專利名稱：一種脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物igf-1抗體及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物IGF-I抗體及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常的脂肪代謝是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要生理過(guò)程，其機(jī)制是復(fù)雜多向的機(jī)體整體變化，涉及到眾多蛋白、細(xì)胞因子的上調(diào)或下調(diào)，而異常的脂肪代謝將導(dǎo)致肝臟損傷、高血壓、內(nèi)分泌失調(diào)、肥胖等疾病的發(fā)生，這些疾病的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程，與個(gè)體的生活及飲食等習(xí)慣密不可分。目前中國(guó)的醫(yī)療水平和診斷技術(shù)還僅局限于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)單一疾病的診斷，而脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物芯片的研制可將相關(guān)疾病進(jìn)行橫向比對(duì)，控 制其并發(fā)癥的發(fā)生，更加有效地指導(dǎo)臨床用藥，提高了診療水平，縮短了與國(guó)際同行之間的差距。隨著中國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，以上疾病的發(fā)病率會(huì)逐年增多，此芯片的研制將在正常體檢、疾病的預(yù)防和控制方面做出積極和重大的貢獻(xiàn)。本發(fā)明包括IGF-I在內(nèi)的45種單克隆抗體與脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)的結(jié)合具有高度特異性，涵蓋脂肪因子、疾病相關(guān)因子及細(xì)胞分化標(biāo)志因子等。所制成的抗體芯片實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、肥胖等疾病高通量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，自主研發(fā)脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體芯片檢測(cè)試劑盒(抗體芯片)完全是由中國(guó)人自主開(kāi)發(fā)，應(yīng)用這一芯片，可通過(guò)多種方式、多種渠道、多層面檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的效價(jià)和含量，將檢測(cè)靈敏度由Ug提高到ng級(jí)，從而達(dá)到更準(zhǔn)確、更全面的效果，其檢測(cè)結(jié)果即可定性也可定量。脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體芯片檢測(cè)試劑盒(抗體芯片)對(duì)促進(jìn)我國(guó)生物高技術(shù)前沿領(lǐng)域的發(fā)展具有重大鼓舞作用，對(duì)提升我國(guó)生物芯片技術(shù)、產(chǎn)品和市場(chǎng)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有重大意義，此方法完全符合分子免疫學(xué)原理。目前國(guó)外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了生物芯片技術(shù)來(lái)尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用及進(jìn)行藥物產(chǎn)品的定量和定性。用芯片技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選可以省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)，縮短藥物篩選所用時(shí)間，從而帶動(dòng)創(chuàng)新藥物的研究和開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物IGF-I的單克隆抗體及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是利用細(xì)胞融合、亞克隆及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行特異性篩選技術(shù)，獲得高效價(jià)、高特異性抗人脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物單克隆抗體，由于此單抗效價(jià)高、特異性好，可直接應(yīng)用于芯片的點(diǎn)樣，結(jié)合CY3標(biāo)記的補(bǔ)體C3抗體與被檢產(chǎn)品建立了完整的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)檢測(cè)45種脂肪分化代謝蛋白質(zhì)含量的方法.此抗體芯片具有靈敏度高，特異性好、操作簡(jiǎn)單、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床和體檢血清的監(jiān)測(cè)和質(zhì)控。本發(fā)明提供的IGF-I單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有與脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物IGF-I特異性結(jié)合的特性。作為優(yōu)選，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無(wú)論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實(shí)例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以 是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單價(jià)的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽?？贵w可以通過(guò)許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生保留原來(lái)抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見(jiàn)，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。還可以對(duì)雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā)明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因?yàn)榫幋a本發(fā)明人源化抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。如上所述，本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明抗體的試劑、試劑盒或芯片。試劑、試劑盒或芯片至少包括如下一種或多種根據(jù)以上方法制成的抗體，編碼該抗體的核苷酸，或包含該抗體的真核細(xì)胞、原核細(xì)胞和病毒以及任選的緩沖溶液。本發(fā)明所述芯片上還包含特異性結(jié)合以下脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的抗體TNF- a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4>GLUT-4> LPL>PGAR、UCPs, PPAR- y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY、MC-4R、POMC, a -MSH、AgRP、orexin、GH、IGF-I、Acrp30、VEGF、HBEGF,HGF,Ang II、ACE、AGT、FA transporter, eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP, PEPCK, A2-腎上腺素能受體。本發(fā)明還提供包含所述抗體芯片的試劑盒，其特征在于，還包含信標(biāo)分子標(biāo)記的C3補(bǔ)體抗體，所述信標(biāo)分子優(yōu)選為CY3。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明公開(kāi)了脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體芯片的制備方法，它包括如下工藝步驟(I)動(dòng)物免疫將自主設(shè)計(jì)合成的IGF-I多肽(HPLC檢測(cè)純度大于90%，序列PTGYGSSSRRAPQTG)lml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度脂肪細(xì)胞分化代謝蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其抗血清；(2)分離脾細(xì)胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞懸液按I :10比例混合，30秒內(nèi)逐漸加入45%PEG (分子量4000)，靜止90秒，使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(4)篩選雜交瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第七天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞 克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株再擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存；(5)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，I. 44 (吸光單位)濃度為lmg/ml。 (6)將C3補(bǔ)體抗體進(jìn)行CY3標(biāo)記(7)脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物芯片微陣列點(diǎn)樣(每張芯片包括4-8個(gè)陣列，I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，3-7個(gè)檢測(cè))標(biāo)準(zhǔn)陣列檢測(cè)范圍O. 01 100ng/ml，檢測(cè)陣列45種抗體(每種抗體2個(gè)點(diǎn))。本發(fā)明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數(shù)是步驟(I)將自主設(shè)計(jì)合成的IGF-I多肽(HPLC檢測(cè)純度大于90%) Iml加等量的完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8 12周，每只腹腔注射O. 2ml,間隔2周注射一次；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定抗血清。步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后15小時(shí)的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為9X 105/ml細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞。步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml，以HAT選擇培養(yǎng)基按36%的孔為I個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。步驟(4)中是將細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0% 20%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。步驟(5)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5X IO5雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，吸光單位=1. 44時(shí)濃度為lmg/ml。步驟(6)中選用的是CY3對(duì)補(bǔ)體C3抗體的標(biāo)記
步驟(7)中選用脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物芯片微陣列點(diǎn)樣(每張芯片包括4-8個(gè)陣列，I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，3-7個(gè)檢測(cè))標(biāo)準(zhǔn)陣列檢測(cè)范圍O. 01 100ng/ml，檢測(cè)陣列45種抗體(每種抗體2個(gè)點(diǎn))。本發(fā)明所取得的進(jìn)步在于所獲得的抗人IGF-I單克隆抗體經(jīng)AKTA蛋白純化儀FPLC純化，其效價(jià)高、特異性非常好，與另44種與脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物相關(guān)的單克隆抗體經(jīng)有限稀釋點(diǎn)于芯片上，與標(biāo)記的補(bǔ)體C3抗體和檢測(cè)樣本進(jìn)行雜交，借助目前先進(jìn)的芯片檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)。此技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，具有快速、操作便捷、高通量檢測(cè)的特點(diǎn)；并可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。本發(fā)明將自主設(shè)計(jì)合成的IGF-I多肽經(jīng)免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)、以及大量的組織細(xì)胞原位特異性篩選從而獲得高效價(jià)、高特異性的抗人IGF-I單克隆抗體，此抗體與44種與脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物相關(guān)的單克隆抗體制成的抗體芯片可直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究。單克隆抗體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用價(jià)值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗(yàn)中的新型試劑，是生物治療的導(dǎo)向武器。作為脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的檢測(cè)試劑，抗人脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物單克隆抗體可 以充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，可將抗原抗體反應(yīng)的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應(yīng)，使試驗(yàn)結(jié)果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物IGF-I抗體及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在進(jìn)一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的實(shí)施方案，也就是說(shuō)，在具體形式上可能存在著變化。還有一點(diǎn)需要提醒的是，由于本發(fā)明的范圍受附加的權(quán)利要求書(shū)的限制，因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術(shù)語(yǔ)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語(yǔ)，具體是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)?？贵w的一種形式構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對(duì)完全相同的抗體鏈構(gòu)成，每一對(duì)都有一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈。在每對(duì)抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共同負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，而恒定區(qū)則負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，以及a，Y(IgG1, IgG2, IgG3,IgG4), δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價(jià)物。全長(zhǎng)的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個(gè)氨基酸)包含一個(gè)由NH2-末端上大約110個(gè)氨基酸形成的可變區(qū)，以及一個(gè)COOH-末端上的K或λ恒定區(qū)。全長(zhǎng)的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個(gè)氨基酸)，同樣包含一個(gè)可變區(qū)(大約116個(gè)氨基酸)，以及重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (大約330個(gè)氨基酸)。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)?？贵w可以被標(biāo)記和檢測(cè)，例如，可以通過(guò)放射性同位素、能產(chǎn)生可檢測(cè)物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進(jìn)行標(biāo)記并被檢測(cè)?？贵w還可以結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術(shù)語(yǔ)還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能與抗原特異性結(jié)合的抗體片段和單克隆抗體?？贵w還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及雙功能雜合抗體(例如文獻(xiàn)，Lanzavecchia 等，Eur. J. Immunol. , 1987 ；17,105)以及以單鏈形式(例如，Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等，Science, 1988 ;242，423，在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區(qū)由三個(gè)超變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或⑶R)組成，這些超變區(qū)被框架區(qū)(FR)間隔。框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的范圍已被精石角定義(參見(jiàn)〃Sequences of Proteins of Immunological Interest, 〃E. Kabat 等， U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸序列的排序都參照Kabat系統(tǒng)。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區(qū)序列相對(duì)保守。抗體的框架區(qū)用于定位和校準(zhǔn)CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。嵌合抗體是其重鏈和輕鏈基因經(jīng)過(guò)構(gòu)建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)片段連接到人抗體恒定區(qū)片段如Y I和Y3。例如治療用嵌合抗體是一種嵌合蛋白質(zhì)，它由來(lái)源于兔抗體可變區(qū)片段或抗原結(jié)合區(qū)片段和人抗體恒定區(qū)或效應(yīng)區(qū)結(jié)合(如由A. T. C. C.保藏登記號(hào)CRL 9688的細(xì)胞制備的抗Tac嵌合抗體)，當(dāng)然，嵌合抗體的基因來(lái)源也可以使用其它哺乳動(dòng)物物種?？梢岳斫獗景l(fā)明設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的人源化抗體可能會(huì)替代某些保守性氨基酸，這些氨基酸對(duì)抗原結(jié)合或抗體其他功能基本上沒(méi)有影響。換而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各組合內(nèi)部的氨基酸可相互取代?？贵w重鏈或輕鏈的“可變區(qū)”是該鏈的N端成熟區(qū)域。所有區(qū)域、CDR和殘基編號(hào)均以序列比對(duì)、按已有的結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)進(jìn)行定義。框架區(qū)和CDR殘基的鑒定和編號(hào)按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗體重鏈的可變區(qū)。VL是抗體輕鏈的可變區(qū)，它可能具有K和λ同種型。K-I抗體具有K -I同種型而Κ-2抗體具有K -2同種型，V λ是可變的λ輕鏈。“相應(yīng)的氨基酸”，是指當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列比對(duì)時(shí)，位于相同位置(也就是它們彼此對(duì)應(yīng))的氨基酸殘基?？贵w序列比對(duì)和編號(hào)的方法在Chothia，見(jiàn)上，Kabat，見(jiàn)上和其他中得到詳盡闡述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(參見(jiàn)如Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時(shí)可以在抗體的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸中制造一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)缺口和/或插入1、2、3或4個(gè)殘基或者至多約15個(gè)殘基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對(duì)?！翱扇〈恢谩保傅氖强贵w的一個(gè)特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會(huì)使抗體的結(jié)合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進(jìn)行更加詳細(xì)的描述?？扇〈恢靡部梢苑Q為“變異耐受位置”。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I :本發(fā)明所述脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體的制備脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體的制備方法，包括如下工藝步驟(I)動(dòng)物免疫將自主設(shè)計(jì)合成IGF-I多肽(PTGYG SSSRRAPQTG)lml充分乳化，分別免疫與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其抗 血清；(2)分離脾細(xì)胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞懸液按I :10比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(4)篩選雜交瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第七天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測(cè)定，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株再擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)大于I :10000的陽(yáng)性孔的上清，與多種其它基因工程藥物進(jìn)行特異性篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，I. 44 (吸光單位)濃度為 lmg/mlο步驟(I)將自主設(shè)計(jì)合成IGF-I多肽Iml加等量的完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在9周，每只腹腔注射O. 2ml,間隔2周注射一次；測(cè)定抗血清。步驟(2)進(jìn)行完畢后采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸鹽緩沖液將步驟(I)中的自主設(shè)計(jì)合成IGF-1多肽包被96孔聚乙烯板，4微克/孔，真空抽干，密封4°C保存?zhèn)溆?。b、封閉每孔加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液200 μ I洗滌、內(nèi)含1%山羊血清；C、加樣每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50 μ I (1:5000稀釋),每板設(shè)一正常對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標(biāo)二抗每孔100 μ 1，洗滌；e、顯色
每孔加入底物100 μ I ;f、比色以空白調(diào)零，405nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(0.D)；g、結(jié)果判斷P/N=測(cè)定標(biāo)本O. D均值/陰性血清O. D均值，P/N彡2. I為陽(yáng)性。步驟a中的聚乙烯板規(guī)格為200 μ I/孔、真空抽干溫度為4°C，洗滌采用O. 05%的Tween-20磷酸鹽緩沖液洗漆3次。步驟b中的工藝參數(shù)為每孔加入pH=7. 4、含1%山羊血清磷酸鹽緩沖液200 μ 1，溫度為37°C、時(shí)間I小時(shí)，洗滌3次。步驟c中的工藝條件為每孔加入1:5000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周 血清50 μ 1，每板設(shè)一正常對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37°C、時(shí)間為I小 時(shí)，洗滌3次。步驟d中的工藝條件加入酶標(biāo)二抗每孔100 μ 1，溫度為37°C、時(shí)間為I小時(shí)，洗滌3次。步驟e中的工藝條件為室溫、時(shí)間為10分鐘，然后使用終止液終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處讀取光密度值。步驟(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后15小時(shí)的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為9X 105/ml細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞。步驟(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml，以HAT選擇培養(yǎng)基按36%的孔為I個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。步驟(5)中是將細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋10%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，與多批次脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物經(jīng)ELISA篩選呈陽(yáng)性表達(dá)。然后確定高分泌、高特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。步驟(6)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5X IO5雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，吸光單位=1. 44時(shí)濃度為lmg/ml。實(shí)施例2 :抗體芯片的制備方法在實(shí)施例I基礎(chǔ)上增加如下工藝步驟步驟(7)中選用的CY3標(biāo)記補(bǔ)體C3抗體。步驟(8)中選用的脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物芯片微陣列點(diǎn)樣(每張芯片包括4-8個(gè)陣列，I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，3-7個(gè)檢測(cè))標(biāo)準(zhǔn)陣列檢測(cè)范圍O. 01 100ng/ml，檢測(cè)陣列45種抗體(每種抗體2個(gè)點(diǎn))。實(shí)施例3 :本發(fā)明所述單抗各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)將實(shí)施例I篩選的IGF-I雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗進(jìn)行序列分析，其重鏈可變區(qū)如下EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYIMffffVRQA PGKGLEffVSV ISSSGGMTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDN ⑶YVGEKGFD IffGQGTMVTV SSAA (如 SEQID No. I 所示)其輕鏈可變區(qū)如下QDIQMTQSPS SLSASV⑶RV TITCRASQSI SNYLNffYQQK PGKAPKLLIY TASTLQSGVPSRFSGSASGT DFTLTINSLQ PEDFATYSCQ QSYNSPffTFG QGTKVEIKRTS (如 SEQ ID No. 2 所示)實(shí)施例4 :指標(biāo)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例I制備的IGF-I單克隆抗體的各項(xiàng)指標(biāo)如下I、陽(yáng)性克隆孔腹水酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)效價(jià)大于I :560002、該芯片所包含的45種脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物相關(guān)抗體如下 脂肪因子(adipokines):TNF_ a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4, LPL, PGAR、UCPs, PPAR- y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY與疾病相關(guān)的因子MC-4R、P0MC、a-MSH、AgRP、orexin、GH、IGF_l、Acrp30、VEGF、HBEGF,HGF,Ang II、ACE、AGT、FA transporter, eNOS、iNOS各分化階段標(biāo)志因子ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase>AP2、apoE、perilipin、ACBP>PEPCK> A2-adrenoreceptor 此脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物抗體芯片經(jīng)30批次的脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物產(chǎn)品的特異性篩選表達(dá)均為陽(yáng)性，與11種18批次的其它脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物進(jìn)行特異性篩選陽(yáng)性表達(dá)為O。表明此芯片特異性很高，適合提供給醫(yī)療及科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的鑒定和質(zhì)控評(píng)價(jià)，此抗體還可制成免疫組化或酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒開(kāi)展醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.IGF-I的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合IGF-I的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
3.權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體在制備糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、月巴胖的檢測(cè)試劑中的用途。
4.一種試劑，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
5.一種試劑盒，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
6.一種抗體芯片，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體芯片，其特征在于，還包含特異性結(jié)合以下脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的抗體TNF- a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4、LPL、PGAR、UCPs、PPAR-Y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY、MC-4R、POMC、a-MSH、AgRP, orexin、GH、IGF-U Acrp30、VEGF, HBEGF, HGF, Ang II、ACE、AGT, FA transporter、eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP、PEPCK、A2-腎上腺素能受體。
8.包含權(quán)利要求6或7所述抗體芯片的試劑盒，其特征在于，還包含信標(biāo)分子標(biāo)記的C3補(bǔ)體抗體，所述信標(biāo)分子優(yōu)選為CY3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種脂肪細(xì)胞分化代謝產(chǎn)物的IGF-1單克隆抗體及包含該抗體的芯片。本發(fā)明所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明所述單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。包含此抗體的芯片可直接應(yīng)用于醫(yī)療及科研機(jī)構(gòu)對(duì)心腦血管疾病、動(dòng)脈硬化等疾病進(jìn)行檢測(cè)和預(yù)防的研究，在臨床診斷領(lǐng)域中具有極高的應(yīng)用價(jià)值，解決了傳統(tǒng)技術(shù)存在的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、結(jié)果重復(fù)性差等技術(shù)問(wèn)題，用本發(fā)明所述芯片進(jìn)行大眾人群的體檢和臨床診斷省時(shí)、省力、簡(jiǎn)便、快速，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102863530SQ20121036338
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者李彬 申請(qǐng)人:李彬