本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種胱天蛋白酶募集域蛋白6(caspase recruitment domain-containing protein 6,CARD6)作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂肪肝包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病，兩者都是全球常見的慢性肝病。隨著生活方式的和飲食結(jié)構(gòu)的影響，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率逐年增加，已成為危害人類健康的三大肝病之一。非酒精性脂肪性肝是遺傳、環(huán)境、代謝應(yīng)激等多因素影響造成的疾病，而肥胖、高脂血癥、糖尿病、高胰島素血癥和收縮壓升高是其高危因素。

糖尿病是一種常見的有遺傳傾向的內(nèi)分泌代謝病。隨著人們生活方式的改變，尤其是高能量食品的攝入過多及體力活動(dòng)減少，糖尿病的發(fā)病率大幅上升，已嚴(yán)重危害到人們身體的健康，其中以Ⅱ型糖尿病患者居多。Ⅱ型糖尿病約占糖尿病患者的90％，多發(fā)于40歲以上的成年人或老年人，是由于體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)不足、靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)的代謝紊亂型疾病。長(zhǎng)期存在的高血糖，會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生。對(duì)身體的各種組織產(chǎn)生損害，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害以及功能障礙。

糖尿病人群發(fā)生非酒精性脂肪肝的機(jī)制可能為糖尿病患者存在胰島素抵抗和胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，胰島素抑制脂肪酶活性下降，外周脂肪組織分解增多，游離脂肪酸增多，肝臟對(duì)游離脂肪酸氧化和利用不足，脂化形成甘油三酯增加，大量甘油三酯生成超過肝臟運(yùn)轉(zhuǎn)的能力，在肝細(xì)胞內(nèi)聚集，引起肝細(xì)胞變性、腫大，形成脂肪肝。故糖尿病患者更易發(fā)生脂肪肝，早期干預(yù)尤為重要。非酒精性脂肪肝性肝病不僅可導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)異常、失代償期肝硬化、肝功能衰竭等嚴(yán)重肝病，也與心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、代謝綜合征的發(fā)生存在密切聯(lián)系，嚴(yán)重威脅著人們的健康。因此，非酒精性脂肪性肝合并Ⅱ型糖尿病的治療越來越受到重視。

胱天蛋白酶募集域蛋白6是CARDs家族的重要成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)人類28個(gè)CARDs和小鼠21個(gè)CARDs相關(guān)蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各個(gè)組織器官中[1]。人類CARD6基因定位于5號(hào)同源染色體上，且人類CARD6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在絕大多數(shù)組織器官中表達(dá)，而小鼠的CARD6的mRNA高表達(dá)于脾臟、肝臟等組織中。此外，CARD6編碼的序列有1037個(gè)氨基酸殘基，其中包括有4個(gè)關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，N-末端包含的一個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，同時(shí)連接著一個(gè)富含谷氨酸的結(jié)構(gòu)域(GARR)和一個(gè)核心氨基酸結(jié)構(gòu)域，C-末端包含一個(gè)富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(PRR)，且人類與小鼠在氨基酸序列上的一致性高達(dá)53.2％[2]。CARD6可與蛋白激酶RIP家族成員形成復(fù)合體，是NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)及TLR樣受體(Toll-like receptors,TLRs)通路的重要媒介物，在機(jī)體先天性及后天性免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答等各方面起重要調(diào)控作用[3-5]。

參考文獻(xiàn)：

[1].Inohara,N.,et al.,Nod1,an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB.J Biol Chem,1999.274(21):p.14560-7.

[2].Werts,C.,S.E.Girardin and D.J.Philpott,TIR,CARD and PYRIN:three domains for an antimicrobial triad.Cell Death Differ,2006.13(5):p.798-815.

[3].Bouchier-Hayes,L.and S.J.Martin,CARD games in apoptosis and immunity.EMBO Rep,2002.3(7):p.616-21.

[4].Stehlik,C.,et al.,CARD6 is a modulator of NF-kappa B activation by Nod1-and Cardiak-mediated pathways.J Biol Chem,2003.278(34):p.31941-9.

[5].Dufner,A.,S.Pownall and T.W.Mak,Caspase recruitment domain protein 6 is a microtubule-interacting protein that positively modulates NF-kappaB activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006.103(4):p.988-93.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種CARD6基因的表達(dá)與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因CARD6的新用途，進(jìn)而把CARD6基因應(yīng)用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57小鼠、構(gòu)建條件性敲除的CARD6蛋白正常表達(dá)的CARD6 Flox小鼠與肝細(xì)胞特異性CARD6基因敲除(CARD6 KO)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究CARD6基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CARD6 Flox小鼠對(duì)比，CARD6基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的CARD6 Flox小鼠，空腹血糖水平高于對(duì)照組CARD6 Flox小鼠。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CARD6基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的CARD6 KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明CARD6基因敲除會(huì)加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，CARD6基因能夠改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導(dǎo)的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，CARD6具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護(hù)肝功能，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。

針對(duì)CARD6的上述功能，提供CARD6作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)肝臟及維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)CARD6的上述功能，提供CARD6作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

以上藥物是指能夠促進(jìn)CARD6基因表達(dá)的藥物。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CARD6基因的新功能，即CARD6基因具有能夠保護(hù)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于CARD6在保護(hù)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說明

圖1是肝細(xì)胞特異性CARD6基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖

圖2是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖3是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖4是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；

A為肝臟重量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖5是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的HE和油紅O染色圖。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源：選用8-10周齡、體重在24g-27g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司)、CARD6蛋白正常表達(dá)的CARD6 Flox小鼠(由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心李紅良老師實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)以及肝細(xì)胞特異性CARD6基因敲除(CARD6 KO)小鼠(由CARD6 Flox小鼠與肝臟特異性Alb-Cre(購(gòu)自The Jackson Laboratory，貨號(hào)003574)轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

肝細(xì)胞特異性CARD6基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1)：

根據(jù)CARD6基因信息，利用CRISPR Design(網(wǎng)址http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子3和外顯子4的非編碼區(qū)中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為：

CARD6-sgRNA1：GgAGAGTAGGCAACATGACT TGG

CARD6-sgRNA 2：gGTGAAAGCAGTTATCAGTA GGG

此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(Donor Vector)pBluescript SK(+)-2loxp，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子4以及兩個(gè)同向的loxp序列。

①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4 DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

②供體載體(Donor Vector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物(表1)用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂以及中間的外顯子部分。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物連入經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切的條件性敲除骨架載體中，得到Donor Vector。

表1用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂以及中間的外顯子部分的引物

③打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體(pST1374-Cas9)用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7 mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進(jìn)行純化。

④CARD6 Flox條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得CARD6 Flox純合小鼠。

⑤肝細(xì)胞特異性CARD6基因敲除小鼠的制作

將上述CARD6 Flox小鼠與肝臟特異性Alb-Cre(購(gòu)自The Jackson Laboratory，貨號(hào)003574)轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到CARD6f^lox/flox/Alb-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝臟細(xì)胞特異性CARD6基因敲除小鼠。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進(jìn)食。

【實(shí)施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即Flox NC組，KO NC組，F(xiàn)lox HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。

(2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：

采用Flox與KO小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確CARD6基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即Flox NC組，KO NC組，F(xiàn)lox HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測(cè)1次。實(shí)驗(yàn)第22周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力。第24周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用。

【實(shí)施例2】小鼠體重、血糖水平測(cè)定

(1)小鼠空腹體重檢測(cè)

1)體重檢測(cè)。

①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實(shí)驗(yàn)操作。

②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周、20周、24周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測(cè)量體重記錄數(shù)據(jù)。

(2)空腹血糖水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)操作。

①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測(cè)狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測(cè)：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。

Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)lox小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與CARD6 KO小鼠24周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始HFD組的CARD6 KO小鼠體重明顯高于HFD組的CARD6 Flox小鼠體重，一直持續(xù)到第24周(見圖2A)；經(jīng)空腹血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第4周、8周、12周、16周、20周、24周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，HFD組的CARD6 KO小鼠空腹血糖水平也明顯高于CARD6 Flox組小鼠空腹血糖水平(見圖2B)。表明CARD6基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，CARD6基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明CARD6基因在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【實(shí)施例3】葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實(shí)驗(yàn)第22周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。

(1)在測(cè)血糖之前，先測(cè)量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測(cè)葡糖糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測(cè)完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測(cè)小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測(cè)時(shí)間。

進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第22周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的CARD6 Flox小鼠和CARD6-KO小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時(shí)血糖)，在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且CARD6-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時(shí)一直處于高于CARD6 Flox小鼠的血糖水平(圖3A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)CARD6 Flox小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，CARD6 KO HFD組的AUC顯著大于CARD6 Flox HFD組的AUC(圖3B)，表明CARD6對(duì)維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的調(diào)控能力。

【實(shí)施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測(cè)定

(1)終末肝臟組織取材

1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤(rùn)濕。

2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。

4)石蠟標(biāo)本：切取部分肝臟置于10％中性福爾馬林中固定。冰凍標(biāo)本：切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。

2.肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1)肝臟脫水，透明，浸蠟

切取10％中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標(biāo)記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機(jī)器上設(shè)置以下程序，①脫水：75％酒精(45分鐘)→75％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→無水酒精(1小時(shí))→無水酒精(1小時(shí))；②透明：二甲苯(1小時(shí))→二甲苯(1小時(shí))；③浸臘(65℃)：石蠟(1小時(shí))→石蠟(1小時(shí))。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進(jìn)機(jī)器籃筐內(nèi)，啟動(dòng)上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時(shí)清洗機(jī)器備用。

2)肝臟組織切片

使用切片機(jī)切片(切片厚度5μm)。

3)肝臟組織蘇木精-伊紅(HE)染色

將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱(30分鐘)→二甲苯中(5分鐘×3次)→100％酒精(1分鐘)→90％酒精(1分鐘)→70％酒精(1分鐘)→蒸餾水洗→蘇木素(5分鐘)→自來水洗去切片上的浮色→1％鹽酸酒精(1至3秒)→自來水洗數(shù)下→Scott促藍(lán)液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL)(1分鐘)→自來水洗數(shù)下→伊紅(1分鐘)→蒸餾水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分鐘×3次)→在二甲苯未干時(shí)封片，拍照。

4)肝臟組織油紅O染色

①將冰凍肝臟組織切片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干30分鐘，4％多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。

②以60％異丙醇處理1分鐘。

③用油紅O(公司sigma，貨號(hào)O0625，濃度0.5克/100mL 100％異丙醇)染色30分鐘。

④之后以60％異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。

⑤用Mayer’s蘇木素染液(5滴)淡染細(xì)胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，充分水洗，水洗至細(xì)胞核藍(lán)化。

⑦用甘油明膠封片，拍照。

肝臟重量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，在HFD組的CARD6 KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的CARD6 Flox小鼠高。進(jìn)一步通過組織切片，進(jìn)行HE和油紅O染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到CARD6 Flox組小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細(xì)胞形態(tài)已幾乎完全破壞，而CARD6-KO組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)變化更為嚴(yán)重(如圖5上)。通過肝臟油紅O染色來檢測(cè)肝組織中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的CARD6 Flox小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積，而在HFD組的CARD6 KO小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著(如圖5下)。這些結(jié)果說明CARD6基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。

上述結(jié)果顯示CARD6 KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明CARD6基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明CARD6基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 胱天蛋白酶募集域蛋白6在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> CARD6-sgRNA1

<400> 1

ggagagtagg caacatgact tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> CARD6-sgRNA 2

<400> 2

ggtgaaagca gttatcagta ggg 23

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 104

<212> DNA

<213> CARD6-F

<400> 7

ggggtaccgt atagatttgt taaaaatgaa agtagagtag gcaacatgat aacttcgtat 60

agcatacatt atagcaattt atacttggag tgaaccaact cttg 104

<210> 8

<211> 112

<212> DNA

<213> CARD6-R

<400> 8

ataagaatgc ggccgcaccc tgtaggtgtg tgccaccttg cccagccaga ccctacataa 60

attgctataa tgtatgctat acgaagttat tgataactgc tttcacagtt cc 112