一種氧氟沙星半抗原制備方法及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氧氟沙星半抗原和相應的人工抗原，同時本發(fā)明也公開了所述氧氟沙星半抗原和相應的人工抗原的制備方法及其應用。本發(fā)明提供的氧氟沙星半抗原是式1所示產(chǎn)物，用式1所示產(chǎn)物與載體蛋白連接可以得到氧氟沙星抗原。所述氧氟沙星抗原可應用于制備氧氟沙星特異性抗體。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的氧氟沙星人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生針對氧氟沙星的特異性抗體，可用于制備檢測氧氟沙星殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強等諸多優(yōu)點。
【專利說明】
一種氧氟沙星半抗原制備方法及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，具體涉及一種氧氟沙星半抗原、抗原制備方 法及其應用。
【背景技術】
[0002] 氧氟沙星(Ofloxacin)，別名：氟洛沙星、氧洛沙星、奧氟哌酸，是一種人工合成的 廣譜抗菌藥物。對葡萄球菌、鏈球菌(包括腸球菌）、肺炎鏈球菌、淋球菌、大腸桿菌、枸櫞酸 桿菌、志賀桿菌、肺炎克雷伯桿菌、腸桿菌屬、沙雷桿菌屬、變形桿菌、流感嗜血桿菌、不動桿 菌、螺旋桿菌等有較好的抗菌作用，對銅綠假單胞菌和沙眼衣原體也有一定的抗菌作用。尚 有抗結核桿菌作用，可與異煙胼、利福平并用于治療結核病。
[0003] 該藥已在畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用。氧氟沙星藥物的殘留除其本身的毒副作用 對人體造成直接危害外，更為嚴重的是人類長期食用含較低濃度氧氟沙星藥物的動物源性 食品，容易誘導人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而影響該類藥物的臨床療效，故美國對生產(chǎn)食品 動物使用的管理方式越來越嚴，并禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用氟喹諾酮類藥物;我國以及 世界衛(wèi)生組織、歐盟、日本等國家和組織都將喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥。
[0004] 國內外現(xiàn)已開發(fā)出檢測氧氟沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，但是現(xiàn)在國內生產(chǎn)的試劑盒 在準確性、靈敏度、特異性等方面還不能完全達到檢測的要求。本發(fā)明公開的氧氟沙星半抗 原、抗原為進一步研制氧氟沙星抗體及氧氟沙星酶聯(lián)免疫試劑盒提供了原料。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種氧氟沙星半抗原、抗原制備方法及其應用。
[0006] 本發(fā)明提供的氧氟沙星半抗原，是式1所示化合物：
[0007] 本發(fā)明還公開了式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 100ml圓底燒瓶中加入氧氟沙星原料藥100011^，01^501111，20-24°(：磁力攪拌30-601^11后 加入NHS 797.0mg，EDC 1327.611^，20-24°(：磁力攪拌3-4小時后加入4-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽 696.〇1^，2〇-24°(：磁力攪拌反應過夜，將反應液滴加到30〇1111冰水中，攪拌3〇-4〇1^11析出類 白色固體，過濾，濾餅用20ml水洗，收集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到1052.6 mg氧氟沙 星4-氨基丁酸乙酯中間體。
[0008] 50ml圓底燒瓶中加入1052mg氧氟沙星4-氨基丁酸乙酯中間體，甲醇30ml，20-24°c 磁力攪拌30_60min后滴加1M氫氧化鈉水溶液6.01111，20-24°(：磁力攪拌3-4小時后35-40°(：減 壓濃縮，殘留物中加入20ml水，1M鹽酸調PH到6.5-7，析出類白色固體，過濾，濾餅用10ml水 洗，收集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到840 mg氧氟沙星4-氨基丁酸半抗原。
[0009] 本發(fā)明提供的氧氟沙星抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0010] 本發(fā)明還保護所述氧氟沙星抗原的制備方法，包括如下步驟： 1、將20mg氧氟沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm攪拌lOmin，加入EDC 21.5mg溶解 后再加入NHS 13mg，室溫攪拌(500rpm)活化2-3h。
[0011] 2、稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌lOmin，使其充分溶 解，將步驟1反應液在<4°C冰浴lOOOrpm攪拌條件下，逐滴加入BSA溶液，500rpm攪拌反應 Mlo
[0012] 3、將反應產(chǎn)物裝入蒸餾水沖洗干凈透析袋（10cm)，lL0.01M pH7.2 PBS，4°C攪拌 (lOOrpm)透析3d，每天換液3次（早中晚各一次），共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心 6min，1.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0014] 所述氧氟沙星抗原可以作為免疫原免疫動物制備氧氟沙星特異性抗體，也可以作 為包被原制備酶標板。
[0015] 所述抗體具體可為單克隆抗體。
[0016] 式1所示產(chǎn)物、所述氧氟沙星抗原、所述抗體均可應用于檢測氧氟沙星。
[0017] 本發(fā)明還公布了應用氧氟沙星抗原和氧氟沙星單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫 試劑盒。
[0018] 所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有氧氟沙星抗原的酶標板、酶標抗體工作液、 氧氟沙星系列標準品、底物顯色液、終止液、濃縮復溶液、濃縮洗滌液。
[0019] 本發(fā)明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本 較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的氧氟沙星人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生了針對氧氟沙星 的特異性抗體，用于快速檢測食品中的氧氟沙星殘留。
【附圖說明】
[0020] 圖1為氧氟沙星半抗原的合成路線圖。
[0021] 圖2為氧氟沙星半抗原的質譜檢測結果。
[0022 ]圖3為氧氟沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標準曲線。
【具體實施方式】
[0023] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0024]實施例1、氧氟沙星半抗原的制備 一、氧氟沙星半抗原的制備 100ml圓底燒瓶中加入氧氟沙星原料藥100011^，01^501111，20-24°(：磁力攪拌30-601^11后 加入NHS 797.0mg，EDC 1327.611^，20-24°(：磁力攪拌3-4小時后加入4-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽 696.〇1^，2〇-24°(：磁力攪拌反應過夜，將反應液滴加到30〇1111冰水中，攪拌3〇-4〇1^11析出類 白色固體，過濾，濾餅用20ml水洗，收集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到1052.6 mg氧氟沙 星4-氨基丁酸乙酯中間體。
[0025] 50ml圓底燒瓶中加入1052mg氧氟沙星4-氨基丁酸乙酯中間體，甲醇30ml，20-24°C 磁力攪拌30_60min后滴加1M氫氧化鈉水溶液6.01111，20-24°(：磁力攪拌3-4小時后35-40°(：減 壓濃縮，殘留物中加入20ml水，1M鹽酸調PH到6.5-7，析出類白色固體，過濾，濾餅用10ml水 洗，收集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到840 mg氧氟沙星4-氨基丁酸半抗原。反應方程式 如圖1。
[0026]二、氧氟沙星半抗原的鑒定 對所得產(chǎn)品進行質譜鑒定，見圖2。
[0027]結果顯示其化學結構式如式1所示(MW=446)，即為氧氟沙星半抗原。
[0028]
[0029] 實施例2、氧氟沙星人工抗原的制備和鑒定 一、氧氟沙星免疫抗原的合成 1、將20mg氧氟沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm攪拌lOmin，加入EDC 21.5mg溶解 后再加入NHS 13mg，室溫攪拌(500rpm)活化2-3h。
[0030] 2、稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌lOmin，使其充分溶 解，將步驟1反應液在反應盒中冰浴（<4°C)攪拌（lOOOrpm)中逐滴加入（lml/min)，攪拌 (500rpm)反應 24h。
[0031] 3、將反應產(chǎn)物裝入蒸餾水沖洗干凈透析袋（10cm)，lL0.01M pH7.2 PBS，4°C lOOrpm攪拌，透析3d，每天換液3次(早中晚各一次），共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心 6min，1.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032]二、氧氟沙星包被抗原的合成 1、將20mg氧氟沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm攪拌lOmin，加入EDC 21.5mg溶解 后再加入NHS 13mg，室溫攪拌(500rpm)活化2-3h。
[0033] 2、稱取OVA 33.6mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌lOmin，使其充分 溶解，將步驟1反應液在〈4 °C冰浴1 OOOrpm攪拌條件下，逐滴加入BSA溶液，500rpm室溫攪拌 反應24h。
[0034] 3、將反應產(chǎn)物裝入蒸餾水沖洗干凈透析袋（10cm)，lL 0.01M pH7.2PBS，4°C lOOrpm攪拌透析3d，每天換液3次(早中晚各一次），共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心 6min，1.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035] 實施例3、酶標單抗的制備和特異性鑒定 一、氧氟沙星單抗的制備 1、用上述制備出的免疫原按l〇〇yg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積 混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏 不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復合物lOOyg/只，不加弗氏佐 劑再追加免疫一次。
[0036] 2、按常規(guī)方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞 (SP2/0)混合，然后在45 s內緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮 均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用 HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進行全換液。
[0037] 3、細胞融合后，待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細 胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性 血清稀釋度)包被酶標板，加入被測孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，(PD進行顯色反應。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細胞上清與100 yg/mL的氧氟沙星等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標板中。同時用 PBS取代氧氟沙星作對照，其余步驟同上。若經(jīng)氧氟沙星阻斷后的0D 45Qnm值下降到對照孔的 50%以下，則判為陽性，經(jīng)2~3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。 [0038] 4、將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測定效 價，凍存;并取8~10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7~10日后腹腔注射雜交瘤 細胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0039]二、酶標抗體的制備 (1) 稱取辣根過氧化物酶（HRP)2 mg溶解于0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/L NaI〇4溶液，4°C避光作用30 min; (2) 加入160 mmol/L的乙二醇0.5mL，室溫作用30 min; (3) 加入步驟一制備的氧氟沙星單抗2 mg，混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 mL 的0.05 mmol/L碳酸鈉緩沖液中透析，4°C過夜； (4) 透析液吸至10 mL的離心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混勻后置4°C2 h; (5) 加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C作用30 min后4°C下3000 r/min離心25 min，棄 上清； (6) 將沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋內，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4°C過夜（中途更換PBS 3次）； (7) 將透析袋中液體吸至微量離心管中，4°C下10000r/min離心30min，將上清液吸出， 加等量甘油，混勻，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 三、酶標氧氟沙星抗體效價的測定 氧氟沙星標準品購自Sigma公司。
[0041] 用方陣滴定法確定氧氟沙星包被抗原和步驟一制備的單抗的工作濃度，氧氟沙星 包被抗原的工作濃度為1.6yg/mL，單克隆抗體的工作濃度為1:60000。
[0042] 用不同濃度的氧氟沙星標準品溶液做實驗溶液，其濃度如下：0、0.6、1.8、5.4、 16.2、48.6yg/L。采用8組平行試驗(n=8)。間接競爭性ELISA方法： (1)用上述工作濃度的氧氟沙星抗原包被酶標板，將氧氟沙星標準品實驗溶液與酶標 抗體溶液同時加入酶標板微孔中，再在每孔中加入50 yL抗體工作液，同時設置空白孔(將 添加的抗體溶液換成高純水，其它一致)和陰性對照孔(將標準品實驗溶液用PBS溶液代替， 其它一致），25°C避光環(huán)境中反應30min; (2 )倒出孔內液體，用洗滌液洗滌3~5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干； (3 )加入底物顯色溶液到酶標板微孔中，25 °C避光環(huán)境中反應15min; (4)加入終止液，輕輕振蕩混勻，用酶標儀在波長450nm處測定0D值。
[0043] 以0D值為縱坐標，以氧氟沙星實驗溶液濃度的loglO值為橫坐標，繪制半對數(shù)標準 曲線圖。標準曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺和下平臺，標準曲線的平行測定次數(shù)8 次，實驗重復性良好，相對標準偏差(變異系數(shù))均在1 〇 %以內。
[0044] 根據(jù)標準曲線得出半數(shù)抑制量(IC5Q)，確定檢測靈敏度。
[0045] 抑制率用以下式計算：
式中：ODmax:為不加標準品時的吸光值，ODx為標準品X時的吸光值，ODmin為空白對照 孔的吸光值。
[0046]由上述公式計算得氧氟沙星抗體在緩沖液中的半數(shù)抑制量(IC5Q)為1.9yg/L。
[0047] 實施例4、檢測氧氟沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備 一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質組成： (1)包被氧氟沙星抗原的酶標板； (2 )酶標氧氟沙星抗體工作液:實施例3中所述酶標抗體溶液； (3) 氧氟沙星標準品:氧氟沙星標準品溶液濃度分別為0、0.6、1.8、5.4、16.2、48.6yg/ L； (4) 底物顯色液：由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1%四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)的水溶液； (5 )終止液:0.2M硫酸水溶液； (6) 濃縮洗滌液:每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的：將10mL吐溫-20、5g疊 氮化鈉和990mL磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液;所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01M pH 值為7.4; (7) 濃縮復溶液:0.04mo 1/L的磷酸鹽緩沖液。
[0048] 二、包被有氧氟沙星抗原的酶標板及其制備 包被氧氟沙星抗原的聚苯乙烯酶標板:用〇. 05M的碳酸鹽溶液將抗原稀釋至1.6yg/mL， 包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100yL，37 °C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次 l〇s，拍干，然后在每孔中加入150yL封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空 密封保存。
[0049]包被緩沖液:pH9.6，0.05mol/L的碳酸鈉緩沖液； 封閉液:每1升封閉液按照如下方法配制：將5mL馬血清、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合， 用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至l〇〇〇mL，得到封閉液;其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02M，pH 值為7.2。
[0050]三、試劑盒檢測方法 (一)樣品前處理 (1)雞肉、鴨肉 a)準確稱取1±0.01 g新鮮樣品于50 mL離心管中；b)雞肉樣本:加入4 mL雞肉樣 品提取液;鴨肉樣本:加入4 mL鴨肉樣品提取液，渦動2 min; c) 4000 g離心10 min;d) 取500 mL上清液于心的離心管中；e)加入500 mL樣品稀釋液，渦動10s;f)取50 mL上清液 進行檢測。
[0051 ] (2)純牛奶 a)將純牛奶樣品充分平衡至室溫(25±2°C)，混勻;b)取50 mL純牛奶樣品于離心管 中，加入450 mL樣品稀釋液，渦動20 s;c)取50 mL進行檢測。
[0052] (3)牛肉、豬肉、豬肝、雞肝 a)準確稱取1±0.01 g均質后的樣品于離心管中；b)加入0.5mL樣品稀釋液，渦動 20s; c)再加入4.5mL乙腈，立即渦動至組織完全分散;d)室溫（25 ±2°C)下，搖床300rpm振 搖20min;e)4000g以上，離心10min;f)取lmL上清液于新的離心管中；g) 50-60°C水浴中， 氮氣吹干;h)加入2mL正己烷，渦動20 s，再加入1 mL樣品稀釋液，渦動10s;i) 4000 g以 上，離心5min，完全棄去上層正己烷及中間層雜質；j)豬肉樣品：直接取50 mL進行檢測；牛 肉、豬肝、雞肝樣品：取100 mL與100 yL樣品稀釋液，渦動20s后，取50mL進行檢測。
[0053](二)用試劑盒檢測 1、 標準曲線的制作 向包被有氧氟沙星抗原的酶標板微孔中加入氧氟沙星標準品溶液50yL，然后加入酶標 二抗工作液50 μ!7孔，再在每孔中加入50 yL抗體工作液，輕輕振蕩混合均勻，用蓋板膜蓋 板后置25 °C避光環(huán)境中反應40min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液 260mL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10s，棄去板孔內洗滌液，用吸水紙拍干。加入底物A液 50 μ!7孔、底物B液50 μ!7孔，輕輕振蕩混勻，25°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液 50yL，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。
[0054]用每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準）的 吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以氧氟沙星標準品濃度(yg/L)的半對數(shù)值 為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。得到的標準曲線如圖3所示。
[0055]百分吸光度值(％)=(Β/Β0) X100% 2、 樣品中氧氟沙星濃度的測定 用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準）的吸光度值 (Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對應每一個檢測樣本溶液的百分吸光度值，則可從 標準曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標準品溶液的濃度值換算出樣本溶液中 氧氟沙星的殘留量，最后再乘以各樣品前處理過程的稀釋倍數(shù)，即可計算出樣品中氧氟沙 星的濃度。
[0056]四、試劑盒檢測效果評價 (一)準確度和精密度試驗 向不含氧氟沙星的雞肉、豬肉樣品中添加氧氟沙星標準品，使氧氟沙星標準品在樣品 中的終濃度分別為4、8、16 yg/L;將添加后的樣品分別按照實驗三中所述方法進行前處理， 得到檢測樣本溶液。
[0057]從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，檢測方法如實驗三中所 述，每個實驗重復5次，分別計算變異系數(shù)。結果分別見表1。
[0058]表1準確度和精密度試驗結果
批內變異系數(shù):同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)。
[0059] 批間變異系數(shù):同一樣本在不同批次測定結果的變異系數(shù)，取其平均值。
[0060] 結果表明：雞肉樣品的平均添加回收率在90.4~97.5%，批內變異系數(shù)在4.2~ 12.0%，批間變異系數(shù)在7.4~9.9%;豬肉樣品的平均添加回收率在91.1~102.3%，批內變異系 數(shù)在6.2~12.6%，批間變異系數(shù)在8.4~9.7%。
[0061] (二)試劑盒保存期 試劑盒保存條件為2~8°C，經(jīng)過15個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(0標準），50%抑 制濃度、氧氟沙星添加實際測定值均在正常范圍之內。考慮到運輸和使用過程中，會有非正 常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存的條件下放置9天，進行加速老化實驗，結果表明該 試劑盒的各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入_20°C冰箱冷 凍9天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2~8°C 至少可以保存12個月以上。
[0062](三)交叉反應率試驗 選擇與氧氟沙星結構或功能相似的其他藥物進行交叉反應試驗，通過各種藥物的標準 曲線分別得到其50%抑制濃度。計算試劑盒對其它類似物的交叉反應率，與其他藥物的交叉 反應率越小，說明氧氟沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對氧氟沙星的檢測特異性越好。結果見表 2〇
[0063]表2氧氟沙星試劑盒交叉反應率
試驗結果表明，本發(fā)明試劑盒對氧氟沙星的交叉反應率為100%、培氟沙星、達氟沙星、 洛美沙星和諾氟沙星的交叉反應率均小于1%，所以試劑盒對氧氟沙星的特異性好，即本發(fā) 明試劑盒可以用于檢測氧氟沙星。
【主權項】
1. 一種氧氣沙星半抗原，為式1所示產(chǎn)物：2. 式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 100ml圓底燒瓶中加入氧氣沙星原料藥1000111旨，01。501111，20-24°(：磁力攬拌30-60111111后 加入NHS 797.Omg，邸C 1327.6mg，20-24°C磁力攬拌3-4小時后加入4-氨基下酸乙醋鹽酸鹽 696.0111邑，20-24°(：磁力攬拌反應過夜，將反應液滴加到3001111冰水中，攬拌30-40111111析出類 白色固體，過濾，濾餅用20ml水洗，收集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到1052.6mg氧氣沙星 4-氨基下酸乙醋中間體； 50ml圓底燒瓶中加入1052mg氧氣沙星4-氨基下酸乙醋中間體，甲醇30ml，20-24°C磁力 攬拌30-60min后滴加1M氨氧化鋼水溶液6.01111，20-24°(：磁力攬拌3-4小時后35-40°(：減壓濃 縮，殘留物中加入20ml水，1M鹽酸調PH到6.5-7，析出類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收 集濾餅50°C鼓風干燥5-6小時得到840 mg氧氣沙星4-氨基下酸半抗原。3. -種氧氣沙星抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。4. 根據(jù)權利要求3所述的氧氣沙星抗原，其特征在于，所述載體蛋白可為牛血清白蛋 白，卵清蛋白，人血清白蛋白，鼠血清白蛋白，甲狀腺蛋白或血藍蛋白。5. 權利要求3所述氧氣沙星抗原的制備方法，包括如下步驟： (1) 將20mg氧氣沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200巧m攬拌lOmin，加入邸C 21.5mg溶解 后再加入畑S 13mg，室溫攬拌巧00巧m)活化2-化； (2) 稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氨鋼溶液中，200巧m攬拌lOmin，將步驟（1)反應 液在<4°C冰浴1000巧m攬拌條件下，逐滴加入到BSA溶液中，500巧m攬拌反應24h; (3) 將反應產(chǎn)物裝入蒸饋水沖洗干凈透析袋，1L 0.01M PH7.2 PBS，4°C 10化pm攬拌透 析3天，將透析產(chǎn)物5000巧m離屯、6min，l .5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 權利要求3所述氧氣沙星抗原在制備氧氣沙星特異性抗體中的應用。7. 應用權利要求3所述氧氣沙星抗原制備得到的特異性抗體。8. 權利要求1所述產(chǎn)物、權利要求3所述氧氣沙星抗原、權利要求7所述抗體在檢測氧氣 沙星中的應用。9. 應用權利要求1所述產(chǎn)物、權利要求3所述氧氣沙星抗原、權利要求7所述特異性抗體 制備得到的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。10. 權利要求9所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，它包括:包被有氧氣沙星抗原的 酶標板、酶標抗體工作液、氧氣沙星系列標準品、底物顯色液、終止液、濃縮復溶液、濃縮洗 涂液。
【文檔編號】C07K14/47GK106083890SQ201610513422
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】曹罡, 吳雨洋, 王照鵬, 劉薇, 秦譽, 覃丹鳳
【申請人】北京明日達科技發(fā)展有限責任公司