一種微流控芯片及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微流控芯片及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞培養(yǎng)是藥物研發(fā)過程中不可缺少的重要步驟，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)在高通量篩藥方面有很多不足，而在多水平藥物聯(lián)用篩選方面更是很少涉足，還沒有高通量的篩選平臺。多種藥物多水平聯(lián)用，能更真實地反映人的實際用藥情況，研究藥物聯(lián)用對細(xì)胞的影響，模擬人體組織藥物之間的互相影響，也有利于快速篩選新藥藥物聯(lián)用的療效和毒性。因此，發(fā)展一種便捷、快速、高效、低成本的藥物聯(lián)用篩選技術(shù)，是藥物篩選和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的迫切需求。
[0003]近年來，微流控芯片分析技術(shù)已成為分析化學(xué)中一個重要的研究方向，是其中最活躍的一支，無論是在科研還是應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展起來的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設(shè)計實現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點而成為新一代生物仿生和細(xì)胞研究的重要平臺?，F(xiàn)有階段的基于微流控芯片的細(xì)胞分析平臺大多是利用同生物相容性好的PDMS硅膠材料作為芯片材料，具有很好的生物相容性，透光透氣，實現(xiàn)芯片內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)和各種生物物理、生物化學(xué)刺激以便得到在不同細(xì)胞外微環(huán)境下細(xì)胞的行為變化，諸如存活、增殖、凋亡、分化等。
[0004]微流控芯片作為一種新型的分析檢測平臺，具有高通量、集成化、多重平行分析、便攜式、易操作、成本低等優(yōu)點，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。然而，采用微流控芯片，在其表面制備微結(jié)構(gòu)和微通道，依靠微通道中液體之間的混合效應(yīng)驅(qū)動多種藥物進行多水平混合，同時完成細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測，目前在藥物聯(lián)用篩選的應(yīng)用領(lǐng)域尚未有實質(zhì)性的突破。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及一種微流控芯片及其制備方法，該微流控芯片集成有濃度梯度生成單元和混合單元，最終可生成多種藥物不同水平的濃度混合刺激固定在特定的細(xì)胞培養(yǎng)單元的細(xì)胞，在顯微鏡下可以直觀地研究細(xì)胞在生長過程中對多藥物多水平聯(lián)用的反應(yīng)，為大規(guī)模的藥物聯(lián)用篩選提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域，是一種可廣泛用于各種細(xì)胞分析的新工具。
[0006]—種微流控芯片，所述微流控芯片由2個濃度梯度生成單元，I?10個混合單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元構(gòu)成，混合單元的入口為濃度梯度生成單元的藥物溶液出口，濃度梯度生成單元的最上端為藥物溶液或培養(yǎng)基入口；
[0007]所述的濃度梯度生成單元為一個樹狀的、從上至下逐層增加分支的結(jié)構(gòu)，每個分支的通道為迂回的折線形，最末端分支數(shù)量為混合單元數(shù)量的二分之一，且其每一個出口通過一個微通道與混合單元最上端相連，
[0008]所述的混合單元，為濃度梯度單元末端通道分支兩個微通道，混合單元快速微通道和混合單元慢速微通道，混合單元快速微通道為長直通道，混合單元慢速微通道為長迂回的折線形通道，每個混合單元的長直通道與對側(cè)的長迂回的折線形通道相連通，長迂回的折線形通道與長直通道的長度比例可以為1:1?10:1。
[0009]所述的細(xì)胞培養(yǎng)單元包括細(xì)胞培養(yǎng)室，上端為混合單元的藥物溶液出口，下端為細(xì)胞培養(yǎng)單元出口。
[0010]一種微流控芯片的制備方法，按照以下步驟進行:用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形，包括濃度梯度生成單元、混合單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元；通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。
[0011]所述微流控芯片的芯片基材可以是PMMA、PC、PVC、C0C、銅、鋁、不銹鋼、硅片、玻璃圓片，也可是市售的各類普通⑶光盤。
[0012]所述微流控芯片的芯片和粘性薄膜的微結(jié)構(gòu)和微通道可以通過數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕制備，也可用軟刻蝕技術(shù)制備。
[0013]—種微流控芯片的應(yīng)用，該微流控芯片用于細(xì)胞水平藥物聯(lián)用，按照以下步驟進行:
[0014]從細(xì)胞培養(yǎng)室出口將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)單元，使細(xì)胞在靜壓力驅(qū)動下流入細(xì)胞培養(yǎng)室；細(xì)胞貼壁后，入口連接蠕動栗加入不同的藥物或細(xì)胞培養(yǎng)基，使藥物生成濃度梯度后混合進入細(xì)胞培養(yǎng)單元，芯片置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；12?72小時后，可以將微流控芯片置于熒光顯微鏡下，進行藥物對細(xì)胞響應(yīng)參數(shù)的檢測。
[0015]若入口連接蠕動栗加入洗滌溶液，洗滌液流入細(xì)胞培養(yǎng)室對細(xì)胞進行洗滌；
[0016]若入口連接蠕動栗加入標(biāo)記溶液，標(biāo)記溶液流入細(xì)胞培養(yǎng)室對細(xì)胞進行標(biāo)記。
[0017]該微流控芯片以蠕動栗作為藥物微流體流動的驅(qū)動力，不同入口可以使用不同的流速，灌注流速可以為0.5ul/min?20ul/min。
[0018]該微流控芯片可以在一塊芯片上生成多種藥物濃度梯度的不同水平混合，刺激多組細(xì)胞，可同時進行多藥物多水平聯(lián)用的篩選，提高了單位時間的平行篩選能力，適合大規(guī)模的高效的藥物聯(lián)用篩選。
[0019]該微流控芯片可以直觀地研究多藥物多水平聯(lián)用對細(xì)胞的作用與影響。
[0020]該微流控芯片便于觀察、設(shè)備簡單、樣品和試劑用量小，平行篩選能力高，有利于快速篩選新藥的療效和毒性，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0021]所述的濃度梯度生成單元生成的藥物溶液經(jīng)混合單元的快速微通道、慢速微通道分別與對側(cè)方向其他藥物溶液的慢速微通道、快速微通道進行高低水平的混合，作用于下游細(xì)胞培養(yǎng)單元中的細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明操作簡單、實現(xiàn)了多種藥物同時多水平聯(lián)用，降低了試劑與樣品的用量，高效地進行藥物篩選，具有便攜、經(jīng)濟、快速、高效的特點，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。
[0023]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0024]本發(fā)明只需向四個入口分別加入含有藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基溶液就可以在細(xì)胞培養(yǎng)單元自動生成多種藥物濃度梯度的多水平混合，自動分配到與之相連接的細(xì)胞培養(yǎng)室中。
[0025]本發(fā)明只需向入口中加入細(xì)胞懸液、洗滌溶液和標(biāo)記溶液就可以完成細(xì)胞的接種、洗滌和標(biāo)記操作。
[0026]本發(fā)明的創(chuàng)造性是在芯片上集成了多種藥物的濃度梯度同時生成、混合，和芯片細(xì)胞培養(yǎng)、受激、洗滌、標(biāo)記。
[0027]與傳統(tǒng)的多孔板技術(shù)相比，本發(fā)明省去了配制和分配多種藥物不同濃度溶液的繁冗操作，大大簡化了細(xì)胞接種、受激、洗滌和標(biāo)記操作過程，現(xiàn)住地降低了細(xì)胞和試劑的耗量。
[0028]本發(fā)明創(chuàng)造性滴將微流控芯片技術(shù)與藥物聯(lián)用方法相結(jié)合，利用芯片上各種功能單元靈活組合、規(guī)模集成的特征，同時產(chǎn)生大量篩選條件；利用高內(nèi)涵篩選方法在一次試驗中多細(xì)胞響應(yīng)同時分析的特征，從而首次實現(xiàn)了微流控芯片細(xì)胞水平高通量、高內(nèi)涵藥物聯(lián)用篩選。
【附圖說明】
[0029]圖1為微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為1#藥物溶液或培養(yǎng)基入口，2為2#培養(yǎng)基或藥物入口，3為3#培養(yǎng)基或藥物入口，4為4#培養(yǎng)基或藥物入口，5為1#濃度梯度生成單元，6為1#濃度梯度生成單元溶液出口，7為1#細(xì)胞培養(yǎng)單元出口，8為1#混合單元快速微通道，9為1#細(xì)胞培養(yǎng)室，10為1#混合單元慢速微通道，11為1#混合單元的藥物溶液出口，12為2#混合單元的藥物溶液出口，13為2#混合單元慢速微通道，14為2#細(xì)胞培養(yǎng)室，15為2#混合單元快速微通道，16為2#細(xì)胞培養(yǎng)單元出口，17為2#混合單元的藥物溶液出口，18為2#濃度梯度生成單元
[0030]圖2微流控芯片的實物圖；
[0031]圖3灌注染料后，細(xì)胞培養(yǎng)單元放大圖。
【具體實施方式】
[0032]下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制發(fā)明。
[0033]實施例1
[0034]—種微流控芯片，所述微流控芯片由2個濃度梯度生成單元5、18，I?10個混合單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元構(gòu)成，混合單元的入口為濃度梯度生成單元的藥物溶液出口 6、17，濃度梯度生成單元的最上端為藥物溶液或培養(yǎng)基入口 1、2、3、4 ;
[0035]所述的濃度梯度生成單元5為一個樹狀的、從上至下逐層增加分支的結(jié)構(gòu)，每個分支的通道為迂回的折線形，最末端分支數(shù)量為混合單元數(shù)量的二分之一，且其每一個出口通過一個微通道與混合單元最上端相連，
[0036]所述的混合單元，為濃度梯度單元末端通道分支兩個微通道，混合單元快速微通道8和混合單元慢速微通道10，混合單元快速微通道為長直通道，混合單元慢速微通道為長迂回的折線形通道，每個混合單元的長直通道與對側(cè)的長迂回的折線形通道相連通，長迂回的折線形通道與長直通道的長度比例可以為I?10:1。
[0037]所述的細(xì)胞培養(yǎng)單元包括細(xì)胞培養(yǎng)室9，上端為混合單元的藥物溶液出口 11，下端為細(xì)胞培養(yǎng)單元出口 7。
[0038]細(xì)胞水平藥物聯(lián)用的微流控芯片的制備
[0039]用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形，混合單元數(shù)量為5個，長迂回的折線形通道與長直通道的長度比例為4:1。利用SU8-3035光刻膠在75mm規(guī)格玻片上制作芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道模板，圍片后，澆灌PDMS單體:引發(fā)劑(V: V)=12:1的PDMS，高度為2mm，真空除氣泡，80°C I小時，取出放涼，切下PDMS芯片，使用打孔器將4個入口與10個出口打通，等離子封接在75mm玻片上，用乙醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油漬等污漬。紫外照射過夜滅菌后即可使用。如圖2所示。
[0040]應(yīng)用細(xì)胞水平藥物聯(lián)用的微流控芯片的表征利用實驗室自行制作的細(xì)胞水平藥物聯(lián)用的微流控芯片，四個入口連接蠕動栗，1#藥物溶液或培養(yǎng)基入口 1、4#藥物溶液或培養(yǎng)基入口 4為水，2#藥物溶液或培養(yǎng)基入口 2為紅色染料，3#藥物溶液或培養(yǎng)基入口 3為藍(lán)色染料，設(shè)定四個入口流速均為6ul/min，開始注射，水與紅色染料經(jīng)濃度梯度生成單元5在濃度梯度生成單元各個出口 6處形成從無色、淺紅至深紅的溶液，其中濃度梯度生成單元出口 6處為無色溶液，經(jīng)混合單元快速微通道8與混合單元慢速微通道10分流；濃度梯度生成單元出口 17處為深藍(lán)溶液，經(jīng)混合單元快速微通道15與混合單元慢速微通道13分流；混合單元快速微通道15與混合單元慢速微通道10連通混合進入細(xì)胞培養(yǎng)單元14，得到大量深藍(lán)溶液與少量無色溶液的混合；混合單元慢速微通道13與混合單元快速微通道8連通混合進入細(xì)胞培養(yǎng)室9，得到大量無色溶液與少量深藍(lán)溶液的混合。經(jīng)穩(wěn)定20分鐘后，在各細(xì)胞培養(yǎng)單元可得到紅與藍(lán)不同水平的濃度混合，在不同細(xì)胞培養(yǎng)單元呈現(xiàn)深紅-紫(紅加藍(lán)混合呈現(xiàn))-深藍(lán)的色域，如圖3所示。
【主權(quán)項】
1.一種微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由2個濃度梯度生成單元，I?10個混合單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元構(gòu)成，混合單元的入口為濃度梯度生成單元的藥物溶液出口，濃度梯度生成單元的最上端為藥物溶液或培養(yǎng)基入口； 所述的濃度梯度生成單元為一個樹狀的、從上至下逐層增加分支的結(jié)構(gòu)，每個分支的通道為迂回的折線形，最末端分支數(shù)量為混合單元數(shù)量的二分之一，且其每一個出口通過一個微通道與混合單元最上端相連； 所述的混合單元，為濃度梯度單元末端通道分支兩個微通道，混合單元快速微通道和混合單元慢速微通道，混合單元快速微通道為長直通道，混合單元慢速微通道為長迂回的折線形通道，每個混合單元的長直通道與對側(cè)的長迂回的折線形通道相連通，長迂回的折線形通道與長直通道的長度比例可以為I?10:1 ; 所述的細(xì)胞培養(yǎng)單元包括細(xì)胞培養(yǎng)室，上端為混合單元的藥物溶液出口，下端為細(xì)胞培養(yǎng)單元出口。2.—種微流控芯片的制備方法，其特征在于按照以下步驟進行:用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形，包括濃度梯度生成單元、混合單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元；通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。3.—種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于該微流控芯片用于細(xì)胞水平藥物聯(lián)用，按照以下步驟進行: 從細(xì)胞培養(yǎng)室出口將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)單元，使細(xì)胞在靜壓力驅(qū)動下流入細(xì)胞培養(yǎng)室；細(xì)胞貼壁后，入口連接蠕動栗加入不同的藥物或細(xì)胞培養(yǎng)基，使藥物生成濃度梯度后混合進入細(xì)胞培養(yǎng)單元，芯片置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；12?72小時后，可以將微流控芯片置于熒光顯微鏡下，進行藥物對細(xì)胞響應(yīng)參數(shù)的檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于若入口連接蠕動栗加入洗滌溶液，洗滌液流入細(xì)胞培養(yǎng)室對細(xì)胞進行洗滌；若入口連接蠕動栗加入標(biāo)記溶液，標(biāo)記溶液流入細(xì)胞培養(yǎng)室對細(xì)胞進行標(biāo)記。5.按權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于，該微流控芯片以蠕動栗作為藥物微流體流動的驅(qū)動力，不同入口可以使用不同的流速，灌注流速可以為0.5ul/min ?20ul/mino6.按權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于，該微流控芯片可以在一塊芯片上生成多種藥物濃度梯度的不同水平混合，刺激多組細(xì)胞，可同時進行多藥物多水平聯(lián)用的篩選，提高了單位時間的平行篩選能力，適合大規(guī)模的高效的藥物聯(lián)用篩選。7.按權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于，該微流控芯片可以直觀地研究多藥物多水平聯(lián)用對細(xì)胞的作用與影響。8.按權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于，該微流控芯片便于觀察、設(shè)備簡單、樣品和試劑用量小，平行篩選能力高，有利于快速篩選新藥的療效和毒性，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。9.按權(quán)利要求3所述的一種微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于，所述的濃度梯度生成單元生成的藥物溶液經(jīng)混合單元的快速微通道、慢速微通道分別與對側(cè)方向其他藥物溶液的慢速微通道、快速微通道進行高低水平的混合，作用于下游細(xì)胞培養(yǎng)單元中的細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種微流控芯片及其制備方法和應(yīng)用，所述微流控芯片由2個濃度梯度生成單元，1～10個混合單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元構(gòu)成，混合單元的入口為濃度梯度生成單元的藥物溶液出口，濃度梯度生成單元的最上端為藥物溶液或培養(yǎng)基入口。該微流控芯片集成有濃度梯度生成單元和混合單元，最終可生成多種藥物不同水平的濃度混合刺激固定在特定的細(xì)胞培養(yǎng)單元的細(xì)胞，在顯微鏡下可以直觀地研究細(xì)胞在生長過程中對多藥物多水平聯(lián)用的反應(yīng)，為大規(guī)模的藥物聯(lián)用篩選提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域，是一種可廣泛用于各種細(xì)胞分析的新工具。
【IPC分類】C12M3/00
【公開號】CN105713834
【申請?zhí)枴緾N201410735524
【發(fā)明人】秦建華, 李中玉, 許慧
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所