本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程，具體涉及一種水凝膠微膠囊、水凝膠微囊化細(xì)胞及其制備方法和其在細(xì)胞藥物的冷凍保存上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞治療是指將正?；蛏锕こ谈脑爝^的人體細(xì)胞移植或輸入患者體內(nèi)，新輸入的細(xì)胞可以替代受損細(xì)胞，主要是干細(xì)胞療法，或者具有更強(qiáng)的免疫殺傷功能，從而達(dá)到治療疾病的目的免疫細(xì)胞療法。

2、盡管細(xì)胞療法的潛力巨大，但其仍然存在一些挑戰(zhàn)。主要問題之一是免疫排斥反應(yīng)，尤其是在使用來自供體的同種異體細(xì)胞療法中表現(xiàn)尤為明顯。雖然自體細(xì)胞療法可以在一定程度上規(guī)避免疫排斥問題，但由于供體細(xì)胞來源有限，自體細(xì)胞療法并不適用于所有患者或病癥。

3、為解決免疫排斥問題，微囊化技術(shù)被提出作為一種有效的策略。該技術(shù)通過將治療用細(xì)胞封裝在半透膜(通常為水凝膠)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)免疫隔離。這層半透膜既能進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的交換和代謝廢物的排出，又能阻止宿主免疫系統(tǒng)對(duì)封裝細(xì)胞的攻擊，從而顯著改善免疫排斥反應(yīng)，增強(qiáng)治療效果。因此，微囊化封裝細(xì)胞在細(xì)胞療法中成為一種極具吸引力的方法，尤其在同種異體移植中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

4、盡管微囊化技術(shù)在提高細(xì)胞免疫隔離方面展現(xiàn)出巨大潛力，但細(xì)胞療法的廣泛應(yīng)用卻受到冷凍保存技術(shù)的限制。為了滿足臨床需求，研究人員需要建立可靠的生物樣本庫，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長期儲(chǔ)存。目前，超低溫冷凍保存(約-150℃至-196℃)是生物樣本長期保存的最常用且有效的方法。然而，現(xiàn)有的冷凍保護(hù)劑和封裝材料在冷凍和解凍過程中仍存在不足，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

5、1、冰晶形成與機(jī)械損傷：在超低溫冷凍過程中，封裝在水凝膠中的細(xì)胞周圍容易形成冰晶。這些冰晶不僅可能穿透或損傷微膠囊結(jié)構(gòu)，還會(huì)在細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞間形成，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重?fù)p傷。冰晶的鋒利邊緣能夠刺穿細(xì)胞膜，破壞封裝材料的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞泄漏、活力喪失甚至細(xì)胞裂解，嚴(yán)重影響封裝細(xì)胞的治療效果。

6、2、滲透應(yīng)力引發(fā)的細(xì)胞脫水與損傷：冰晶形成過程中，水分從周圍溶液中被吸收，導(dǎo)致溶質(zhì)濃度升高，產(chǎn)生高滲環(huán)境。細(xì)胞為平衡內(nèi)外滲透壓，大量水分從胞內(nèi)滲出，導(dǎo)致細(xì)胞脫水。脫水不僅引起細(xì)胞器的萎縮和受損，還會(huì)在解凍時(shí)因水分迅速回流而導(dǎo)致細(xì)胞體積劇烈膨脹，甚至引發(fā)細(xì)胞膜破裂，進(jìn)一步降低細(xì)胞的存活率和功能。

7、3、水凝膠基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性受損：水凝膠作為高水含量的交聯(lián)三維聚合物網(wǎng)絡(luò)，在冷凍過程中其內(nèi)部水分結(jié)晶，可能導(dǎo)致水凝膠基質(zhì)出現(xiàn)裂縫、斷裂或形變。這不僅削弱了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和保護(hù)能力，還可能導(dǎo)致控釋特性的喪失，影響外界環(huán)境與封裝細(xì)胞之間的物質(zhì)交換。

8、針對(duì)上述問題，現(xiàn)有技術(shù)中有部分研究嘗試通過化學(xué)改性或復(fù)合材料來增強(qiáng)水凝膠的低溫性能，但普遍存在制備過程復(fù)雜、成本高昂以及效果有限等缺點(diǎn)。因此，亟需一種簡便、高效且成本可控的方法，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞療法中封裝細(xì)胞的長期穩(wěn)定保存和功能維護(hù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于細(xì)胞藥物長期冷凍保存的水凝膠、水凝膠微囊化細(xì)胞及其制備方法和其應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、一種水凝膠微膠囊，按重量份計(jì)，其原料包括18-22份海藻酸鈉(sa)、18-45份納米纖維素晶體(cncs)和200-240份氯化鈣。

4、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，納米纖維素晶體的長度為150-250nm，直徑為5-15nm，潔凈度為70-75％，熱降解溫度為200-300℃。

5、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，納米纖維素晶體cas編碼為none8013。

6、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述海藻酸鈉和納米纖維素晶體的質(zhì)量比為1:1-2。

7、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)所述水凝膠微膠囊的制備方法，包括以下步驟：

8、s1、將海藻酸鈉、納米纖維素晶體、溶劑混合均勻，得到水凝膠溶液；

9、s2、將水凝膠溶液注入微流控設(shè)備的電噴霧裝置中得到液滴；將液滴滴入氯化鈣溶液中交聯(lián)固化得到水凝膠微膠囊。

10、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，海藻酸鈉、納米纖維素晶體、溶劑在30-80℃下攪拌1-3h得到水凝膠溶液。

11、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述溶劑為pbs緩沖液、杜氏改良eagle培養(yǎng)基、rpmi-1640培養(yǎng)基、漢克的平衡鹽溶液(hbss)、無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、等滲葡萄糖溶液(例如，5％葡萄糖)、甘露醇溶液、含碳酸氫鹽的緩沖溶液中的任意一種或幾種。

12、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為0.5％-1.5％。海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度可以是0.5％-1.5％之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如1.0％。

13、濃度過高會(huì)導(dǎo)致水凝膠溶液過于粘稠，難以過濾，無法在微流控芯片中自由流動(dòng)；濃度過低會(huì)產(chǎn)生易碎的微膠囊。

14、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，納米纖維素晶體的質(zhì)量濃度為1％-2％。海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度可以是1％-2％之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如2％。

15、濃度過高會(huì)導(dǎo)致水凝膠溶液過于粘稠，難以過濾，無法在微流控芯片中自由流動(dòng)；濃度過低會(huì)產(chǎn)生易碎的微膠囊。

16、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，液滴從電噴霧裝置中噴射出的速度為7.5-8.5ml/h。流速可以是7.5-8.5ml/h之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如8.0ml/h。液滴從電噴霧裝置中噴射出的速度過大或過小，都會(huì)影響微膠囊的尺寸。

17、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，電噴霧裝置的電壓為13-14kv。電壓可以是13-14kv之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如13.5ml/h。合適范圍內(nèi)的電壓能夠確保水凝膠溶液從微流體芯片中連續(xù)、流暢地流動(dòng)。在其他電壓測量下未獲得所需的流量。

18、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.3m。使用此濃度范圍內(nèi)的氯化鈣是因?yàn)樵摑舛葘?duì)于封裝細(xì)胞來說是安全的(等滲的)并且足以進(jìn)行水凝膠交聯(lián)。

19、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)一種水凝膠微囊化細(xì)胞，是以所述水凝膠微膠囊包裹細(xì)胞得到。

20、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)所述水凝膠微囊化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

21、s1、將海藻酸鈉、納米纖維素晶體、溶劑混合均勻，得到水凝膠溶液；

22、s2、將細(xì)胞加入水凝膠溶液，得到混合溶液；

23、s3、將混合溶液注入微流控設(shè)備的電噴霧裝置中得到液滴；將液滴滴入氯化鈣溶液中交聯(lián)固化得到水凝膠微囊化細(xì)胞。

24、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，海藻酸鈉、納米纖維素晶體、溶劑在40-80℃下攪拌1-3h得到水凝膠溶液。

25、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述溶劑為pbs緩沖液、杜氏改良eagle培養(yǎng)基、rpmi-1640培養(yǎng)基、漢克的平衡鹽溶液(hbss)、無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、等滲葡萄糖溶液(例如，5％葡萄糖)、甘露醇溶液、含碳酸氫鹽的緩沖溶液中的任意一種或幾種。

26、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為0.5％-1.5％。海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度可以是0.5％-1.5％之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如1.0％。

27、濃度過高會(huì)導(dǎo)致水凝膠溶液過于粘稠，難以過濾，無法在微流控芯片中自由流動(dòng)；濃度過低會(huì)產(chǎn)生易碎的微膠囊。

28、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，納米纖維素晶體的質(zhì)量濃度為1％-2％。海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度可以是1％-2％之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如2％。

29、濃度過高會(huì)導(dǎo)致水凝膠溶液過于粘稠，難以過濾，無法在微流控芯片中自由流動(dòng)；濃度過低會(huì)產(chǎn)生易碎的微膠囊。

30、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述細(xì)胞為紅細(xì)胞。

31、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，紅細(xì)胞的濃度為100-120μl/ml混合溶液。該體積是溶血試驗(yàn)的最佳體積。

32、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述細(xì)胞為ins-1細(xì)胞。

33、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，ins-1細(xì)胞的濃度為(1-5)×106個(gè)/ml混合溶液。普通小鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素β細(xì)胞的數(shù)量在此范圍內(nèi)，因此，優(yōu)選此范圍。

34、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，液滴從電噴霧裝置中噴射出的速度為7.5-8.5ml/h。流速可以是7.5-8.5ml/h之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如8.0ml/h。液滴從電噴霧裝置中噴射出的速度過大或過小，都會(huì)影響微膠囊的尺寸。

35、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，電噴霧裝置的電壓為13-14kv。電壓可以是13-14kv之中的任意一個(gè)數(shù)值，例如13.5ml/h。合適范圍內(nèi)的電壓能夠確保水凝膠溶液從微流體芯片中連續(xù)、流暢地流動(dòng)。在其他電壓測量下未獲得所需的流量。

36、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.3m。使用此濃度范圍內(nèi)的氯化鈣是因?yàn)樵摑舛葘?duì)于封裝細(xì)胞來說是安全的(等滲的)并且足以進(jìn)行水凝膠交聯(lián)。

37、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，水凝膠微囊化細(xì)胞的粒徑為300-500μm。

38、較大的微膠囊在冷凍過程中容易損壞。粒徑過小，制備過程難以控制。合適粒徑的微膠囊更有利于均勻快速地釋放并減少損壞。

39、基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還要求保護(hù)所述水凝膠微囊化細(xì)胞在細(xì)胞藥物的冷凍保存上的應(yīng)用。

40、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述應(yīng)用過程中，混合溶液中還加入冷凍保護(hù)劑。

41、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述冷凍保護(hù)劑為海藻糖和二甲基亞砜中的一種或兩種。

42、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述冷凍保護(hù)劑為海藻糖(tre)和二甲基亞砜的混合。

43、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，海藻糖的質(zhì)量濃度為0.5-1.0m。

44、在紅細(xì)胞的保存實(shí)驗(yàn)中，海藻糖的質(zhì)量濃度為0.5-0.6m存活率較好；在ins-1細(xì)胞保存實(shí)驗(yàn)中，海藻糖的質(zhì)量濃度為0.6-0.8m存活率較好。過大或過小意味細(xì)胞存活率會(huì)降低。

45、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，混合溶液中，二甲基亞砜的質(zhì)量濃度為4-7％。

46、10％二甲基亞砜是細(xì)胞冷凍中使用的最佳濃度。但這種濃度會(huì)產(chǎn)生一些毒性作用。因此，本發(fā)明的目標(biāo)之一是降低二甲基亞砜的濃度以減少毒性作用。在冷凍ins-1細(xì)胞時(shí)，0.7m海藻糖與5％?dmso產(chǎn)生的冷凍保護(hù)結(jié)果與使用10％?dmso相同，但毒性小于10％dmso。

47、本發(fā)明旨在克服或至少緩解現(xiàn)有冷凍保存技術(shù)中的關(guān)鍵技術(shù)問題，例如細(xì)胞在超低溫環(huán)境下的冷凍損傷和免疫隔離不足。為此，本發(fā)明基于微流控技術(shù)，提供了一種用于細(xì)胞療法藥物長期冷凍保存并增強(qiáng)其免疫隔離效果的復(fù)合水凝膠微膠囊。該微膠囊能夠在超低溫條件下為細(xì)胞提供額外的機(jī)械保護(hù)，防止冰晶誘導(dǎo)的損傷。通過使用微流控技術(shù)制備微囊化細(xì)胞并進(jìn)行冷凍保存，本發(fā)明基于特定的聚合物組合以及使用均勻的、微米級(jí)微膠囊，顯著提高了冷凍保存后微囊化細(xì)胞的活力和功能，降低了冷凍損傷和冷凍保護(hù)劑所導(dǎo)致的毒性風(fēng)險(xiǎn)。

48、本發(fā)明在以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)了顯著的技術(shù)進(jìn)步：

49、1.增強(qiáng)的抗冷凍斷裂性能：cncs和sa之間的化學(xué)交聯(lián)顯著強(qiáng)化了水凝膠基質(zhì)的機(jī)械穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性，同時(shí)增加了彈性并改善了孔隙結(jié)構(gòu)。這些改進(jìn)為水凝膠微膠囊在凍融過程中提供了穩(wěn)定的機(jī)械性能，有效減少了由冰晶形成引起的結(jié)構(gòu)破壞風(fēng)險(xiǎn)。

50、2.減少有毒冷凍保護(hù)劑的使用：采用無毒冷凍保護(hù)劑海藻糖替代或部分替代傳統(tǒng)有毒冷凍保護(hù)劑(如二甲基亞砜dmso)，在微囊化細(xì)胞封裝后實(shí)現(xiàn)高效的低溫保護(hù)。此舉不僅提高了體系的生物相容性，也有效降低了對(duì)細(xì)胞的潛在毒性影響。

51、3.改善解凍后細(xì)胞活性和正常功能：通過抵御凍融過程中的機(jī)械應(yīng)力和冰晶損傷，抗冷凍斷裂水凝膠微膠囊有效提升了細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率，并維持其正常功能(如分泌活性)，使得該方法非常適合于細(xì)胞療法冷凍保存應(yīng)用。

52、4.微流控技術(shù)的精確性和均勻性：借助微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)水凝膠微膠囊制備流程的精準(zhǔn)控制，確保微膠囊在尺寸、形狀以及功能上的高度一致性。如此優(yōu)化不僅提高了細(xì)胞與外界環(huán)境間的物質(zhì)交換效率，也使規(guī)?；a(chǎn)具備更高的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。

53、本發(fā)明基于微流控技術(shù)，通過精確控制微膠囊的尺寸和組分分布，顯著提高了其在冷凍和解凍過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗斷裂能力，解決了現(xiàn)有技術(shù)中微膠囊在低溫條件下易損壞的問題，從而有效保障封裝細(xì)胞的活力和生物學(xué)功能，推動(dòng)細(xì)胞療法及相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。