發(fā)育。此外，在抑制良性腫瘤或內(nèi)分泌腺起源的肺瘤的 生長(zhǎng)上迄今沒有嘗試抗VEGF-A抗體療法。為了研究在內(nèi)分泌組織特異 性腺瘤的發(fā)育中VEGF-A的作用，我們考查了抗血管生成療法對(duì)自然發(fā) 生的非惡性腫瘤模型MEN1的Menl+/—小鼠模型的作用。在用示例性 VEGF特異性拮抗劑抗VEGF-A單克隆抗體(mAb)短期處理后分析 Menl+/—小鼠中垂體腺瘤的肺瘤體積以及Balb/c棵小鼠中皮下垂體胂瘤 移植物的體積。此外，研究了用抗VEGF-A的mAb降低與MEN1相關(guān) 的升高的激素水平的可能性。
對(duì)于下文所描述的實(shí)驗(yàn)，從The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 獲得Menl+/—小鼠(庫(kù)存編號(hào)004066 )而從Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA)獲得Balb/c棵小鼠。混合129-FVB背景的實(shí)驗(yàn)性的 Menl+/—雌性小鼠是通過將Menl+/—雄性和雌性小鼠雜交獲得的。將小鼠 圈養(yǎng)在屏障設(shè)施中的微隔離器籠子中并隨意喂食。按照聯(lián)邦政府規(guī)章和 Institutional Animal Care and Use Committee (實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與4吏用委員 會(huì))所批準(zhǔn)的進(jìn)行動(dòng)物的養(yǎng)護(hù)和實(shí)驗(yàn)方案。
mAb G6-31處理抑制Menl+/—垂體腺瘤的生長(zhǎng)
為了研究抗VEGF-A療法在抑制垂體腺瘤的生長(zhǎng)上是否有效，使 125只十一至十三個(gè)月大的雌性Menl+/—小鼠經(jīng)受MRI以鑒別具有垂體 腫瘤的小鼠。14和28天后使帶有腫瘤的小鼠再次經(jīng)受成像以確定腺瘤 的生長(zhǎng)速率。使研究開始時(shí)具有每天12.4%的平均腫瘤生長(zhǎng)和15.58±4.0 mm3 (士SEM)平均腫瘤體積的九只小鼠的組接受對(duì)照IgG,而使研究開
95始時(shí)具有每天10.2%的平均腫瘤生長(zhǎng)和16.70±5.7 mmS平均腫瘤體積的 八只小鼠的組接受抗VEGF-A的mAb G6-31，均達(dá)67天或直到發(fā)現(xiàn)小 鼠瀕死。對(duì)于使用mAb G6-31和對(duì)照IgG抗體的處理，以溶于PBS的 100-200 jid體積每周 一次提供5 mg/kg的抗VEGF的mAb G6-31 ( Liang 等人，所o/. CAem. 281 :951-961 (2005))或同種型匹配的對(duì)照IgG (抗 GP120)的腹膜內(nèi)注射。在13.5-14.5個(gè)月大時(shí)開始對(duì)患有原位垂體腺瘤 的八只(mAb G6-31 )或九只(對(duì)照IgG ) Menl+〃小鼠的施用并持續(xù)67 天或直到發(fā)現(xiàn)小鼠瀕死。在移植后4個(gè)月開始具有皮下垂體腺瘤移植物 的23只(對(duì)照IgG)或35只(mAb G6-31 ) Balb/c棵小鼠的處理并持 續(xù)35天或者直到發(fā)現(xiàn)小鼠瀕死或腫瘤體積已經(jīng)達(dá)到3000 mm3的體積。 每?jī)芍苡肕RI將動(dòng)物成像以追蹤體內(nèi)垂體&良瘤生長(zhǎng)。在9.4T水平 孑L型磁體(9.4 T horizontal bore magnet， Oxford Instruments Ltd., Oxford, UK)獲得并通過^f吏用用于傳送和接收的3 cm體積型線圈(volume coil) (Varian, Inc.)的Varian Inova 4空制臺(tái)(Varian, Inc., Palo Alto， CA)4空制 MRI圖像。以4秒的重復(fù)時(shí)間，8的回波鏈長(zhǎng)度，12 ms的回波間隔， 48ms的有效回波時(shí)間，六次平均使用快速自旋回波成像序列。圖像矩 陣為1282，具有一見野(20 mm) 2和0.5 mm的層面厚度。S夸小鼠以臣卜姿 在醫(yī)用空氣中用2%異氟烷約束，并且用直腸探針監(jiān)測(cè)體溫并在15分鐘 的圖像獲取期間用暖空氣保持在37°C。成像后，在熱表面上使動(dòng)物復(fù) 原，之后將它們送回圈養(yǎng)設(shè)施。使用Analyze軟件(AnalyzeDirect， Inc., Lenexa， KS )繪制的目標(biāo)三維區(qū)域從MRI凄t據(jù)計(jì)算原發(fā)垂體肺瘤體積。 在處理的三十九天時(shí)，與對(duì)照IgG處理的組相比，在mAb G6-31 處理的組中觀察到平均垂體腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的下降(圖5A)。 在研究的終點(diǎn)(67天)，用mAbG6-31處理后平均腫瘤體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)上 顯著的72%的減小或減至1/3.7，具有小于0.016的p值。當(dāng)大多^:(9 個(gè)中的6個(gè))對(duì)照IgG處理的Menl+一腫瘤在整個(gè)處理期間繼續(xù)茁壯生 長(zhǎng)時(shí)，8個(gè)mAb G6-31處理的垂體腺瘤中的7個(gè)的生長(zhǎng)顯著減慢(圖 5B)。在研究終點(diǎn)之前四只對(duì)照IgG和三只mAbG6-31處理的小鼠由于 不健康而被安樂死，其包括在處理第25天成像前的一只對(duì)照IgG處理 的小鼠。mAbG6-31處理的組中無腫瘤倍增的生存期被顯著增加，具有時(shí)序p<0.019 (圖5C),表明與用對(duì)照IgG處理的小鼠相比，垂體腫瘤 生長(zhǎng)的抑制改善了那些小鼠的健康。mAb G6-31處理的組中兩只小鼠的 腫瘤體積到處理的第67天時(shí)沒有加倍。
抗VEGF-A抗體抑制皮下垂體腺瘤移植物的生長(zhǎng)
為了才企測(cè)抗VEGF-A抗體處理對(duì)Menl+/—垂體腺瘤移植才莫型的效 力，按照下列程序在6-8周大的雌性Balb/c棵小鼠的側(cè)腹中建立皮下腫 瘤。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，將來自Menl"-小鼠的單個(gè)的原位垂體腺瘤取出并 切成約1 mm3的塊，與BD Matrigel Matrix Basement Membrane( Matrigel 基質(zhì)膠基底膜)(BD, Bedford, MA )混合并以200 pi體積對(duì)Balb/c棵 小鼠的背側(cè)進(jìn)行皮下接種。四個(gè)月后，將單個(gè)的皮下腫瘤(約900mm3 體積)取出、切碎與Matrigel混合并如前文所述進(jìn)行接種以建立具有垂 體腺瘤移植物的小鼠的組。
使用卡尺工具(Fred V. Fowler Co. Inc.， Newton, MA)通過采集最大 的腫瘤直徑和與其垂直的直徑測(cè)量皮下垂體腺瘤移植物的腫瘤大小。使 用下列公式計(jì)算腫瘤體積V二7rab"6(a二最大肺瘤直徑，匕=垂直直徑)。
z使用上文描述的方法， -使在處理開始時(shí)具有515±42 mn^平均腫瘤 體積的35只小鼠的組接受mAbG6-31,而使在研究開始時(shí)具有527±64 mn^平均肺瘤體積的23只小鼠的組接受對(duì)照IgG,均達(dá)35天。在研究 終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照IgG處理的腫瘤已經(jīng)接近它們的體積的四倍至2071±152 mr^的平均值，而用mAb G6-31處理的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)已經(jīng)基本上 停止，第35天時(shí)的平均腫瘤體積為556士89mm3 (圖5D )。 mAbG6-31 處理時(shí)的平均肺瘤體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的73%的減小或減至1/3.7,具 有p〈1.9x l(T12。
這些數(shù)據(jù)證實(shí)抗VEGF-A的mAb G6-31在抑制由于Menl的雜合 性而易患的垂體腺瘤和類似的皮下垂體腺瘤移植物的生長(zhǎng)上是有效的。
VEGF-A、VEGFR-1和VEGFR-2在正常垂體腺和在垂體腫瘤組織 中的表達(dá)
為了研究VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2在垂體組織中的表達(dá)水 平并檢查它們的表達(dá)水平是否受到mAb G6-31處理的影響，我們對(duì)比 了在五個(gè)對(duì)照IgG處理的(平均體積96.2±8.7 mm3)和五個(gè)mAb G6-31
97處理的(35.2士4.0mm3)原位垂體腺瘤連同五個(gè)年齡匹配的小的未處理 的(9.7±2.9 mm )垂體腺瘤，來自Menl"—小鼠的四個(gè)年齡匹配的正常 垂體腺，以及八個(gè)年齡匹配的野生型垂體腺樣品中VEGF-A、 VEGFR-1 和VEGFR-2的平均相對(duì)表達(dá)。還從五個(gè)對(duì)照IgG處理的(平均體積 2063±205 mm3)和五個(gè)mAb G6-31處理的(577±45 mm3)垂體腺瘤移 植物研究VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)。
為了這些實(shí)'驗(yàn)，用RNeasy試劑盒(Qiagen， Hilden, Germany)依照 制造商的方案從快速冷凍的垂體腺瘤或正常垂體腺制備總的無DNA的 RNA。用Superscript III Platinum —步qRT-PCR試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)、 100 ng的總RNA、 45 nM的每種PCR引物以及12.5 nM Taqman探針以50 /xl的總體積進(jìn)行一步定量RT-PCR。為了檢測(cè)感興趣 的基因的表達(dá)，使用了下列TaqMan基因表達(dá)分析引物和探針混合物 (Applied Biosystems , Foster City ， CA) : ^EGF-爿(測(cè)定 ID : Mm00437304—ml) 、 K五OF7 -/(測(cè)定 ID : Mm00438980—ml)以及 r五GF/ -2(測(cè)定ID: Mm00440099一ml)。使用在內(nèi)部設(shè)備中合成的引物 和Taqman探針(正向引物序列ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG (SEQ ID NO: 3);反向引物序列GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA (SEQ ID NO : 4) ; Taqman探針序列AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA (SEQ ID NO: 5))檢測(cè)04尸￡>//表達(dá)。
使用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，以下列條件進(jìn)行反 應(yīng)反轉(zhuǎn)錄步驟(于48。C15分鐘)，之后變性步驟(95。C2分鐘)以及 40個(gè)95°C15秒和60°C1分鐘的循環(huán)。使用04尸Z)/Z基因作為內(nèi)源性對(duì) 照以及小鼠胎盤總RNA (Clontech, Mountain View， CA)作為參考， 用相對(duì)定量的方法(ddCt法)測(cè)定每種樣品中基因表達(dá)的水平。
值得注意的是，與對(duì)照IgG處理的垂體腫瘤、小的未處理的腫瘤和 來自野生型或Menl+一小鼠的正常垂體腺相比，mAb G6-31處理的原位 腺瘤中VEGF-A平均相對(duì)表達(dá)被顯著升高(圖6)。兩個(gè)皮下腫瘤移植 物樣品中VEGF-A表達(dá)差不多高。在mAb G6-31處理的腫瘤中所觀察 到的高水平的VEGF-A轉(zhuǎn)錄可能是經(jīng)由mAb G6-31的對(duì)VEGF-A的系 統(tǒng)遮蔽的補(bǔ)償機(jī)制的結(jié)果。然而，似乎升高的VEGF-A不足以使肺瘤生長(zhǎng)。
盡管VEGFR-1的平均相對(duì)表達(dá)在不同的組織樣品中表現(xiàn)得相當(dāng)?shù)?沒有變化，但是與在腫瘤移植物、小的未處理腫瘤或來自野生型和 Menl+/—小鼠的正常垂體腺中所發(fā)現(xiàn)的相比，用對(duì)照IgG或mAb G6-31 處理的原位腫瘤樣品中VEGFR-2的平均相對(duì)表達(dá)似乎下降了 (圖6)。
MRI使得可以體內(nèi)追蹤腫瘤生長(zhǎng)
如上文所描述的使用MRI通過每隔一周使動(dòng)物經(jīng)受成像而在整個(gè) 處理期間追蹤原位垂體腺瘤的生長(zhǎng)。將攝于處理開始后9、 39和67天， 具有來自 一只對(duì)照IgG和一只mAb G6-31處理的Menl+、J、鼠的代表性 的腺瘤的腦部的冠狀切面的圖示示于圖7。
垂體和胰腺腫瘤的組織學(xué)
在mAb G6-31和對(duì)照IgG處理的小鼠中Menl"-垂體腺腺瘤是組織 學(xué)上相似的(圖8A-B)。為了這些實(shí)驗(yàn)，將福爾馬林固定的組織脫水并 包埋于石蠟中，切片并用蘇木素-伊紅(H&E)染色以便按照標(biāo)準(zhǔn)方案 進(jìn)行組織學(xué)分析。通常，肺瘤細(xì)胞是小的( 10微米的直徑)，具有高 的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比率，常常有絲分裂活躍，具有每十個(gè)625微米直徑 的^L野多達(dá)40個(gè)有絲分裂象。腫瘤不定地為實(shí)體或嚢性的，與以前的 出血相符，具有多重的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的血管，急性出血的區(qū)域(在非內(nèi) 皮內(nèi)襯的空間中的完整的紅細(xì)胞，缺乏纖維蛋白或細(xì)胞形成)，以及分 散的載滿血鐵黃素的巨噬細(xì)胞。具有可變的單細(xì)胞壞死和極小的纖維 化。腫瘤血管是不規(guī)則地隔開的，通常5-10微米(但是很少的大至50 微米)的直徑，幾乎沒有非腫瘤的血管周圍的基質(zhì)細(xì)胞。
通過4吏用泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記抗體MECA-32間接的免疫組織化學(xué)染色 在對(duì)照IgG和mAb G6-31處理的腫瘤之間觀察血管沖莫式(圖8C-D )。 為了這些實(shí)-瞼，在終止內(nèi)源性的過氧化物酶活性并阻斷抗生物素蛋白和 生物素(Vector, Burlingame, CA)之前，將福爾馬林固定、石蠟包埋 的組織切片脫石蠟。用溶于具有3% BSA的PBS中的10%的正常兔血 清將切片封閉30分鐘。之后將組織切片與第一抗體孵育60分鐘，與生 物素化的第二抗體孵育30分鐘，并在ABC試劑(Vector, Burlingame， CA)中孵育30分鐘，之后在金屬增強(qiáng)的DAB (Pierce ， Rockford, IL )中孵育5分鐘。之后將切片用Mayer氏蘇木素復(fù)染。所使用的第一抗體 是0.1 /;ig/ml的山羊抗小鼠催乳素(R&D systems, Minneapolis, MN ) 和2 Aig/ml的大鼠抗小鼠泛內(nèi)皮細(xì)胞抗原(克隆MECA32) ( BD Biosciences, San Jose, CA )。所使用的第二抗體是7.5 jLtg/ml的生物素 化的兔抗山羊(Vector, Burlingame ， CA )和2 5 /xg/ml的生物素化的兔 抗大鼠(Vector, Burlingame, CA )。泛內(nèi)皮細(xì)胞抗原染色需要于99°C 用Target Retrieval (Dako, Carpenteria， CA)預(yù)處理20分鐘。其他所有 步驟于室溫進(jìn)行。
mab G6-31處理將血管密度顯著降低至對(duì)照IgG處理的腫瘤的血管 密度的46% (p值=0.009;圖81)。在兩個(gè)處理組中，腫瘤血管分布比 正常的鄰近的垂體前葉中的少。為了定量血管密度，用Ariol SL-50載 if皮片掃描臺(tái)(Ariol SL-50 slide scanning platform, Applied Imaging; San Jose, CA)使用10x的物鏡分析MECA-32染色的切片。人工鑒定并劃 出垂體腫瘤區(qū)域。相應(yīng)于MECA-32染色確定像素顏色并相應(yīng)地測(cè)量血 管面積。通過像素顏色和物體形狀鑒別腫瘤細(xì)胞核。之后將血管面積相 對(duì)于垂體腫瘤細(xì)胞數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化。除了將MECA-32染色面積相對(duì)于胰島 腫瘤面積標(biāo)準(zhǔn)化以外，同樣地分析胰島。
除了垂體腫瘤，經(jīng)常在處理的Menl+"小鼠中鑒別胰島腫瘤并在研 究終點(diǎn)對(duì)胰島腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分析。胰島腫瘤(被定義為在切片平面上 大于105/mi4々)通常是實(shí)體的，不具有顯著的出血或壞死。來自用抗 VEGF-A的Mab G6-31處理的六只動(dòng)物的腫瘤(n=32個(gè)腫瘤)平均只 有來自用對(duì)照IgG處理的五只動(dòng)物的那些腫瘤(n=45個(gè)腫瘤；p值 =0.026)的面積的39%。用對(duì)照IgG處理的胰腺li瘤(圖8E-F)表現(xiàn) 通常比用mAb G6-31處理的腺瘤(切片平面上腫瘤直徑達(dá)5.0 mm)大 (切片平面上達(dá)7.0 mm)并且血管多。在用對(duì)照IgG處理的七只小鼠 中的四只中，胰腺肺瘤含有直徑多達(dá)300 ^m的膨脹的、充血的、薄壁 的、內(nèi)皮內(nèi)襯的空間，而用mAb G6-31處理的小鼠中的胰腺腺瘤常常 缺乏顯著的血管分布(圖8G-H)。來自用mAb G6-31處理的八只小鼠 中的一只的胰腺肺瘤顯露出膨脹的血管。從使用任一種處理的胰腺肺瘤 間歇發(fā)現(xiàn)載滿血4失黃素的巨噬細(xì)胞，暗示胰島出血。G6-31處理將胰島肺瘤中的血管密度顯著降低至對(duì)照IgG處理的胰 島腫瘤中的血管密度的56% ( 值=2*10-7)。同樣，來自MabG6-31處 理的小鼠的"正常的，，胰島(在切片平面上小于105 /mi2)具有以較小幅 度減少至對(duì)照IgG處理的動(dòng)物的血管密度的76%的血管密度(p值 =4*10-7;參見圖8J)。用對(duì)照IgG處理的一只雄性動(dòng)物具有唯一的12 mm 直徑的腎上腺皮質(zhì)的腫瘤，其為MEN1綜合征腺中公認(rèn)的腫瘤類型。
皮下垂體腺瘤移植物的組織學(xué)與原位垂體肺瘤的組織學(xué)相當(dāng)，顯示 內(nèi)分泌腫瘤生長(zhǎng)在遠(yuǎn)處位置的成功的再現(xiàn)。
Menl垂體腺瘤是催乳素瘤
MEN1患者中大約百分之六十的垂體腺瘤分泌催乳素(PRL),少 于25%的生長(zhǎng)激素(GH)和5%的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH, Trump 等人，0/M89:653-669 (1996))。為了研究Menl仏小鼠的垂體腺瘤是否 分泌PRL，在對(duì)照IgG和mAb G6-31處理的原位垂體腺瘤以及垂體肺 瘤移植物上使用抗PRL抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。對(duì)照IgG處理的 六個(gè)垂體腺瘤中的六個(gè)和mAb G6-31處理的五個(gè)垂體腺瘤中的五個(gè)在 大約50-95%的細(xì)胞中顯示出對(duì)催乳素的特異的陽性的染色，證實(shí)它們 是催乳素瘤(圖9A-9B)。與這一結(jié)果相一致，Crabtree等人報(bào)道 MenlTSM"垂體腫瘤在免疫組織化學(xué)染色中為PRL陽性(Crabtree等人， ZVoc. A^/. Sd 98:1118-1123 (2001))。在使用任一種處理的垂體&i 瘤移植物中催乳素染色也是陽性的(圖9C、 9D)。與來自這些腫瘤的功 能性催乳素分泌相一致，在對(duì)照IgG和抗VEGF-A處理的動(dòng)物中，帶 有移植的垂體腺瘤的雌性小鼠中的乳房組織總是顯示中度的至顯著的 泌乳變化(圖9E, F)。
如通過免疫組織化學(xué)染色估定的，11個(gè)未處理的原發(fā)垂體肺瘤中 的6個(gè)是局灶性并對(duì)生長(zhǎng)激素弱陽性的(圖14A)，而四個(gè)移植的垂體 腫瘤中只有一個(gè)顯示局灶性的弱的染色(圖14B)。 G6-31和對(duì)照IgG 處理的原位垂體腫瘤中都存在生長(zhǎng)激素表達(dá)(圖6C, D)。正常垂體前 葉在~20-30%的細(xì)胞中顯示強(qiáng)反應(yīng)性(圖14A)。
未處理和對(duì)照IgG處理的小鼠中血清催乳素水平與垂體腫瘤體積 相關(guān)并被mAb G6-31處理降低
101考慮到通過免疫組織化學(xué)分析來自Menl"—小鼠的所;險(xiǎn)查的所有對(duì) 照IgG和所有mAb G6-31處理的垂體腺瘤都是催乳素陽性的，我們研 究了血清PRL水平在Menl仏帶有垂體腺瘤的小鼠中是否升高。為了這 一目的，我們最初對(duì)46只未處理的雌性Menl仏小鼠分析了它們的垂體 腫瘤狀態(tài)和血清PRL水平以及五只雌性的野生型的同窩出生的對(duì)照的 血清PRL水平。在Harbor UCLA (Torrance, CA)通過美國(guó)激素和肽計(jì) 戈'j(National Hormone & Peptide Program)分一斤血清〗崔乳素的量。
這些小鼠中的年齡范圍是15.6至10.5個(gè)月，平均年齡13.3個(gè)月。 野生型小鼠中的平均血清PRL水平是43.8±25.3(±SEM) ng/ml。 46只 Menl+z-小鼠中的二十七只在MRI分析中不具有可4企測(cè)的垂體腫瘤。這 些小鼠中的平均血清PRL水平是69.0±24.6 ng/ml。 一組十只小鼠具有 1.7±0.6 mm3的平均體積的小的垂體腫瘤。這些小鼠中血清PRL水平被 升高至188.7±61.9 ng/ml的平均值。具有大的垂體腫瘤(平均體積 83.1±23,8 mm3 )的九只小鼠具有平均13239.8±3466.5 ng/ml的血清PRL。 這些數(shù)據(jù)證實(shí)Menl+z-小鼠中血清PRL水平和垂體腫瘤體積之間具有皮 爾遜相關(guān)系數(shù)R=0.94的正相關(guān)性(圖10A)，表明血清PRL水平作為 證實(shí)垂體肺瘤狀態(tài)的評(píng)估中的診斷工具可能是有用的。
為了檢查抗VEGF-A處理是否對(duì)血清PRL水平有影響，我們?cè)谘?究終點(diǎn)(第67天)時(shí)分析了七只對(duì)照IgG和七只mAbG6-31處理的具 有原位垂體腺瘤的Menl+/—小鼠的血清。在對(duì)照IgG處理的小鼠中，平 均血清PRL水平^皮升高至12566.7±3047.4 ng/ml并通常隨著逐漸增加的 腫瘤體積(116.2±18.5 mm3的平均值)而增加，R=0.80 (p<0.03)。在所 分析的mAb G6-31處理的Menl+/—小鼠中，血清PRL水平j(luò)呆持較低，為 5163.7±1608.9 ng/ml, j旦是與肺瘤體積(平均腫瘤體積35.3土6.5 mm3) 沒有明顯的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性，R=-0.12以及p〈0.80 (圖10B)。但是，這些數(shù) 據(jù)表明與對(duì)照lgG處理的小鼠相比，mAb G6-31在抑制垂體腺瘤生長(zhǎng)的 同時(shí)，它還導(dǎo)致平均血清PRL降低，p<0.053。
在具有皮下垂體腫瘤移植物的小鼠中抗VEGF-A處理降低血清 PRL水平
雖然上文的數(shù)據(jù)顯示在帶有腫瘤的Menl"-小鼠中抗VEGF-A抗體處理降低PRL的血清水平，我們?cè)贐alb/c棵小鼠中皮下垂體腺瘤移才直 物的情況下進(jìn)一步對(duì)其研究。從來自23只對(duì)照IgG和35只mAb G6-31 處理的小鼠的在處理開始(第1天)和研究終點(diǎn)(第35天)時(shí)采集的 樣品測(cè)量血清PRL。盡管兩種處理之間第1天時(shí)的平均血清PRL是相 當(dāng)?shù)?，但是?5天時(shí)mAbG6-31的處理已經(jīng)顯著降低了血清PRL水平 (圖IOC和D，分別地)。
盡管MEN1催乳素瘤的現(xiàn)有的治療包括藥物治療或隨后為放射療 法的選4奪性的垂體切除術(shù)，我們的數(shù)據(jù)表明mAb G6-31處理導(dǎo)致伴隨 顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制的PRL血清水平降低，提供了對(duì)MEN1患者的可 能的新的治療方法。
Menl+一小鼠中血清胰島素水平升高
為檢查Menl+/—小鼠中血清胰島素水平是否升高，分析了來自用對(duì) 照IgG處理的六只非禁食的小鼠和用mAb G6-31處理的六只非禁食的 小鼠的血清樣品，所述小鼠均在組織學(xué)分析中被鑒定為胰腺病變。還用 超敏小鼠胰島素ELISA試劑盒依照制造商的i兌明書(Mercodia， Uppsala, Sweden)分析了來自五只非禁食的年齡匹配的野生型小鼠的 血清胰島素水平。沒有觀察到與處理的相關(guān)性，但與野生型小鼠(1.4±0.7 ng/ml (±SEM))相比，Menl+/—小鼠中平均血清胰島素被顯著地升高了 (對(duì) 照IgG， 3.8±2.6 ng/ml; mAb G6-31 ， 3.7±2.4 ng/ml )。
討論
我們的數(shù)據(jù)表明在MEN1的小鼠模型中良性垂體腺腺瘤的生長(zhǎng)需 要VEGF-A,因?yàn)轱@示使用抗VEGF-A的單克隆抗體的療法足以抑制腫 瘤生長(zhǎng)。
基于可獲得的文獻(xiàn)，可能所觀察到的mAb G6-31的大部分抗腫瘤 作用是由VEGFR-2依賴性血管生成的抑制介導(dǎo)的(Wise等人，Prac. A^/. Jca<i. 96:3071-3076 (1999)和Zachary等人，CaWz'owwc.
49:568-581 (2001))。盡管在大的垂體腺瘤中VEGFR-2 mRNA的相對(duì)平 均表達(dá)沒有受到抗VEGF-A處理的顯著影響(圖6 ),但MECA-32的免 疫組織化學(xué)染色顯示出用Mab G6-31處理的垂體胂瘤和胰腺腫瘤中血 管分布上的非常顯著的下降(約50%的減少)。垂體腺瘤和胰腺腺瘤中都已注意到抗VEGF-A處理的肺瘤生長(zhǎng)相應(yīng)的減少。正常力夷島中的血管 密度也被抗VEGF-A處理顯著降低，盡管變化的幅度(對(duì)照IgG處理 的25%減少)小于在胰腺腺瘤中所見的。
Mab G6-31處理的腫瘤中所觀察到的高水平的VEGF-A轉(zhuǎn)錄可能是 經(jīng)由Mab G6-31的對(duì)VEGF-A的系統(tǒng)遮蔽的補(bǔ)償機(jī)制的結(jié)果。然而， 似乎如此升高的VEGF-A不足以使腫瘤生長(zhǎng)。
除了展示使用抗VEGF-A的mAb G6-31的處理的單一療法通過有 效地抑制腺瘤生長(zhǎng)顯著降低了 Menl+/—小鼠的腫瘤負(fù)荷，我們還展示了 血清催乳素水平也被降低。因此，我們的數(shù)據(jù)表明了內(nèi)分泌的良性腫瘤
地，這種VEGF-A阻斷可與藥理劑組合。例如，對(duì)于分泌催乳素的A泉瘤， 可將VEGF-A拮抗劑與多巴胺激動(dòng)劑組合。
實(shí)施例3.在多期癌發(fā)生的RIP-T^Ag模型中抗VEGF干預(yù)效力和退化 /生存效力
為了更好的理解在腫瘤生長(zhǎng)的不同時(shí)期抗VEGF療法的作用，我們 借助于i午多臨床前的腫瘤才莫型，包括RIP-T/5Ag。 RIP-T/3Ag (Exelixis, Inc.)是由SV40大T抗原(TAg )(靶向胰腺的/5細(xì)胞，其中TAg通過 結(jié)合p53和Rb起強(qiáng)效致癌基因的作用)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)所產(chǎn)生(driven) 的小鼠胰島腫瘤模型的有條件的形式。RIP-Tj8Ag與之前已描述過的 RIP-TAg模型(Hanahan， Atoww 315:115-122 (1985); Bergers等人， Science 284 (808-811)， 1999 )表型上是相似的。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一模型 發(fā)展經(jīng)過一系列越來越攻擊性的時(shí)期，包括在大約5周時(shí)VEGF信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的活化和"血管生成開關(guān)，，(即形成新血管的過程的開始)。到IO周時(shí) 小腫瘤形成，與其惡性轉(zhuǎn)化的開始一致。到12周時(shí)大的擴(kuò)散性的癌形 成。因此，在十周大之前，小鼠中的細(xì)胞生長(zhǎng)被認(rèn)為不是惡性或轉(zhuǎn)移性 的。10-12周大之間的時(shí)間段通常包括擴(kuò)散性的癌的形成。
為了這些實(shí)驗(yàn)，按照標(biāo)準(zhǔn)的IACUC推薦圈養(yǎng)并處理RIP-Ti8Ag小 鼠，以5%的蔗糖水對(duì)小鼠提供高糖的食物以緩解由胰腺中分泌胰島素 的/3細(xì)胞增多導(dǎo)致的血胰島素過多的癥狀。在9-9.5或11-12周大時(shí)，用溶于滅菌的磷酸鹽緩沖鹽水中的5 mg/kg的抗VEGF抗體或同種型匹 配的抗豚草對(duì)照單克隆抗體的腹膜內(nèi)注射每周兩次處理小鼠。在"干預(yù) 實(shí)驗(yàn)"中，將9-9.5周大的小鼠處理14天然后^r查。在"退化實(shí)驗(yàn)"中， 將11-12周大的小鼠在處理7、 14和21天后檢查。為檢查生存期，將 另一組小鼠處理直到小鼠表現(xiàn)出發(fā)病或死亡。在干預(yù)和退化實(shí)驗(yàn)中的每 個(gè)確定的時(shí)間點(diǎn)，將每只小鼠的胰腺和脾取出并拍照。通過解剖出每個(gè) 球型肺瘤并計(jì)數(shù)而確定胰腺中的腫瘤數(shù)目。確定腫瘤負(fù)荷并測(cè)量每個(gè)腫 瘤的兩個(gè)最大的直徑并使用球體體積計(jì)算結(jié)果(x2乘以y)乘0.52來 計(jì)算體積。將小鼠胰腺中所有肺瘤的體積相加以確定總體的月中瘤負(fù)荷。 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并使用Microsoft Excel的vll.3.3 (Microsoft, Inc.)將數(shù)據(jù)作圖。使用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行來自不同組的腫瘤數(shù)目和負(fù) 荷間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。使用JMP 6.0 (SAS Institute, Inc.)生成生存期分析 的Kaplan-Meier曲線并使用時(shí)序分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
使用抗VEGF抗體的9周大的動(dòng)物的處理("干預(yù)"實(shí)驗(yàn))產(chǎn)生腫瘤 血管生成上的顯著減少(圖11)。 ll周大的動(dòng)物的處理("退化實(shí)驗(yàn)") 產(chǎn)生腫瘤血管分布和增殖的降低(圖12A)。但是與干預(yù)實(shí)驗(yàn)不同，只 檢測(cè)到腫瘤生長(zhǎng)的短暫的減少并且對(duì)生存期沒有影響(圖12B)。這些 研究證明與晚期腫瘤相比這些早期腫瘤對(duì)以抗VEGF為目的的治療劑 更敏感。
實(shí)施例4.抗VEGF和化學(xué)療法在臨床前模型中是有效的
手術(shù)可能留下殘留的腫瘤細(xì)胞或休眠的微轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)，其具有重新 活化"血管生成程序，，并促進(jìn)更加指數(shù)級(jí)的腫瘤生長(zhǎng)的潛力。
我們已經(jīng)通過^f吏用強(qiáng)效的化學(xué)療法方案與抗VEGF療法并4亍或順 序地"細(xì)胞減少(cytoreduce)"腫瘤以及隨后使用抗VEGF單克隆抗體 的維持療法，用小鼠遺傳性腫瘤和人類異種移植物以模仿腫瘤休眠。因 此，我們處理小鼠以預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)，而不是在腫瘤形成或再形成為(包 括，在某些情況中)難治療的、復(fù)發(fā)的或?qū)Ω嗟陌ò邢蚩筕EGF 療法的處理有抗性的腫瘤后追擊(chasing)紳瘤。圖13顯示多西紫杉 醇在減少腫瘤負(fù)荷上十分有效，然而在大約2個(gè)月后休眠細(xì)胞再生長(zhǎng)的觀察結(jié)果。然而與抗VEGF同時(shí)發(fā)生的治療抑制腫瘤再生長(zhǎng)，即使它們
單獨(dú)時(shí)對(duì)較大的更加建成的腫瘤的生長(zhǎng)幾乎沒有影響。其它的數(shù)據(jù)表明
瘤的再生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明抗VEGF可被用于有效地阻斷休眠胂瘤或微 轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)或再生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)與新血管形成是與肉眼可見的肺瘤的形 成相關(guān)的迅速的克隆擴(kuò)增的先決條件的事實(shí)相符，并支持了 VEGF特異 性拮抗劑(例如抗VEGF抗體，包括但不限于G6或B20系列抗體)在 肺瘤最初的治療后和新腫瘤形成，休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉(zhuǎn)移的重新 活化之前在腫瘤Y木眠的維持和腫瘤再生長(zhǎng)的抑制中的應(yīng)用。
實(shí)施例5.使用貝伐單抗的新輔助療法
這 一 實(shí)施例示例性說明了在患有可觸知并可手術(shù)的乳腺癌的患者 的新輔助療法中貝伐單抗的使用。
新輔助化學(xué)療法已被廣泛用于局部的晚期的或可能可手術(shù)的大的 孝L腺癌的治療中。隨機(jī)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明新輔助化學(xué)療法以與輔助化學(xué)療 法相似的總體存活率減少了對(duì)乳房切除術(shù)的需要(由此保留乳房)。 Powles等人，,C//". O腳Z. 13:547-52 (1995); Fisher等人，丄C//". 16:2672-85 (1998)。
目前的療法的最主要的目的是通過在患有可觸知并可手術(shù)的乳腺 癌的患者中向化學(xué)療法增加貝伐單抗來提供改善的臨床益處。特別地， 新輔助療法的臨床效力的最主要的量度之一可以是病理完全緩解 (pathologic complete response, pCR )率。其他的量度包括總體緩解率 (OR)、臨床完全緩解率(cCR)、無病生存期(DFS)或總體生存期(OS)。 此外，可通過例如手術(shù)并發(fā)癥比率、毒性和對(duì)心臟功能的副作用來監(jiān)測(cè) 治療的副作用。某些基因表達(dá)或其他的生物標(biāo)記活性也可被用作對(duì)治療 的響應(yīng)的才示i己。
病理完全緩解(pCR)已被用作治療效力的預(yù)后標(biāo)記。pCR是指新 輔助療法后在手術(shù)時(shí)沒有殘留的腫瘤的組織學(xué)證據(jù)。研究已經(jīng)表明達(dá)到 pCR的患者具有顯著改善的生存期。但是沒有標(biāo)準(zhǔn)的方法將病理緩解分 級(jí)并且pCR是否可被用作效力的替代標(biāo)記仍然有爭(zhēng)議?；陬A(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針選擇適于使用VEGF特異性拮抗劑的
新輔助療法的患者，所述標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針取決于治療下的特定的癌類型 而變化。例如，可基于患者的預(yù)期壽命、年齡、癌的組織學(xué)、血液學(xué)/ 肝和心臟功能，治療史、生育狀況和計(jì)劃以及精神病學(xué)或成癮狀況來選 擇患者。更重要的是，原發(fā)腫瘤應(yīng)是可測(cè)量的和或可手術(shù)的。
治療方案包括化學(xué)療法加上VEGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗。任 選地，其他的治療劑也可被用于所述方案。通常， 一般用于特定的癌類 型的化學(xué)療法方案(如標(biāo)準(zhǔn)療法方案)與貝伐單抗組合使用。例如，為 了新輔助治療乳腺癌，可將多西紫杉醇、紫杉醇或阿霉素/環(huán)磷酰胺(AC ) 方案與貝伐單抗組合使用?？蛇x擇地，可將基于多西紫杉醇或基于紫杉 醇的方案和AC方案作為與貝伐單抗組合的化學(xué)療法順序使用。為了治 療非小細(xì)胞肺癌，可將順柏(單獨(dú)或與其他化學(xué)劑例如吉西他濱、多西 紫杉醇或長(zhǎng)春瑞濱組合)作為與貝伐單抗組合的主要化學(xué)劑使用。另一 方面，為治療結(jié)腸直腸癌，可將基于5-FU的方案(例如FOLFOX)與 貝伐單抗組合使用。
可對(duì)患者以給定的劑量和間隔施用化學(xué)治療劑和VEGF特異性拮 抗劑例如貝伐單抗許多個(gè)周期。例如，可將貝伐單抗以每三周15mg/kg 提供4個(gè)周期，或每?jī)芍?0 mg/kg提供6個(gè)周期。在另一個(gè)實(shí)例中， 以7.5 mg/kg每?jī)芍芑蛉芤淮问┯肰EGF特異性拮抗劑例如貝伐單抗。 在治療期間監(jiān)測(cè)患者的響應(yīng)。當(dāng)新輔助療法完成時(shí)，患者經(jīng)歷手術(shù)以去 除原發(fā)肺瘤，所述腫瘤是在新輔助療法前可手術(shù)的或響應(yīng)于新輔助療法 變得可手術(shù)的。手術(shù)之后，使患者繼續(xù)VEGF特異性拮抗劑療法例如貝 伐單抗，與或不與化學(xué)療法一起(取決于患者的特定狀況)。任選地，
患者也可經(jīng)受放射療法。在治療和治療后的整個(gè)期間監(jiān)測(cè)患者的進(jìn)展。 與抗VEGF治療相關(guān)的不良事件(AE )還應(yīng)當(dāng)被密切檢測(cè)并控制。 從之前的研究已知的主要的AE包括高血壓、蛋白尿、出血、血栓栓塞 事件、胃腸穿孔/瘺以及傷口愈合并發(fā)癥?？捎盟幬锟刂颇承〢E例如高 血壓。如果AE是嚴(yán)重并不可控制的，則治療應(yīng)中斷。
實(shí)施例6.使用貝伐單抗的輔助療法200780051482.1
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這一 實(shí)施例示例性的說明了在患有切除的癌的患者的輔助治療中 與化學(xué)療法組合的貝伐單抗的使用。
基于預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針選擇適于使用貝伐單抗的輔助療法的 患者，所述標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針取決于治療下的特定的癌類型而變化。例如， 可基于患者的預(yù)期壽命、年齡、癌的組織學(xué)、血液學(xué)/肝和心臟功能、 生活方式史、治療史、生育狀況和計(jì)劃以及精神病學(xué)或成癮狀況來選擇 患者。更重要的是，在輔助治療之前患者必須經(jīng)歷了他們的癌的完全切 除。所接受的切除的類型取決于特定的肺瘤類型。同樣，為了初始時(shí)期 的分析和效力測(cè)定，代表患者的癌的足夠的病理學(xué)材料應(yīng)當(dāng)是可得的。 在治療時(shí)，手術(shù)應(yīng)當(dāng)是非常接近的，但患者必須從手術(shù)中充分的復(fù)原。
例如，患者必須在手術(shù)后不少于3-6周并不多于8-12周時(shí)開始輔助治療。
治療方案包括化學(xué)療法加上貝伐單抗。任選地，其他的治療劑也可 被用于所述方案。通常在治療的第 一 階段期間使用與貝伐單抗組合的化 學(xué)治療劑，之后是貝伐單抗作為單一劑的剩余階段的維持治療。例如，
用化學(xué)治療劑和貝伐單抗治療患者約4-12個(gè)周期，之后單獨(dú)用貝伐單 抗治療達(dá)1至2年?；瘜W(xué)治療劑+貝伐單抗的治療的每個(gè)周期的持續(xù)時(shí) 間取決于所使用的特定的劑和劑量。例如，可每三周為一個(gè)周期以15 mg/kg提供貝伐單抗，或每?jī)芍転橐粋€(gè)周期以5 mg/kg提供貝伐單抗。 在另一個(gè)實(shí)例中，每?jī)芍芑蛎咳芤?.5mg/kg或10mg/kg提供貝伐單 抗。
將通常用于特定癌類型的化學(xué)療法方案(例如標(biāo)準(zhǔn)療法方案)與貝 伐單抗組合使用。例如，對(duì)于乳腺癌的輔助療法，可將多西紫杉醇、紫 杉醇或阿霉素/環(huán)磷酰胺(AC)方案與貝伐單抗組合使用?？蛇x擇地， 可將基于多西紫杉醇或基于紫杉醇的方案和AC方案作為與貝伐單抗組 合的化學(xué)療法順序使用。為了治療非小細(xì)胞肺癌，可將順鉑(單獨(dú)或與 其他化學(xué)劑例如吉西他濱、多西紫杉醇或長(zhǎng)春瑞濱組合)作為與貝伐單 抗組合的主要化學(xué)劑使用。另一方面，為治療結(jié)腸直腸癌，可將基于 5-FU的方案(例如FOLFOX )與貝伐單抗組合使用。
使用貝伐單抗的輔助治療的目的是改善患者的生存期，優(yōu)選地?zé)o病生存期。同時(shí)，尤其是由于輔助治療是長(zhǎng)期的，因此與貝伐單抗有關(guān)的
任何不良事件都應(yīng)一皮密切監(jiān)測(cè)?？赏ㄟ^Kaplan-Meier法評(píng)估生存期，并 使用分層的時(shí)序檢驗(yàn)計(jì)算生存期上的任何差異。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型 的多變量分析被用來估計(jì)預(yù)后因素對(duì)生存期的同時(shí)的作用。用Cox比例 風(fēng)險(xiǎn)模型檢查與預(yù)后因素的相互作用。SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包用于所有的計(jì) 算。當(dāng)P值為0.05或更小時(shí)數(shù)據(jù)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。所有統(tǒng)計(jì) 學(xué)才企驗(yàn)都是雙側(cè)的。
與抗VEGF治療相關(guān)的不良事件(AE)應(yīng)當(dāng)^^皮密切監(jiān)測(cè)并控制。 從之前的研究已知的主要的AE包括高血壓、蛋白尿、出血、血栓栓塞 事件、胃腸穿孑L/瘺以及傷口愈合并發(fā)癥?？捎盟幬锟刂颇承〢E例如高 血壓。如果AE是嚴(yán)重并不可控制的，則治療應(yīng)中斷。
其他實(shí)施方案
從之前的描述中，明顯的是可對(duì)本文描述的發(fā)明做出變化和修改以 使它適合(adopt)各種用途和條件。這些實(shí)施方案也在下列權(quán)利要求 的范圍內(nèi)。
在本說明書中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)和專利，包括美國(guó)臨時(shí) 申請(qǐng)第60/870,741號(hào)(2006年12月19日提交)；第60/870,745號(hào)(2006 年12月19日提交)；第60/877,267號(hào)(2006年12月27日提交)；第 60/919,638號(hào)(2007年3月22日提交);第60/958,384號(hào)(2007年7 月5日提交)和第60/989,397號(hào)(2007年11月20日提交)，都通過引 用并入本文，其引用程度就如同指出將每一個(gè)獨(dú)立的出版物、專利或?qū)?利申請(qǐng)明確且單獨(dú)地通過引用并入。
權(quán)利要求
1.一種治療受治療者中良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用預(yù)防所述良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌變成擴(kuò)散性或轉(zhuǎn)移性的癌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌是0期、I期或II期癌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用預(yù)防所述良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌向III期或IV期癌發(fā)展。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用減小肺瘤大小。
6. —種治療具有癌、息肉或遺傳性癌綜合征的家族史的受治療者的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防所述受治療者中良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述方法預(yù)防從未患有臨床上可檢測(cè)的癌的受治療者或僅患有良性癌的受治療者中所述良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)。
8. —種在具有不可切除的腫瘤的受治療者中減小肺瘤大小的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用減小所述腫瘤大小由此允許所述腫瘤的完全切除。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其進(jìn)一步包括在完全切除所述肺瘤后對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑的步驟。
10. —種治療患有可手術(shù)的癌的受治療者的方法，其包括在手術(shù)之前對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑和進(jìn)行手術(shù)借以切除所述癌。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包括在手術(shù)后對(duì)所述受治療者施用有效量的VEGF特異性拮抗劑以預(yù)防所述癌的復(fù)發(fā)的步驟。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9或11所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用預(yù)防微轉(zhuǎn)移的增殖。
13. —種在患有可手術(shù)的癌的受治療者中進(jìn)行新輔助療法的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用VEGF特異性拮抗劑。
14. 一種預(yù)防受治療者中癌的復(fù)發(fā)的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用VEGF特異性拮抗劑，其中所述施用預(yù)防所述受治療者中的癌復(fù)發(fā)。
15. —種減小受治療者中癌復(fù)發(fā)的可能性的方法，其包括對(duì)所述受治療者施用VEGF特異性拮抗劑，其中所述施用減小所述受治療者中癌復(fù)發(fā)的可能性。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑的所述施用阻止或減小臨床上可檢測(cè)的腫瘤或其轉(zhuǎn)移的發(fā)生的可能性。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14或15中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者在施用VEGF特異性拮抗劑的所述步驟前已經(jīng)經(jīng)受確定性手術(shù)。
18. 才艮據(jù)權(quán)利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15或17中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑是單一療法。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 17或18中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中之前已經(jīng)用抗癌療法治療所述受治療者。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗癌療法包括抗血管生成療法。
21. —種預(yù)防受治療者中肺瘤再生長(zhǎng)的方法，其包括去除所述腫瘤并且之后對(duì)所述受治療者施用VEGF特異性拮抗劑的步驟。
22. —種預(yù)防具有腫瘤的受治療者中癌的復(fù)發(fā)的方法，其包括去除所述腫瘤并且之后對(duì)所述受治療者施用VEGF特異性拮抗劑的步驟。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述腫瘤的去除和施用所述VEGF特異性拮抗劑之間的一段時(shí)間，其中所述一段時(shí)間大于2周。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述一段時(shí)間大于兩周并小于l年。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述腫瘤的去除和施用所述VEGF特異性拮抗劑之間的一段時(shí)間，其中所述一段時(shí)間是28天。
26. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述腫瘤的去除和施用所述VEGF特異性拮抗劑之間的一段時(shí)間，其中所述一段時(shí)間足以使手術(shù)切口充分愈合或減少傷口裂開的風(fēng)險(xiǎn)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑是單一療法。
28. 才艮據(jù)權(quán)利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18或22中的4壬何一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述受治療者的所述癌的復(fù)發(fā)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌或腫瘤是胃腸、結(jié)腸直腸、乳腺、卵巢、肺或腎的癌或腫瘤。
30. 根據(jù)權(quán)利要求l、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括施用其它的抗癌療法。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述其它的抗癌療法是化學(xué)療法。
32. 根據(jù)權(quán)利要求l、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述VEGF特異性拮抗劑選自由與VEGF特異性結(jié)合的多肽、核酶、肽體、反義核堿基寡聚體、小RNA分子和適體所組成的組。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述與VEGF特異性結(jié)合的多肽是可溶的VEGF受體蛋白或其VEGF結(jié)合片段或者嵌合的VEGF受體蛋白。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述嵌合的VEGF受體蛋白是Flt畫l/Fc、 KDR/Fc或Flt/KDR/Fc。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述與VEGF特異性結(jié)合的多肽是抗VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗VEGF抗體是單克隆抗體。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合的、人源化的或完全人類抗體。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述單克隆抗體是貝伐單抗。
全文摘要
本文公開了使用抗VEGF特異性拮抗劑治療良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的方法。還公開了使用抗VEGF特異性拮抗劑治療處于發(fā)展良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的受治療者的方法。還公開了使用抗VEGF特異性拮抗劑治療或預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的方法以及VEGF特異性拮抗劑在新輔助和輔助癌療法中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101646450SQ200780051482
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2007年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者尼娜·克斯薩里, 納波利昂·費(fèi)雷拉, 羅伯特·D·麥斯 申請(qǐng)人:基因技術(shù)公司