本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、氣單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，單極鞭毛，運(yùn)動(dòng)極為活潑，常居河流、污水、淤泥等水環(huán)境中，甚至也生存于供水系統(tǒng)中。氣單胞屬菌中，嗜水氣單胞菌(a.hydrophila)、維氏氣單胞菌(a.veronii)和豚鼠氣單胞菌(a.cariae)在臨床中最為常見，可造成創(chuàng)口感染、胃腸道感染、血流感染、軟組織感染，甚至?xí)鹞胄苑窝缀蛪乃佬越钅ぱ装閿⊙Y而引起人死亡。

2、當(dāng)前，氣單胞菌屬的基因修飾通常依賴于自殺質(zhì)粒基礎(chǔ)上的同源重組方法。這一技術(shù)需要較長的同源臂(大約800bp)，并且首先需要構(gòu)建自殺質(zhì)粒以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的插入、敲除或點(diǎn)突變等操作。然而，這種方法操作復(fù)雜且效率較低，受到限制性酶切位點(diǎn)的約束，導(dǎo)致其在氣單胞菌基因組研究和改造中的應(yīng)用受到限制。關(guān)于氣單胞菌重組系統(tǒng)的研究及其構(gòu)建與應(yīng)用的文獻(xiàn)和專利仍較為稀缺，限制了該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)及其應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)，其含有同源重組系統(tǒng)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)一個(gè)操縱子，該操縱子包含編碼宿主特異性核酸外切酶redaahy、單鏈dna退火蛋白redbahy和單鏈dna結(jié)合蛋白redsahy的三個(gè)基因；所述操縱子來源于嗜水氣單胞菌(aeromonas?hydrophila)質(zhì)粒pr148。

4、第二方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，包括rk2復(fù)制起點(diǎn)、阿布拉霉素抗性基因阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和redabsahy；所述表達(dá)載體命名為rk2-arac-redabsahy-apra，其核苷酸序列如seq?id?no.19所示。

5、第三方面，本發(fā)明提供上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括：將redabsahy操縱子片段插入到質(zhì)粒載體中。

6、第四方面，本發(fā)明提供一種氣單胞菌屬中基因修飾的方法，采用上述新型重組系統(tǒng)進(jìn)行基因修飾。

7、第五方面，本發(fā)明提供上述氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)在氣單胞菌屬不同種中介導(dǎo)同源臂之間的同源重組進(jìn)行基因組dna修飾中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果主要體現(xiàn)在：

9、本發(fā)明提供了一種可以廣泛應(yīng)用于氣單胞菌的重組系統(tǒng)，尤其是針對雙殼氣單胞菌和維氏氣單胞菌。利用該重組系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了對氣單胞菌的高效、簡便的基因插入和刪除，其應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)特征：

1.一種氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)，其特征在于，其含有同源重組系統(tǒng)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)一個(gè)操縱子，該操縱子包含編碼宿主特異性核酸外切酶redaahy、單鏈dna退火蛋白redbahy和單鏈dna結(jié)合蛋白redsahy的三個(gè)基因；所述操縱子來源于嗜水氣單胞菌(aeromonas?hydrophila)質(zhì)粒pr148。

2.如權(quán)利要求1所述氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)，其特征在于，所述氣單胞菌為嗜水氣單胞菌、雙殼氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌和簡氏氣單胞中的一種或多種，優(yōu)選的，所述氣單胞菌為雙殼氣單胞菌和維氏氣單胞菌。

3.如權(quán)利要求1所述氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)，其特征在于，所述表達(dá)載體包括rk2復(fù)制起點(diǎn)、阿布拉霉素抗性基因和阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述表達(dá)載體命名為rk2-arac-redabsahy-apra，其核苷酸序列如seq?id?no.19所示。

4.一種表達(dá)載體，其特征在于，包括rk2復(fù)制起點(diǎn)、阿布拉霉素抗性基因阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和redabsahy；所述表達(dá)載體命名為rk2-arac-redabsahy-apra，其核苷酸序列如seqid?no.19所示。

5.權(quán)利要求4所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：將redabsahy操縱子片段插入到質(zhì)粒載體中。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述redabsahy操縱子片段來源于嗜水氣單胞菌質(zhì)粒pr148。

7.一種氣單胞菌屬中基因修飾的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述新型重組系統(tǒng)進(jìn)行基因修飾。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.權(quán)利要求1所述氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)在氣單胞菌屬不同種中介導(dǎo)同源臂之間的同源重組進(jìn)行基因組dna修飾中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述同源臂是指長度為500bp的同源臂。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所述氣單胞菌中新型重組系統(tǒng)含有同源重組系統(tǒng)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)一個(gè)操縱子，該操縱子包含編碼宿主特異性核酸外切酶RedA<subgt;ahy</subgt;、單鏈DNA退火蛋白RedB<subgt;ahy</subgt;和單鏈DNA結(jié)合蛋白RedS<subgt;ahy</subgt;的三個(gè)基因；所述操縱子來源于嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)質(zhì)粒pR148。利用該重組系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了對氣單胞菌的高效、簡便的基因插入和刪除，其應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)研發(fā)人員：劉昂,赫夢丹,許曉坤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15