本發(fā)明涉及一種栽培菌種的制備方法，具體是一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌枝條菌種的制備方法。
背景技術(shù)：
食用菌生產(chǎn)無(wú)公害、純天然，可循環(huán)、可再生、環(huán)保。食用菌已成為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中繼糧、棉、油、果、菜后的第六大宗農(nóng)產(chǎn)品；在農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程中食用菌產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的排頭兵和主力軍；國(guó)務(wù)院發(fā)展研究中心的侯正祥稱，作為朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)食用菌即將超過(guò)中國(guó)的糧棉油產(chǎn)業(yè)，超過(guò)中國(guó)的汽車產(chǎn)業(yè)。
進(jìn)入新世紀(jì)，我國(guó)食用菌生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展日新月異，在許多技術(shù)領(lǐng)域不斷突破，正由食用菌大國(guó)向食用菌強(qiáng)國(guó)邁進(jìn)。然而食用菌栽培菌種制備技術(shù)工藝卻始終困擾食用菌生產(chǎn)。
原因在于目前生產(chǎn)中普遍使用的“固體菌種”(包括枝條菌種)存在制種周期長(zhǎng)，隱性污染幾率大，菌齡不齊和難以標(biāo)準(zhǔn)化管理等弊端，導(dǎo)致生產(chǎn)者成本升高，生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)加大。近年來(lái)普遍推廣使用的“液體菌種”技術(shù)制種周期縮短，菌齡整齊，生產(chǎn)效率高，比傳統(tǒng)固體菌種具有明顯優(yōu)勢(shì)。
然而，由于液體菌種對(duì)生產(chǎn)設(shè)備設(shè)施條件要求高，對(duì)生產(chǎn)人員的操作專業(yè)水平要求高，對(duì)運(yùn)輸和儲(chǔ)藏的技術(shù)條件要求高，比較適合規(guī)模化、機(jī)械化的工廠化生產(chǎn)應(yīng)用，而對(duì)于目前國(guó)內(nèi)仍占多數(shù)的傳統(tǒng)勞動(dòng)集約化生產(chǎn)模式來(lái)說(shuō)，使用液體菌種存在較大風(fēng)險(xiǎn)。自上世紀(jì)90年代起，我國(guó)不少科研院所、企業(yè)在整體技術(shù)、設(shè)備投入不完善、不成熟的條件下，急于推廣應(yīng)用食用菌液體菌種，造成大面積污染、絕大多數(shù)設(shè)備閑置、浪費(fèi)，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)食用菌生產(chǎn)對(duì)液體菌種的應(yīng)用態(tài)度曖昧，褒貶不一，生產(chǎn)者不得不又回歸“固體菌種”時(shí)代。因此我國(guó)食用菌液體菌種制備技術(shù)亟待創(chuàng)新與升級(jí)。
因此，開(kāi)發(fā)一種將液體菌種技術(shù)與固體菌種工藝相結(jié)合的食用菌菌種制備方法，集成食用菌液體菌種活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快和固體菌種易保存、使用方便的綜合優(yōu)勢(shì)，不僅是生產(chǎn)需要的，也是可行的。
一次性竹筷在我國(guó)使用數(shù)量巨大，大多成為廢棄物造成污染和浪費(fèi)。而竹筷的主要成分是纖維素，對(duì)于食用菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是適宜的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，可以用來(lái)作為培養(yǎng)食用菌的載體，尤其是制備食用菌枝條菌種的良好材料。枝條菌種是食用菌生產(chǎn)中經(jīng)常使用的一類固體菌種形式。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌種的制備方法，該方法提高了菌種質(zhì)量和生產(chǎn)效率。
為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌種的制備方法，包括以下步驟：
(1)竹筷經(jīng)過(guò)清洗，使竹筷吸透水，然后將竹筷打毛，使竹筷表面變粗糙；
(2)將食用菌菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)；
(3)配置液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基包括葡萄糖2.00g～2.50g/100mL，酵母浸出物0.20g～0.30g/100mL，磷酸二氫鉀0.20g～0.25g/100mL，硫酸鎂0.10g～0.15g/100mL,121℃滅菌20min。液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氫鉀0.25g/100mL，硫酸鎂0.15g/100mL。
(4)將PDA斜面培養(yǎng)基中活化好的食用菌菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中。
(5)在發(fā)酵溫度為24～26℃，優(yōu)選25℃，搖床轉(zhuǎn)速為160～180r/min(搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選180r/min)條件下發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為6d。
(6)將發(fā)酵好的液體菌絲球打碎，用無(wú)菌水稀釋倍數(shù)300-500倍獲得液體菌種。
(7)配制種包栽培輔料，所述種包栽培輔料包括以下質(zhì)量百分比組分：木屑40％、棉籽殼50％、麩皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述種包栽培輔料加水至60％的含水量。
(8)種包栽培輔料內(nèi)排滿處理好的竹筷，數(shù)量為120-140支竹筷/包，竹筷的間隙和表面用輔料覆蓋。
(9)將種包放入蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽壓力下對(duì)竹筷滅菌40-50分鐘；滅菌完成后，袋袋溫降到33℃以下，接種培養(yǎng)好的食用菌液體菌絲，接種量為20-25mL/包。
在食用菌技術(shù)研究及生產(chǎn)應(yīng)用中，一般的固體基質(zhì)(竹筷等)的滅菌條件為0.138MPa，126℃，滅菌120分鐘左右，這種滅菌條件耗時(shí)耗能，而且造成竹筷基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分的流失。本發(fā)明的滅菌參數(shù)不僅能夠起到很好的滅菌效果，而且減少了竹筷基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分的流失和能源的浪費(fèi)，其技術(shù)原理是：利用液體菌接種竹筷枝條萌發(fā)快、生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)(液體菌絲可以迅速布滿竹筷表面并向內(nèi)部生長(zhǎng)，使食用菌菌絲生長(zhǎng)處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，從而抑制雜菌生長(zhǎng))，在適當(dāng)降低滅菌參數(shù)的同時(shí)，不會(huì)影響竹筷表面食用菌菌絲正常生長(zhǎng)；另一方面，由于本發(fā)明的滅菌參數(shù)降低了處理溫度，縮短了處理時(shí)間，從而減少了竹筷基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分的流失和能源的浪費(fèi)。
液體菌轉(zhuǎn)接竹筷枝條包時(shí)，接種量的大小直接影響接種后菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)效果。如果接種量小，不僅菌絲生長(zhǎng)緩慢，而且較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期容易造成枝條被雜菌污染。若接種量大，不僅造成資源浪費(fèi)，而且對(duì)衛(wèi)生環(huán)境和制冷、通風(fēng)設(shè)備要求高，無(wú)法適應(yīng)技術(shù)力量薄弱，菌種技術(shù)人員不足的工廠，特別是無(wú)法很好地適用于分散式種植農(nóng)戶。更重要的是，接種量大，會(huì)在枝條表面形成一層菌粘膜，菌粘膜將阻礙外部新鮮空氣進(jìn)入，這將導(dǎo)致內(nèi)部菌絲因缺氧而無(wú)法正常生長(zhǎng)，最終造成雜菌侵染，增加液體菌種的使用風(fēng)險(xiǎn)。20-25mL/140枝/包的接種量克服了上述的矛盾，在確保萌發(fā)效果的基礎(chǔ)上，減少資源的浪費(fèi)，避免在枝條表面形成一層菌粘膜，不會(huì)阻礙新鮮空氣的進(jìn)入，確保了氧氣的正常供應(yīng)，保證了菌絲的正常生長(zhǎng)。
(10)將接種好的種包袋置于26℃條件下培養(yǎng),當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿袋后，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，使包內(nèi)竹筷長(zhǎng)滿菌絲。
本發(fā)明將食用菌液體菌種代替固體培養(yǎng)物接種竹筷，結(jié)合食用菌枝條菌種培養(yǎng)技術(shù)，形成“液體菌種+竹筷”的食用菌菌種制備工藝，一方面改進(jìn)了原來(lái)液體菌種技術(shù)操作難，易污染的不足，同時(shí)提高了傳統(tǒng)枝條菌種質(zhì)量和生產(chǎn)效率，使枝條菌種生產(chǎn)周期縮短至原來(lái)的2/3，生產(chǎn)性狀無(wú)明顯下降，且具有萌發(fā)快的優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施方式
試驗(yàn)菌種：杏鮑菇。
PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL，pH自然。
(1)將一次性竹筷(如廢舊一次性竹筷)截成長(zhǎng)7.5cm、直徑0.5公分長(zhǎng)條，竹筷經(jīng)過(guò)清洗，使竹筷吸透水，然后將竹筷打毛，使竹筷表面變粗糙。
(2)將食用菌菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。
(3)配置液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氫鉀0.25g/100mL，硫酸鎂0.15g/100mL，121℃滅菌20min。
(4)將PDA斜面培養(yǎng)基中活化好的食用菌菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中。
(5)在發(fā)酵溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為6d。
在上述液體培養(yǎng)基及發(fā)酵條件下，發(fā)酵菌絲體生物量(干重)可達(dá)到1.93g/100mL，產(chǎn)量提高了1.24倍。
(6)將發(fā)酵好的液體菌絲球打碎，用無(wú)菌水稀釋倍數(shù)500倍獲得液體菌種。
純菌種在不同稀釋度條件下，當(dāng)接種量為10mL/袋時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，當(dāng)接種量為20mL/袋和30mL/袋時(shí)的菌絲生長(zhǎng)速度基本一致，都在同一天長(zhǎng)滿栽培袋的，而且其菌絲生長(zhǎng)速度都大于接種量為10mL/袋時(shí)的生長(zhǎng)速度。稀釋500倍的菌種的菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)也是最快。所以綜合來(lái)看，純菌種的最佳稀釋倍數(shù)為500倍。
(7)配制種包栽培輔料，所述種包栽培輔料包括以下質(zhì)量百分比組分：木屑40％、棉籽殼50％、麩皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述種包栽培輔料加水至60％的含水量。
(8)種包栽培輔料內(nèi)排滿處理好的竹筷，數(shù)量為140支竹筷/包，竹筷的間隙和表面用種包栽培輔料覆蓋。
(9)將種包放入蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽壓力下對(duì)竹筷滅菌50分鐘；滅菌完成后，待袋溫降到33℃以下，接種培養(yǎng)好的食用菌液體菌絲，接種量為25mL/包。
當(dāng)接種量為20mL/包時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)與接種量為25mL/包時(shí)無(wú)明顯的區(qū)別，基本相當(dāng)。
(10)將接種好的種包袋置于26℃條件下培養(yǎng),當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿袋后，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，使包內(nèi)竹筷長(zhǎng)滿菌絲。
當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿袋后，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天進(jìn)行擴(kuò)大栽培；，使包內(nèi)竹筷內(nèi)部長(zhǎng)滿菌絲。
由于液體菌種生長(zhǎng)迅速，接種竹筷后，竹筷制種包發(fā)菌速度明顯加快。采用傳統(tǒng)制備工藝生產(chǎn)枝條種周期為30-40天，利用“液體菌種+竹筷”技術(shù)，菌種生產(chǎn)周期為20-25天。
上述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。