專利名稱：從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取方法，尤其是一種從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)莓為杜鵑花科(Bricaeae)越橘屬{Vacciniimi L.)植物，又名藍(lán)漿果、藍(lán)靛果、越橘，為多年生落葉/常綠木質(zhì)灌木，原產(chǎn)地為加拿大東部和美國東北部。藍(lán)莓葉富含花色苷、綠原酸、異槲皮素、槲皮素等生理活性物質(zhì)和很強(qiáng)的抗氧化能力。花青素是一種類黃酮化合物，主要為C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，包括天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、錦葵花色素、矮牽牛色素等，主要分布在植物的花、果皮、葉、根、莖中?；ㄇ嗨亟Y(jié)合糖苷后構(gòu)成花色苷?；ㄇ嗨靥崛∥锞哂休^高的抗氧化能力，可以用于食品 天然色素，保健品、化妝品等?；ㄇ嗨氐难芯恐饕ɑㄇ嗨氐亩ㄐ远俊⑻崛》蛛x、純化利用等方面。常見的提取方法主要包括溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、高壓超高壓輔助提取、超臨界輔助提取等?；ㄇ嗨氐募兓绞桨垖游觥⒅鶎游?、薄層層析、高效液相分離、膜分離、固相萃取、結(jié)晶法等。我國擁有豐富的花青素資源。如何充分有效的加以利用，顯得極其重要。與藍(lán)莓果實(shí)相比較，花青素作為藍(lán)莓紅葉中的特征性物質(zhì)成分，受到的關(guān)注較少。馮松元等(中國專利授權(quán)號(hào)100574625)提出了藍(lán)莓葉茶飲料的制備方法，該方法僅對(duì)處理后的藍(lán)莓葉浸提、過濾后的汁液進(jìn)行滅菌、灌裝。此發(fā)明沒有對(duì)藍(lán)莓葉中的花青素進(jìn)行提取、純化和物質(zhì)鑒定。此外一些文獻(xiàn)報(bào)道了藍(lán)莓葉黃酮類物質(zhì)的提取分離方法等，尚未單獨(dú)研究藍(lán)莓紅葉中的特征性物質(zhì)成分花青素的提取純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，它成本低廉，易于產(chǎn)業(yè)化，提取效率高，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的從藍(lán)莓葉中提取純化花青素的方法，選取新鮮的藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，經(jīng)過真空干燥、粉碎過篩、提取、樹脂純化分離、減壓濃縮、冷凍干燥、飽和溶解、低溫養(yǎng)晶及重結(jié)晶工藝后，獲得花青素結(jié)晶。所述的真空干燥是，將藍(lán)莓紅葉在O. 05 O. 2個(gè)大氣壓、60°C的條件下干燥12 24小時(shí)。所述的粉碎過篩是，將干燥的藍(lán)莓紅葉粉碎后過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉，并將獲得的藍(lán)莓紅葉粗粉進(jìn)行密封干燥儲(chǔ)藏，備用。所述的提取是，向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為50 90%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:20 1:50，并在室溫下采用150 400W超聲波功率進(jìn)行2 5次輔助提取，每次提取時(shí)間10 lOOmin。所述的樹脂純化分離是，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，進(jìn)行色素純化，在樹脂純化時(shí)先用純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用質(zhì)量百分比濃度為50 80%乙醇水溶液洗脫下花青素，獲得花青素洗脫液。所述的減壓濃縮是，將花青素洗脫液，在O. 05 O. 2個(gè)大氣壓、30 40°C的條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物溶解于50 100倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品。(為什么經(jīng)過減壓濃縮后，有兩種不同的步驟？ 一種是加純水獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液，另一種是濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品)
所述的飽和溶解及低溫養(yǎng)晶是，將獲得的花青素粗品在20 30°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為45 65%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2 4°C的冰箱冷藏12 24小
時(shí)，靜置養(yǎng)晶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用超聲波輔助提取法，選取乙醇作為有機(jī)溶劑提取，并通過大孔樹脂分離純化、結(jié)晶和重結(jié)晶處理來實(shí)現(xiàn)從藍(lán)莓紅葉中提取花青素，經(jīng)過重結(jié)晶 后可使花青素的純度能達(dá)到95%以上。本發(fā)明不僅工藝簡(jiǎn)單，而且分離純化效率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)，并且得到的花青素純度高，生產(chǎn)成本低。通過液相質(zhì)譜輔助定性等技術(shù)得知，所獲得的花青素種類較藍(lán)莓果實(shí)中提取得到的色素種類簡(jiǎn)單。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，容易實(shí)施，使用效果好。


圖I為藍(lán)莓葉花青素成分的HPLC-MS/MS正離子流 圖2為藍(lán)莓葉花青素成分的HPLC 圖3為矢車菊素-3-0-半乳糖苷的質(zhì)譜 圖4為矢車菊素-3-0-阿拉伯糖苷的質(zhì)譜 圖5為矢車菊素-3-0-葡萄糖苷質(zhì)譜 圖6為飛燕草素-3-0-半乳糖苷質(zhì)譜 圖7為飛燕草素-3-0-阿拉伯糖苷質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例I :從杰兔藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，(I)選取新鮮的杰兔藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，在O. I個(gè)大氣壓下60°C干燥16小時(shí)，將干燥后的藍(lán)莓紅葉粉碎至過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉，并將獲得的藍(lán)莓紅葉粗粉進(jìn)行密封干燥儲(chǔ)藏，備用；向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:20，并在室溫下采用300W超聲波功率進(jìn)行2次輔助提取，每次提取時(shí)間40min，將獲得的提取溶液經(jīng)過濾除渣后，在O. I個(gè)大氣壓下35°C條件下減壓濃縮至不含乙醇,再溶解于60倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；將藍(lán)莓紅葉花青素水溶液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，吸附飽和后，先以純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用70%乙醇水溶液洗脫下花青素；花青素洗脫液在O. I個(gè)大氣壓下35°C的條件下條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品；將藍(lán)莓紅葉花青素粗品在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為55%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏14小時(shí)，靜置養(yǎng)晶，析出的結(jié)晶體即為花青素結(jié)晶；將析出的結(jié)晶通過重結(jié)晶(在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為50%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏12小時(shí)，靜置養(yǎng)晶)，析出的花青素結(jié)晶體經(jīng)過液相檢測(cè)后純度可達(dá)96. 2%ο本發(fā)明的實(shí)施例2 :從園藍(lán)藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，選取新鮮的園藍(lán)藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，在O. I個(gè)大氣壓下60°C干燥24小時(shí)，將干燥后的藍(lán)莓紅葉粉碎至過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉；向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:20，并在室溫下采用250W超聲波功率進(jìn)行3次輔助提取，每次提取時(shí)間70min，將獲得的提取溶液經(jīng)過濾除渣后，在O. I個(gè)大氣壓下38°C條件下減壓濃縮至不含乙醇，再溶解于60倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；將藍(lán)莓紅葉花青素水溶液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，吸附飽和后，先以純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用75%乙醇水溶液洗脫下花青素；花青素洗脫液在O. I個(gè)大氣壓下38°C的條件下條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品；將藍(lán)莓紅葉花青素粗品在22°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為58%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏20小時(shí)，靜置養(yǎng)晶，析出的結(jié)晶體即為花青素結(jié)晶；將析出的結(jié)晶通過重結(jié)晶(在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為52%的 乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏14小時(shí)，靜置養(yǎng)晶)，析出的花青素結(jié)晶體經(jīng)過液相檢測(cè)后純度可達(dá)95. 5%。本發(fā)明的實(shí)施例3 :從巴爾德溫藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，選取新鮮的巴爾德溫藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，在O. 08個(gè)大氣壓下60°C干燥20小時(shí)，將干燥后的藍(lán)莓紅葉粉碎至過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉；向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:30，并在室溫下采用250W超聲波功率進(jìn)行3次輔助提取，每次提取時(shí)間40min，將獲得的提取溶液經(jīng)過濾除渣后，在O. 08個(gè)大氣壓下40°C條件下減壓濃縮至不含乙醇，再溶解于80倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；將藍(lán)莓紅葉花青素水溶液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，吸附飽和后，先以純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用80%乙醇水溶液洗脫下花青素；花青素洗脫液在O. 08個(gè)大氣壓下40°C的條件下條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品；將藍(lán)莓紅葉花青素粗品在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為60%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏20小時(shí)，靜置養(yǎng)晶，析出的結(jié)晶體即為花青素結(jié)晶；將析出的結(jié)晶通過重結(jié)晶(在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為50%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于4°C的冰箱冷藏15小時(shí)，靜置養(yǎng)晶)，析出的花青素結(jié)晶體經(jīng)過液相檢測(cè)后純度可達(dá)96. 8%。本發(fā)明的實(shí)施例4 :從粉藍(lán)藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，選取新鮮的粉藍(lán)藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，在O. I個(gè)大氣壓下60°C干燥14小時(shí)，將干燥后的藍(lán)莓紅葉粉碎至過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉；向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:30，并在室溫下采用300W超聲波功率進(jìn)行3次輔助提取，每次提取時(shí)間50min，將獲得的提取溶液經(jīng)過濾除渣后，在O. I個(gè)大氣壓下35°C條件下減壓濃縮至不含乙醇，再溶解于80倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；將藍(lán)莓紅葉花青素水溶液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，吸附飽和后，先以純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用80%乙醇水溶液洗脫下花青素；花青素洗脫液在O. I個(gè)大氣壓下35°C的條件下條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品；將藍(lán)莓紅葉花青素粗品在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為55%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏18小時(shí)，靜置養(yǎng)晶，析出的結(jié)晶體即為花青素結(jié)晶；將析出的結(jié)晶通過重結(jié)晶(在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為50%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏16小時(shí)，靜置養(yǎng)晶)，析出的花青素結(jié)晶體經(jīng)過液相檢測(cè)后純度可達(dá)95. 3%。本發(fā)明的實(shí)施例5 :從夏普蘭藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，選取新鮮的夏普蘭藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，在O. 05個(gè)大氣壓下60°C干燥15小時(shí)，將干燥后的藍(lán)莓紅葉粉碎至過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉；向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:40，并在室溫下采用250W超聲波功率進(jìn)行2次輔助提取，每次提取時(shí)間40min，將獲得的提取溶液經(jīng)過濾除渣后，在O. I個(gè)大氣壓下39 V條件下減壓濃縮至不含乙醇，再溶解于60倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；將藍(lán)莓紅葉花青素水溶液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，吸附飽和后，先以純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用80%乙醇水溶液洗脫下 花青素；花青素洗脫液在O. I個(gè)大氣壓下39°C的條件下條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品；將藍(lán)莓紅葉花青素粗品在22°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為57%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏15小時(shí)，靜置養(yǎng)晶，析出的結(jié)晶體即為花青素結(jié)晶；將析出的結(jié)晶通過重結(jié)晶(在25°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為50%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于3°C的冰箱冷藏14小時(shí)，靜置養(yǎng)晶)，析出的花青素結(jié)晶體經(jīng)過液相檢測(cè)后純度可達(dá)95. 9%。為了驗(yàn)證本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果，將實(shí)施例I至例5獲得的產(chǎn)品用液相質(zhì)譜輔助定性，檢測(cè)其花青素組成
HPLC檢測(cè)條件
Waters 600高效液相色譜儀、Waters 2489紫外檢測(cè)器用于測(cè)定花色苷含量。Waters Empower軟件分析數(shù)據(jù)。HPLC檢測(cè)條件Waters Xselect-CSH色譜柱(250X4. 6mm, America),檢測(cè)波長為520nm，柱溫25°C，以峰面積外標(biāo)法定量。流動(dòng)相A為甲酸+水(10:90), B為乙腈；流速為I ml/min。進(jìn)樣量10μ1。標(biāo)準(zhǔn)品選用矢車菊素-3-0-匍萄糖苷。HPLC-MS/MS質(zhì)譜輔助定性檢測(cè)條件
Agilent 1290 HPLC(Agilent Technologies)連接 Q-TOF Ultima Agilent 1290 離子肼質(zhì)譜。LC-MS檢測(cè)流動(dòng)相條件同HPLC檢測(cè)條件，但是流速O. 6ml/min。質(zhì)譜條件正、負(fù)離子電噴霧離子化，噴霧電壓3300V，檢測(cè)波長520 nm.，霧化壓力40 psi，干燥N氣流流速10 ml/min，加熱毛細(xì)管溫度300°C，質(zhì)合比100-1000范圍每秒全掃描一次，分析軟件Bruker software。圖譜鑒定根據(jù)保留時(shí)間先后順序,最大吸收波長，M/Z值,碎片M/Z值結(jié)合參考文獻(xiàn)確定。檢測(cè)的圖譜如圖I至圖6所示，其花青素的組成見表I。表I :藍(lán)莓紅葉花青素組成
權(quán)利要求
1.一種從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于選取新鮮的藍(lán)莓紅葉，并去除病蟲爛葉，用清水清洗后，經(jīng)過真空干燥、粉碎過篩、提取、樹脂純化分離、減壓濃縮、冷凍干燥、飽和溶解、低溫養(yǎng)晶及重結(jié)晶工藝后，獲得花青素結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的真空干燥是，將藍(lán)莓紅葉在O. 05 O. 2個(gè)大氣壓、60°C的條件下干燥12 24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的粉碎過篩是，將干燥的藍(lán)莓紅葉粉碎后過60目篩，獲得藍(lán)莓紅葉粗粉，并將獲得的藍(lán)莓紅葉粗粉進(jìn)行密封干燥儲(chǔ)藏，備用。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的提取是，向藍(lán)莓紅葉粗粉中加入質(zhì)量百分比濃度為50 90%的乙醇水溶液，乙醇水溶液與藍(lán)莓紅葉粗粉的液料比1:20 1:50，并在室溫下采用150 400W超聲波功率進(jìn)行2 5次輔助提取，每次提取時(shí)間10 lOOmin。
5.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的樹脂純化分離是，選擇AB-8型號(hào)大孔樹脂，進(jìn)行色素純化，在樹脂純化時(shí)先用純水洗脫糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用質(zhì)量百分比濃度為50 80%乙醇水溶液洗脫下花青素，獲得花青素洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的減壓濃縮是，將花青素洗脫液，在O. 05 O. 2個(gè)大氣壓、30 40°C的條件下減壓濃縮至不含乙醇，再將濃縮物溶解于50 100倍的純水中，獲得藍(lán)莓紅葉花青素水溶液；再將濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得到花青素粗品。
7.根據(jù)權(quán)利I所述的從藍(lán)莓紅葉中提取純化花青素的方法，其特征在于所述的飽和溶解及低溫養(yǎng)晶是，將獲得的花青素粗品在20 30°C的條件下用質(zhì)量百分比濃度為45 65%的乙醇水溶液配置飽和溶液后，置于2 4°C的冰箱冷藏12 24小時(shí)，靜置養(yǎng)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從藍(lán)莓紅葉中提取花青素的方法，特點(diǎn)是藍(lán)莓紅葉花青素提取物中一般含有2種含量接近的花青素，占提取物中花青素含量93.9-99.0%；以新鮮的藍(lán)莓紅葉為原料，去除病蟲爛葉，用清水清洗后，經(jīng)過真空干燥、粉碎過篩、提取、減壓濃縮、大孔樹脂純化分離、減壓濃縮、冷凍干燥、飽和溶解、低溫養(yǎng)晶、重結(jié)晶等工藝制得天然藍(lán)莓紅葉色素產(chǎn)品?；ㄇ嗨亟?jīng)重結(jié)晶后得到的花青素純度達(dá)到95%以上。本發(fā)明制備的花青素純度較高，花青素組成較簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，具有較大推廣性。
文檔編號(hào)C09B61/00GK102875514SQ20121036102
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者嚴(yán)紅光, 張文華 申請(qǐng)人:凱里學(xué)院